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방법 논문

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60233

⸱

2019년 9월 18일

 ,  , 
1Department of Biology, Loyola University Chicago

이 논문에서

요약

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초록

적절한 신경계 발달에는 혈액-뇌 장벽의 형성, 신경계에 대한 접근을 엄격하게 조절하고 신경 조직을 독소와 병원체로부터 보호하는 확산 장벽이 포함됩니다. 이 장벽의 형성에 있는 결점은 신경병증과 상관되었습니다, 이 방벽의 고장은 많은 신경 퇴행성 질병에서 관찰되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 혈액 두뇌 방벽의 대형 그리고 정비를 통제하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자가 신경 발달에서 하는 정확한 역할을 이해하기 위하여는, 혈액 두뇌 방벽의 무결성에 변경된 유전자 발현의 효력을 분석할 필요가 있습니다. 혈액-뇌 장벽의 확립에서 기능하는 많은 분자는 과일 파리, 초파리 멜라노가스터를포함한 진핵 종에 걸쳐 보존되는 것으로 밝혀졌다. 과일 파리는 신경계 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 검사하기위한 훌륭한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 발달의 배아 및 애벌레 단계 도중 혈액 두뇌 방벽 무결성을 위한 분석하는 단계별 절차를 기술합니다.

서론

개발 하는 동안, 세포-세포 통신 및 상호 작용 조직 및 장기 구조 및 기능의 설립에 대 한 중요 한. 경우에 따라, 이러한 세포-세포 상호 작용 적절 한 장기 기능을 보장 하기 위해 주변 환경에서 장기를 밀봉. 이것은 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 절연된 신경계의 경우입니다. 인간에서 BBB의 기능 장애는 간질을 포함한 신경 질환에 연결되었으며, 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 관찰되었다1. 포유동물에서, BBB는 내피 세포2,3사이 단단한 접합에 의해 형성된다. 과일 플라이, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한 다른 동물들은 신경교 세포로 구성된 BBB를 갖는다. 이러한 신경교 세포는 영양분, 노폐물, 독소 및 신경계 안팎으로 큰 분자의 움직임을 제어하기 위해 선택적으로 투과성 장벽을 형성한다4. 이를 통해 동작 전위를 발사하는 데 필요한 전기 화학 그라데이션의 유지 보수가 가능하여 이동성 및 조정4. D. 멜라노가스터에서,glia는 칼륨이 풍부하고 혈액과 같은 혈림프5에서신경계를 보호합니다.

D. melanogaster의중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS), 2 개의 외부 신경교 층, subperineurial glia 및 perineurial glia, 외세포 질, 신경 라멜라의 외부 네트워크, 형성 hemolymph-뇌 및 hemolymph 신경 장벽6,이 문서 전반에 걸쳐 BBB라고. 개발 중 피각증 신경교는 polyploid되고 신경계를 둘러싸고 확대5,6,7,8,9,10,11 . 헤모 림프와 신경계 사이의 주요 확산 장벽을 제공하는 심층 신경 교향곡 형태5,6,12. 이러한 접합부는 척추동물에서 골수성 신경교의 파라노드에서 발견되는 격막과 유사한 접합부와 분자적으로 유사하며, 포유류13,14의BBB에서 단단한 접합부와 동일한 기능을 수행합니다. 15세 , 16세 , 17. 대사 산물과 큰 분자의 확산을 조절하기 위해 회음구 신경교를 나누고, 성장시키고, 감싸는6,10,18,19. BBB 형성은 25 °C5,8에서계란 누워 (AEL) 후 18.5 시간에 의해 완료된다. 이전 연구는 BBB형성20,21,22의중요한 조절자인 유전자를 확인했습니다. 이 유전자의 정확한 역할을 더 잘 이해하기 위하여는, BBB 무결성에 이 잠재적인 기계레이터의 돌연변이의 효력을 검토하는 것이 중요합니다. 이전 연구는 배아와 애벌레에 있는 BBB 무결성을 분석하기 위한 접근을 설명하는 동안, 이 분석법을 위한 포괄적인 프로토콜은 아직5,7을기술되지않았습니다. 이 단계별 프로토콜은 D. melanogaster 배아 및 제 3 instar 애벌레 단계 도중 BBB 무결성을 분석하는 방법을 기술합니다.

