조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조혈 줄기 전구 세포 (HSPC)는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다 뚜렷한 대사 가소성을 가지고있다. 그러나 HSPC의 대사 상태(미토콘드리아 호흡 및 당해 용해)는 제한된 수와 비부착성, 깨지기 쉬운 HSPC에 대한 최적화된 프로토콜의 부족으로 인해 분석하기가 어려웠습니다. 여기에서, 우리는 신진 대사 호흡을 측정하기 위하여 명확한, 단계별 지침의 세트를 제공합니다 (산소 소비 비율; OCR) 및 당해(세포외 산성화 속도; Murine 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 ECAR) 이 프로토콜은 뮤린 골수에서 LSK HSPC의 높은 양을 제공하고, 배양 중 HSPC의 생존력을 향상시키고, 비 부착 HSPC의 세포 외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화 및 당해 경로를 표적으로 하는 약물에 최적화된 주사 프로토콜(농도 및 시간)을 제공합니다. 이 방법은 혈액 발달 및 질병 도중 HSPC의 신진 대사 상태 그리고 건강의 예측가능하게 합니다.
서론
대부분의 성숙한 혈액 세포의 수명이 짧기 때문에, 혈액의 항상성은 조혈 줄기 세포 (HSPC)의 장수하지만 희귀 한 집단의 자기 갱신 및 분화에 의존합니다1. HSPC는 정지, 하지만 그들은 증식 하 고 혈액 시스템의 요구를 유지 하기 위해 자극에 차별화를 겪고 신속. 각 HSPC 세포 상태는 독특한 생체 에너지 수요를 필요로하기 때문에, 신진 대사 변화는 HSPC 운명 결정의 주요 드라이버입니다. 따라서, 대사 가소성의 손실은, 정지, 자기 갱신 및 HSPC의 분화 사이의 평형을 변경함으로써, 종종 골수- 또는 림프증증성 장애로 이어집니다. 함께, HSPC 개발의 대사 조절의 이해는 혈액 학적 악성2,3,4,5의 근본적인 메커니즘을 발견하는 데 중요합니다.
미토콘드리아 호흡과 당해는 ATP를 생성하여 세포내 반응을 유도하고 거대분자 합성에 필요한 빌딩 블록을 생성합니다. HSPC는 분화 된 세포에 비해 낮은 미토콘드리아질량을 가지....
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프로토콜
이 프로토콜은 전국 어린이 병원 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜은 2 일의 기간에 걸쳐 연대순으로 설명된다. 아래 프로토콜에 설명된 대로 신선한 시약을 사용하십시오.
1. 분석 전날 시약 준비
-
센서 카트리지에 수분을 공급합니다.
- 비CO2 37°C 인큐베이터에서 교정제(재료표)의 5 mL을 밤새 인큐베이터한다.
- 플럭스 분석키트(재료 표)를열고 센서 카트리지(녹색; 위쪽)를 유틸리티 플레이트(투명; 하단)에서 분리합니다. 다음으로 센서 카트리지를 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트에 인접시됩니다.
- 멸균수를 사용하여 유틸리티 플레이트(200 μL)의 웰과 웰 주변의 챔버(400 μL)를 채웁니다.
- 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 담그면 센서가 물로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 3x를 누릅니다.
- 유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 비CO2 37°C 인큐베....
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결과
우리의 추출 방법은 우리가 마우스 당 ~ 80,000 LSK HSPC까지 수확 할 수 있었습니다. LSK 세포의 생존력과 수는 우리의 방법으로 향상되었다, 우리는 때문에: (1) 상지와 하부 사지에서 결합 된 골수, 엉덩이 뼈, 흉골, 늑골 케이지, 및 척추, (2) 세포 사멸과 응집 증가 했을 붉은 세포 용해 버퍼를 사용하여 피, (3) 단핵세포의 밀도 구배 배지 분리를 사용하고, (4) 덩어리에서 세포의 손실을 야기했을 사전 냉각 버퍼를 사용하여 피하였다.
