혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
적절한 신경계 발달에는 혈액-뇌 장벽의 형성, 신경계에 대한 접근을 엄격하게 조절하고 신경 조직을 독소와 병원체로부터 보호하는 확산 장벽이 포함됩니다. 이 장벽의 형성에 있는 결점은 신경병증과 상관되었습니다, 이 방벽의 고장은 많은 신경 퇴행성 질병에서 관찰되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 혈액 두뇌 방벽의 대형 그리고 정비를 통제하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자가 신경 발달에서 하는 정확한 역할을 이해하기 위하여는, 혈액 두뇌 방벽의 무결성에 변경된 유전자 발현의 효력을 분석할 필요가 있습니다. 혈액-뇌 장벽의 확립에서 기능하는 많은 분자는 과일 파리, 초파리 멜라노가스터를포함한 진핵 종에 걸쳐 보존되는 것으로 밝혀졌다. 과일 파리는 신경계 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 검사하기위한 훌륭한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 발달의 배아 및 애벌레 단계 도중 혈액 두뇌 방벽 무결성을 위한 분석하는 단계별 절차를 기술합니다.
서론
개발 하는 동안, 세포-세포 통신 및 상호 작용 조직 및 장기 구조 및 기능의 설립에 대 한 중요 한. 경우에 따라, 이러한 세포-세포 상호 작용 적절 한 장기 기능을 보장 하기 위해 주변 환경에서 장기를 밀봉. 이것은 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 절연된 신경계의 경우입니다. 인간에서 BBB의 기능 장애는 간질을 포함한 신경 질환에 연결되었으며, 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 관찰되었다1. 포유동물에서, BBB는 내피 세포2,3사이 단단한 접합에 의해 형성된다. 과일 플라이, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한 다른 동물들은 신경교 세포로 구성된 BBB를 갖는다. 이러한 신경교 세포는 영양분, 노폐물, 독소 및 신경계 안팎으로 큰 분자의 움직임을 제어하기 위해 선택적으로 투과성 장벽을 형성한다4. 이를 통해 동작 전위를 발사하는 데 필요한 전기 화학 그라데이션의 유지 보수가 가능하여 이동성 및 조정4. D. 멜라노가스터에서,glia는 칼륨이 풍부하고 혈액과 같은 혈림프
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프로토콜
1. 견본의 수집
- 배아 수집
- 각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23.
참고: 더 많은 파리를 사용할 수 있지만, 여성 대 남성 비율은 2:1로 유지되어야 합니다. - 미리 따뜻한 사과 주스 한천 접시(표 1)25 °C에서 하룻밤.
참고: 이것은 배아의 적당한 발판을 위해 요구됩니다. 플레이트가 빨리 건조되는 경우, 챔버의 습도를 높이기 위해 인큐베이터에 물이 있는 그릇을 추가합니다. - 마취는 CO2를 사용하여 1.1.1 단계에서 파리를 옮기고 수집 케이지로 이동합니다. 미리 데운 사과 주스 한천 접시를 열린 끝에 효모 페이스트의 작은 얼룩이있는 것으로 놓고 빨간 슬리브(재료 표)로케이지에 고정하십시오. 오래된 배아를 치우기 위해, 파리가 25°C에서 1시간 동안 사과 주스 한천 접시에 배아/알을 낳도록 하십시오. ....
- 각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23.
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결과
여기서 기재된 방법은 D. 멜라노가스터 배아 및 유충에서 CNS 전반에 걸쳐 BBB의 무결성의 가시화를 허용한다(도1). 늦은 배아 발생에서 BBB 형성이 완료되면, BBB는 뇌와 VNC5에서큰 분자를 배제하는 기능을 한다. 이 프로토콜은 BBB 형성을 분석하기 위해 이 기능을 활용합니다. 야생형(Oregon R) 후반기 17(20-21시간) 배아를 설포호다민 101산염료로 공액처리한 10 kDa dextran 컨쥬게이션을 주입했을 때, 대덱렌 분자는 예상대로 VNC에서 제외되었다(도2A). BBB 무결성에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 입증하기 위해, 원시 유전자에 돌연변이가 있는 배아를 활용하였다. 이전에는, 원시 유전자는 배아 발생 동안 배아 밴드 후퇴를 조절하는 것으로 입증되었으며, 최근에는 발달.......