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프로토콜

1. 견본의 수집

  1. 배아 수집
    1. 각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23.
      참고: 더 많은 파리를 사용할 수 있지만, 여성 대 남성 비율은 2:1로 유지되어야 합니다.
    2. 미리 따뜻한 사과 주스 한천 접시(표 1)25 °C에서 하룻밤.
      참고: 이것은 배아의 적당한 발판을 위해 요구됩니다. 플레이트가 빨리 건조되는 경우, 챔버의 습도를 높이기 위해 인큐베이터에 물이 있는 그릇을 추가합니다.
    3. 마취는 CO2를 사용하여 1.1.1 단계에서 파리를 옮기고 수집 케이지로 이동합니다. 미리 데운 사과 주스 한천 접시를 열린 끝에 효모 페이스트의 작은 얼룩이있는 것으로 놓고 빨간 슬리브(재료 표)로케이지에 고정하십시오. 오래된 배아를 치우기 위해, 파리가 25°C에서 1시간 동안 사과 주스 한천 접시에 배아/알을 낳도록 하십시오.
    4. 인큐베이터에서 수집 케이지를 제거합니다. 케이지 메시 측면을 아래로 반전하고 탭하여 케이지 의 맨 아래로 날아갑니다. 사과 주스 한천을 새로운 미리 데운 사과 주스 한천 접시로 작은 효모 페이스트 얼룩으로 교체하십시오. 첫 번째 접시를 버리십시오.
    5. 파리가 25°C에서 1시간 동안 새로운 사과 주스 한천 접시에 배아/계란을 놓을 수 있도록 하십시오. 1 시간 수집 다음이 판을 폐기하고 주사를 위한 배아를 수집하는 다음 단계로 진행한다.
    6. 늦은 단계 17 배아 (20-21 h AEL)를 수집하려면, 단계 1.1-1.1.5에서 원하는 유전자형의 파리가 25 °C에 대한 1 시간 동안 1시간 동안 15 °C에 효모 페이스트의 작은 얼룩으로 새로운 미리 온난 사과 주스 한천 접시에 누워 있도록 25 °C 인큐베이터에서 19 시간 동안 나이 플레이트 , 그래서 배아는 이미징 시 20-21 세가 될 것입니다.
      참고: 이 단계는 샘플 수집, 주입 및 이미징의 여러 라운드에 대해 원하는대로 반복될 수 있습니다.
    7. 0.1% 난온 계면활성제(PBTx)와 인산완충식염수(PBS)를 첨가하여 70 μm 나일론 메쉬를 가진 세포 스트레이너로 배아를 수집; 표 1) 페인트 브러시를 사용하여 접시의 표면을 덮고 표면에서 배아를 느슨하게합니다.
    8. 세포 스트레이너에서 수집된 배아를 50% 표백액(표1)에서100 mm 페트리 접시에 실온에서 가끔 교반하여 5분 동안. 페트리 접시에 PBTx에서 세포 스트레이너를 소용돌이치면서 배아를 3배 헹구고, 매번 PBTx의 신선한 접시를 사용한다.
    9. 모든 배아가 올바른 유전자형인 경우, 1.1.10 단계로 직접 진행하십시오. 올바른 유전자형의 배아생성이 헤테로지구스 플라이와 의한 십자가를 필요로 하는 경우, 형광성으로 표시된 밸런서 염색체의 존재 또는 부재를 사용하여 올바른 유전자형의 배아를 선택한다. 유전자형 선택을 위해 형광 기능이 있는 입체 현미경을 사용합니다.
      참고: 변형-노란색 형광 단백질로 표시된 균형 염색체; 크루펠-Gal4, UAS-녹색 형광 단백질 (GFP); 및 트위스트-Gal4, UAS-GFP는 후기 배아 발생에서 유전자형 선택에 잘 작용한다(표 2)24,25,26.
    10. 유리 피펫을 사용하여, PBTx에서 배아를 2% 아가로즈 겔 슬래브로 이송한다(표1). 여과지로 여분의 액체를 제거합니다. ~6~8개의 배아를 2% 아가로즈 젤 슬래브에 우측 후방과 등쪽 측면을 향하게합니다(그림 1B).
      참고: 정자가 난자를 입력하는 작은 구멍인 마이크로필은 배아의 앞쪽 끝에 있습니다. 후방 끝이 더 둥글게 됩니다. 기관은 하얗게 나타나고 배아에 등쪽으로 위치하며, 배아의 등쪽과 복부 측의 구별을 허용합니다(그림 1B).
    11. 양면 테이프로 슬라이드를 준비합니다. 배아 위에 있는 슬라이드를 단단히 눌러 양면 테이프로 옮김을 옮니다.
    12. 실온에서 배양하여 배아를 ~25 분 동안 배아를 건조합니다 (건조제는 사용되지 않습니다). 탈수 후, 할로카본 오일로 배아를 덮습니다.
      참고: 탈수 기간은 실내의 온도, 습도 및 환기에 따라 다를 수 있습니다. 잠복기는 본 프로토콜의 섹션 2 및 3에 기재된 바와 같이, 주사및 화상진상을 위한 공초점 현미경을 위한 장치를 설치하기 위하여 이용되어야 한다.
  2. 애벌레 컬렉션
    1. 원하는 유전자형의 5-10 처녀 암컷 파리와 옥수수 가루 한천 음식과 유리병에 원하는 유전자형의 절반 많은 수컷과 십자가를 설정하고 25 °C23에서배양.
    2. 5-7 일 후, 유전자형에 따라, 집게로 부드럽게 유리병에서 방황 세 번째 instar 애벌레를 수집합니다. 1x PBS에서 애벌레를 헹구어 애벌레에 붙어있는 음식을 제거합니다. 필요한 경우 1.1.9단계에서 설명한 바와 같이 유충을 사과 주스 한천 플레이트에 옮기고, 지질질형에 대한 유충을 옮김을 한다.
    3. 페인트 브러시를 사용하여 티슈에 애벌레를 굴려 말립니다. 포셉을 사용하여 양면 테이프로 제조 된 슬라이드에 6−8 애벌레를 옮니다.

