새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

Jeff Granhøj; Henrik Dimke; Per Svenningsen

doi:10.3791/60266

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방법 논문

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

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DOI:

10.3791/60266

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2019년 10월 3일

Jeff Granhøj¹ , Henrik Dimke¹^,² , Per Svenningsen¹

¹Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, ²Department of Nephrology, Odense University Hospital

이 논문에서

요약

여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

초록

비오틴은 단백질의 분리 및 검출을 위한 강력한 태그를 제공하는 단백질의 매력적인 번역 후 변형입니다. 대장균 바이오틴 단백질 리가제 BirA에 의한 효소 생물학적 인화는 매우 특이적이며 그들의 모국 환경에서 표적 단백질의 생체 이식을 허용합니다. 그러나, 현재 BirA 매개 생물항화의 사용은 표적 단백질에 합성 수용기 펩티드(AP)의 존재를 요구한다. 따라서, 그 적용은 AP를 포함하도록 설계된 단백질로 제한된다. 본 프로토콜의 목적은 수정되지 않은 표적 단백질로부터 유래된 펩타이드의 세균 디스플레이를 사용하여 펩티드를 바이오티엔화하는 BirA 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 세균 표면에 펩티드 디스플레이를 위한 스캐폴드와 함께 BirA 변이체의 공동 발현을 허용하는 단일 플라스미드를 기반으로 한다. 프로토콜은 디스플레이 스캐폴드 내로 표적 펩티드의 혼입, BirA 라이브러리의 생성, 활성 BirA 변이체의 선택 및 단리된 BirA 변이체의 초기 특성화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 이 방법은 복잡한 용액에서 기본 단백질을 바이오티엔화하는 비오틴 단백질 리가제의 추가 적인 진화에 사용될 수 있는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 매우 효과적인 선택 시스템을 제공한다.

서론

단백질의 생체 화는 친화성 격리 및 검출을위한 강력한 태그를 만듭니다. 효소 단백질 생물항화는 비오틴 단백질 리가제에 의해 촉매작용된 고도로 특이적인 번역 후 변형이다. 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA는 매우 특이적이고 공유성 바이오티니레이트는 특정 리신 잔기에서 자연적으로 발생하는 단백질의 제한된 수에^{불과합니다 1.} BirA 촉매 생물항화의 장점은 현재 표적 단백질을 작은 합성 15-아미노산 비오틴 수용기 펩타이드(AP)와 융합하여 효과적으로 생체티니레이팅^2를 허용하고, 고도로 특이적이고 비라^3,^4,^5의공동 발현 또는 첨가에 의한 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생물학적 인 효율적. 생체 내 및 시험관 내 BirA 촉매 비오틴 단백질 결찰은 매력적인 라벨링 전략이지만, 그 적용은 AP 융합 단백질을 포함하는 샘플로 제한된다. 이 방법의 목적은 선택적으로 네이티브 변형되지 않은 단백질을 생물항화하는 비오틴 단백질 리가제의 새로운 돌연변이체의 개발이며, 이....