세포 외 플럭스 분석은 전통적으로 부착 세포에 사용되었지만, 우물의 PLL 코팅의 우리의 사용, 그것에 세포의 원심 분리 에 이어, 우물의 표면에 LSK HSPC의 준수를 촉진. 이를 통해 우리는 세포외 플럭스를 측정할 수 있었고, 따라서 LSK HSPC의 대사 건강도를 측정할 수 있었습니다. 마우스로부터 수확할 수 있는 세포의 수가 제한되어 있고, 그들의 격리를 위한 프로토콜의 긴 기간을 고려할 때, 8개의 잘 포맷을 가.......
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토론
여기에서, 우리는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 순수하고 실행 가능한 뮤린 LSK HSPC 집단의 최대 양뿐만 아니라 그들의 당해 및 미토콘드리아 호흡의 측정의 격리를 보여줍니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 LSK HSPC의 사용에 대한 다음과 같은 기술적 문제를 극복한다 : i) murine 골수14에서LSK HSPC의 낮은 빈도, ii) LSK HSPC26의낮은 기저 대사 활성, iii) LSK HSPC27의취약성, iv) 배양혈관에LSK HSPC의 비 준수를 극복한다. 또한, 세포외 플럭스 어설법의 최적 성능을 위해 약물 농도 및 배지 조성을 최적화하였다.
골수 유래 HSPC는 저산소 틈새 에 상주하고 그들의 줄기의 유지보수에 중요한 당해 표현형을표시합니다 28.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 부분적으로 국립 보건원 (HL131645, CA016058), 세인트 볼드릭 재단 및 펠로토니아 재단의 자금 지원에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.01% (w/v) 폴리-L-라이신 용액 | Sigma | P8920 | LSK 첨부 |
| 파일 40 µ에 사용; m 세포 여과기 | Fisher Scientific | 22-363-547 | 뼈 분쇄 후 세포 여과에 사용 |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Lin-separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Lin-separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Lin-에 사용됩니다. 분리 |
| 비오틴 쥐 안티 마우스 CD8a 클론 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 린 분리에 사용 | |
| 오틴 쥐 안티 마우스 Ly-6G 및 Ly-6C 클론 RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | 린 분리에 사용 |
| 오틴 쥐 안티 마우스 TER-119 / 에리트로이드 세포 클론 TER-119 | BD Biosciences | 553672 | 린 분리에 사용 |
| CD117 (c-Kit) 단클론 항체 (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | LSK 분류에 사용 |
| Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브 | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | 세포 분리에 사용 |
| Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브 | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | 세포 분리에 사용 |
| Falcon 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브 | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | 에 사용 LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | FACS 완충액에 사용됨 |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | ficoll gradient 분리에 사용됨 |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | 분석 매체에 사용됨 |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Lin-separation |
| Ly-6A/E(Sca-1) 단클론성에 사용됨 항체 (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | LSK 분류에 사용 |
| 줄기 세포 인자 (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | 분석 매체에 사용 |
| 쥐 트롬보포이에틴 (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | 분석 매체 |
| PBS 1% | 에 사용됨 Fisher Scientific | SH3002802 | FACS 완충액에 사용됨 |
| 페니실린-스트렙토마이신( 10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | 분석 매체 |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | LSK 분류에 사용됨 |
| Seahorse XFp 세포 배양 Miniplate Agilent | Technologies | 103025-100 | LSK 파종에 사용됨 |
| 피루브산 나트륨(100mM) | ThermoFisher | 11360070 | 분석 매체 |
| Streptavidin eFluor 450에 사용됨 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | LSK 분류에 사용 |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | 카트리지 평형에 사용 |
| XF 매체 Agilent | Technologies | 103575-100 | 분석 매체에 사용 |
| XFp 해당작용 스트레스 테스트 키트 | Agilent Technologies | 103017100 | 해당작용 스트레스 테스트 |
| XFp 미토콘드리아 약물 스트레스 테스트 키트 | Agilent Technologies | 103010100 | 미토콘드리아 스트레스 테스트용 약물 |
| XFp 센서 카트리지 | Agilent Technologies | 103022-100 | 해당과정 및 미토콘드리아 스트레스 테스트에 사용 |
참고문헌
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
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