2. 바늘 및 견본 주입의 준비

  1. 이 프로토콜이 시작되기 전에 마이크로파이펫 풀러에 바늘을 당깁니다. 모세관을 바늘 풀러에 고정시키고 D. 멜라노가스터 주사에 대한 표준 바늘 모양 및 매개 변수에 따라 당기십시오(표 3)27. 주사를 위해 사용할 때까지 점토에 고정하여 페트리 접시에 바늘을 저장합니다.
  2. 10 kDa dextran 컨쥬게이션 101 산염화물(재료 표)에5 μL의 바늘을 적재하는 것은 배아에 대한 25 분 탈수 기간 동안 20 μL 겔 로딩 파이펫 팁을 사용하여 (단계 1.1.12), 또는 즉시 이송 후 슬라이드에 애벌레 (단계 1.2.3).
  3. 바늘을 바늘 홀더에 넣고 강철 베이스에 고정된 마이크로 매니퓰레이터에 넣습니다(재료표).
    참고: 바늘은 배아 주입을 위한 현미경 단계에 거의 평행해야 하고 애벌레 주입을 위해 약간 아래쪽으로 각이 있어야 합니다.
  4. 사출장치(재료 표)를50psi, 5-10 ms의 범위로 10으로 설정합니다.
    참고: 사용 중인 특정 주입 장치에 대해 이러한 설정을 변경해야 할 수도 있습니다.
  5. 슬라이드를 스테이지에 놓고 바늘 가장자리를 양면 테이프의 가장자리에 45° 각도로 놓아 각진 깨진 팁을 만듭니다.
    참고: 배아의 경우 10 kDa dextran의 흐름을 허용하기에 충분한 팁을 깰 필요가 있습니다. 완벽한 바늘은 약간 각진 팁을 가지고 있으며 각 주사와 함께 염료의 작은 방울만 나올 것입니다. 애벌레의 경우, 팁을 더 깰 필요가 있지만, 애벌레 몸 벽을 관통하기 위해 각진 팁. 더 큰 염료 한 방울이 나올 것입니다.
  6. 염료가 바늘 끝에 놓일 때까지 풋 페달을 펌프합니다.
  7. 바늘을 정렬하여 배아와 평행하거나 애벌레쪽으로 약간 아래쪽으로 기울어져 있습니다.
  8. 바늘을 움직여 시편의 후방 끝을 뚫고 발 페달을 펌핑하여 시편을 주입합니다. ~2 nL의 염료를 배아에 주입하고, ~220 nL의 염료를 애벌레에 주입합니다.
    참고: 주사가 성공하면 배아 또는 유충이 염료로 범람해야합니다.
  9. 배양 목적을 위해 주사 시간을 기록하십시오. 실온에서 10 분 동안 배아를 배양하십시오. 실온에서 30 분 동안 유충을 배양하십시오.
  10. 슬라이드를 계속 내려가 각 시편에 대한 주입 시간을 지적하면서 추가 시편을 주입합니다.
    참고: 후속 해부 및 이미징 단계를 수행할 수 있는 속도에 따라 4−8 개의 시편을 한 번에 주입할 수 있습니다.