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토론
이 프로토콜은 D. 멜라노가스터 발달의 후기 배아 및 제3 의 유충 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적인 설명을 제공한다. 유사한 접근법은 성인5, 7,29,30뿐만아니라 개발 중에 BBB의 무결성을 분석하기 위해 다른 곳에서 기술되었다. 그러나 재료 및 방법 섹션의 절차에 대한 설명은 종종 본질적으로 광범위하며 쉽게 구현할 수 있는 충분한 세부 사항이 부족하여 연구원을 대신하여 중요한 문제 해결이 필요합니다. 이 프로토콜은 배아 및 애벌레 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적 인 설명을 제공합니다. 각 단계에서 올바른 개발 단계가 검사되고 조직 아키텍처가 중단되지 않도록 하기 위해 따라야 할 중요한 단계가 있으며 BBB를 손상.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 주입을 위한 장비의 사용을 위한 박사 F. 브라이언 피켓 과 박사 로드니 데일 감사합니다. 이 작품은 로욜라 대학 시카고에서 M.D., D.T., J.J.에 연구 자금으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran은 25 mg/mL의 농도로 고압멸균 ddH2O에 희석해야 합니다. |
| 20 &뮤; L 젤 로딩 피펫 팁 | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose Fisher Scientific | BP160-500 | ||
| 공기 압축기 | DeWalt | D55140 | |
| 사과 주스 | Mott의 천연 사과 주스 | ||
| 표백제 | 가정용 표백제 | 1-5% 차아염소산 | |
| 염 붕규산 유리 모세 혈관 | 세계 정밀 기기 | 1B100F-4 | |
| 병 플러그 | Fisher Scientific | AS-277 | |
| 세포 여과기 | BD Falcon | 352350 | |
| 컨포칼 현미경 | 20x 대물렌즈(UPlanSApo 20x/ 0.75) | ||
| 양면 테이프 1/2" | 스카치 | ||
| 듀몬트 핀셋을 사용하여 이미징한 Olympus FV1000 샘플; 패턴 #5; .05 x .01 mm 팁 | Roboz | RS-5015 | |
| 플라이 푸드 병 | Fisher Scientific | AS-355 | |
| 플라이 푸드 바이알 | Fisher Scientific | AS-515 | |
| 풋 페달 | 트레드라이트 II | T-91-S | |
| 젤 캐스터 | Bio-Rad | 1704422 | |
| 젤 트레이 | Bio-Rad | 1704436 | |
| 유리 피펫 | VWR | 14673-010 | |
| 글리세롤 | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| 과립 설탕 | 식료품점에서 구입했습니다. | ||
| 할로 카본 오일 | 랩 사이언티픽, Inc. | FLY-7000 | |
| 광원 | Schott | Ace I | |
| 매니퓰레이터 스탠드 | 세계 정밀 기기 | M10 | |
| 마이크로 매니퓰레이터 | 세계 정밀 기기 | KITE-R | |
| 마이크로 피펫 풀러 | 셔터 기기 (주) | P-97 | |
| 바늘 홀더 | 세계 정밀 기기 | MPH310 | |
| 밤바다 필터 세트 | 전자 현미경 과학 | SFA-LFS-CY | YFP |
| 밤바다 전체 어댑터 시스템 w/ 로얄 블루 컬러 라이트 헤드 | 전자 현미경 과학 | SFA-RB | GFP |
| 페인트 브러시 | 시각화 용 Simply Simmons | Chisel Blender # 6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| 공압 펌프 | 세계 정밀 기기 | PV830 | 이것은 마이크로 인젝터 또는 압력 레귤레이터라고도 합니다. 본 연구에서 사용된 모델은 더 이상 사용할 수 없기 때문에 이것이 하나의 대안입니다. |
| 염화칼 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| 인산칼륨 이염기성 | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| 소형 배아 수집 케이지 | Genesee Scientific | 59-100 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 인산나트륨 이염기성 무수 | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| 스틸베이스 플레이트 | 세계 정밀 기기 | 5052 | |
| 실체 현미경 | Carl Zeiss | Stemi 2000 | 조직 해부에 사용됩니다. |
| 투과 광원을 이용한 실체현미경 | Baytronix | 사출에 사용됩니다. | |
| Tegosept(p-하이드록시벤조산, 메틸 에스테르) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 비이온성 계면활성제 |
| 바이알 플러그 | Fisher Scientific | AS-273 |
참고문헌
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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