3. 화상 진찰을 위한 견본의 준비

  1. 배아의 화상 진찰
    1. 주입 다음, 화상 진찰을 위한 태아를 준비하십시오. 커버슬립을 배치할 때 배아의 손상을 방지하기 위해 슬라이드에 있는 샘플의 오른쪽과 왼쪽에 면팁 어플리케이터를 사용하여 석유 젤리를 스페이서로 바하십시오.
    2. 20배 의 객관적인 배아의 깊이 전반에 걸쳐 공초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플. 다음 방정식을 사용하여 복부 신경 코드 (VNC)에서 관찰 된 염료를 가진 총 샘플의 비율을 계산합니다 : 손상된 BBB가있는 샘플의 % = 분석 된 VNC / 총 샘플 수에 염료 축적이있는 샘플 수.
  2. 유충의 해부 및 화상 진찰
    1. 애벌레 샘플에 대한 슬라이드를 미리 준비합니다. 두 개의 커버를 장착하면 약 0.5 cm 간격으로 미끄럼에 매니큐어를 장착 합니다.
      참고: 커버립은 뇌의 스페이서 역할을 하므로 장착 과정에서 손상되지 않습니다.
    2. 30 분 배양 후, 이미징에 사용되는 슬라이드에 직접 1 x PBS에 애벌레를 해부. 첫째, 한 쌍의 포셉을 사용하여 애벌레 몸의 중간쯤에 애벌레를 잡고 두 번째 쌍의 집게를 사용하여 애벌레의 전방 및 후방 절반을 분리합니다.
    3. 다음으로, 한 쌍의 포셉을 사용하여 입 후크의 전방 영역을 잡고 두 번째 포셉 쌍을 사용하여 입 후크를 잡는 집게의 끝 위로 몸벽을 반전시다. 뇌와 VNC가 노출됩니다.
    4. 신경을 분리하여 신체 벽에서 뇌와 VNC를 분리하고 슬라이드에서 신체 벽을 제거합니다(그림 1C,D). 원하는 경우 가상 디스크를 제거합니다.
    5. 80% 글리세롤의 10 μL로 견본을 덮고 화상 진찰을 위한 견본의 위에 덮개를 놓습니다.
    6. 20배 의 목적을 이용하여 신경계 조직의 깊이를 통한 영상. VNC에서 관찰된 염료를 사용하여 총 샘플의 백분율을 계산합니다.

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결과

여기서 기재된 방법은 D. 멜라노가스터 배아 및 유충에서 CNS 전반에 걸쳐 BBB의 무결성의 가시화를 허용한다(도1). 늦은 배아 발생에서 BBB 형성이 완료되면, BBB는 뇌와 VNC5에서큰 분자를 배제하는 기능을 한다. 이 프로토콜은 BBB 형성을 분석하기 위해 이 기능을 활용합니다. 야생형(Oregon R) 후반기 17(20-21시간) 배아를 설포호다민 101산염료로 공액처리한 10 kDa dextran 컨쥬게이션을 주입했을 때, 대덱렌 분자는 예상대로 VNC에서 제외되었다(도2A). BBB 무결성에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 입증하기 위해, 원시 유전자에 돌연변이가 있는 배아를 활용하였다. 이전에는, 원시 유전자는 배아 발생 동안 배아 밴드 후퇴를 조절하는 것으로 입증되었으며, 최근에는 발달...

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토론

이 프로토콜은 D. 멜라노가스터 발달의 후기 배아 및 제3 의 유충 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적인 설명을 제공한다. 유사한 접근법은 성인5, 7,29,30뿐만아니라 개발 중에 BBB의 무결성을 분석하기 위해 다른 곳에서 기술되었다. 그러나 재료 및 방법 섹션의 절차에 대한 설명은 종종 본질적으로 광범위하며 쉽게 구현할 수 있는 충분한 세부 사항이 부족하여 연구원을 대신하여 중요한 문제 해결이 필요합니다. 이 프로토콜은 배아 및 애벌레 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적 인 설명을 제공합니다. 각 단계에서 올바른 개발 단계가 검사되고 조직 아키텍처가 중단되지 않도록 하기 위해 따라야 할 중요한 단계가 있으며 BBB를 손상...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 주입을 위한 장비의 사용을 위한 박사 F. 브라이언 피켓 과 박사 로드니 데일 감사합니다. 이 작품은 로욜라 대학 시카고에서 M.D., D.T., J.J.에 연구 자금으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) DextranThermoFisher ScientificD1863Dextran은 25 mg/mL의 농도로 고압멸균 ddH2O에 희석해야 합니다.
20 &뮤; L 젤 로딩 피펫 팁Eppendorf22351656
100% Ethanol (200 proof)Pharmco-Aaper11000200
Active Dry YeastRed Star
AgarFisher ScientificBP1423
Agarose Fisher ScientificBP160-500
공기 압축기DeWaltD55140
사과 주스Mott의 천연 사과 주스
표백제가정용 표백제1-5% 차아염소산
염 붕규산 유리 모세 혈관세계 정밀 기기1B100F-4
병 플러그Fisher ScientificAS-277
세포 여과기BD Falcon352350
컨포칼 현미경20x 대물렌즈(UPlanSApo 20x/ 0.75)
양면 테이프 1/2"스카치
듀몬트 핀셋을 사용하여 이미징한 Olympus FV1000 샘플; 패턴 #5; .05 x .01 mm 팁RobozRS-5015
플라이 푸드 병Fisher ScientificAS-355
플라이 푸드 바이알Fisher ScientificAS-515
풋 페달트레드라이트 IIT-91-S
젤 캐스터Bio-Rad1704422
젤 트레이Bio-Rad1704436
유리 피펫VWR14673-010
글리세롤Fisher ScientificBP229-1
과립 설탕식료품점에서 구입했습니다.
할로 카본 오일랩 사이언티픽, Inc.FLY-7000
광원SchottAce I
매니퓰레이터 스탠드세계 정밀 기기M10
마이크로 매니퓰레이터세계 정밀 기기KITE-R
마이크로 피펫 풀러셔터 기기 (주)P-97
바늘 홀더세계 정밀 기기MPH310
밤바다 필터 세트전자 현미경 과학SFA-LFS-CYYFP
밤바다 전체 어댑터 시스템 w/ 로얄 블루 컬러 라이트 헤드전자 현미경 과학SFA-RBGFP
페인트 브러시시각화 용 Simply SimmonsChisel Blender # 6
PipetterFisher Scientific13-683C
공압 펌프세계 정밀 기기PV830이것은 마이크로 인젝터 또는 압력 레귤레이터라고도 합니다. 본 연구에서 사용된 모델은 더 이상 사용할 수 없기 때문에 이것이 하나의 대안입니다.
염화칼Fisher ScientificBP366-500
인산칼륨 이염기성Fisher ScientificBP363-500
소형 배아 수집 케이지Genesee Scientific59-100
염화나트륨Fisher ScientificBP358-212
인산나트륨 이염기성 무수Fisher ScientificBP332-500
스틸베이스 플레이트세계 정밀 기기5052
실체 현미경Carl ZeissStemi 2000조직 해부에 사용됩니다.
투과 광원을 이용한 실체현미경Baytronix사출에 사용됩니다.
Tegosept(p-하이드록시벤조산, 메틸 에스테르)Genesee Scientific20-258
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500비이온성 계면활성제
바이알 플러그Fisher ScientificAS-273
면 팁 애플리케이터, Puritan 19-062614 륨

참고문헌

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