공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

요약

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.

초록

곰팡이 와 세균성 세포로 구성된 크로스 킹덤 생물막은 엔도돈증 감염, 치주염, 점막 감염 및 특히 어린 시절 충치와 같은 다양한 구강 질환에 관여합니다. 이러한 모든 조건에서, 생물막 매트릭스내의 pH는 미생물-숙주 상호작용 및 따라서 질병 진행에 영향을 미친다. 본 프로토콜은 칸디다 알비칸스 및 연쇄상 구균 뮤탄을 포함하는 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 역학을 모니터링하는 공초점 현미경 기반 방법을 기술한다. pH 의존적 이중 방출 스펙트럼 및 비메트릭 프로브 C-SNARF-4의 염색 특성은 생물막의 세포외 영역에서 pH의 하락을 결정하기 위해 이용된다. 프로브와 pH 비율 측정을 사용하려면 이미징 매개 변수의 세심한 선택, 염료의 철저한 교정, 이미지 데이터의 신중한 임계값 기반 사후 처리가 필요합니다. 올바르게 사용될 때, 기술은 생물막의 다른 지역에 있는 세포외 pH의 급속한 평가를 허용하고 따라서 시간 지남에 따라 수평 및 수직 pH 구배 둘 다의 감시를 허용합니다. 공초점 현미경 검사법의 사용은 Z 프로파일링을 75 μm 이하의 얇은 바이오필름으로 제한하지만, pH 비율 측정법의 사용은 왕국 간 생물막에서 중요한 독성 계수의 비침습적 연구에 이상적입니다.

서론

곰팡이와 세균성 종을 모두 포함하는 크로스 킹덤 생물막은 구강내 여러 병리학 적 조건에 관여합니다. 칸디다 spp. 빈번 하 게 에서 분리 된 endodontic 감염¹ 그리고 치 주 변 병 변에서^2,3. 점막 감염에서, 기염 단에서 연쇄상 구균 종은 시험관 내 및 murine 모형^4,5,6,7둘 다에 있는 곰팡이 생물막 대형, 조직 침략 및 보급을 강화하기 위하여 보였습니다. 가장 흥미롭게도, 칸디다 종의 구강 마차는^어린이8에서 우식증의 보급과 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 설치류 모델에서 도시된 바와 같이, 연쇄상 구균 뮤탄스와 칸디다스 알비칸스 사이의 공생 관계는 세포외 다당류의 생산을 증가시키고 더 두껍고 더 많은 카리오제닉 생물막의 형성을 이끈다,

프로토콜

타액 수집프로토콜은 오르후스 카운티 윤리위원회(M-20100032)에 의해 검토및 승인되었습니다.

1. 크로스 킹덤 바이오필름 재배

1. S. 뮤탄스 DSM 20523 및 C. 알비칸스 NCPF 3179를 에어로빅 조건하에서 37°C에서 혈액 한천 플레이트에 성장시다.
2. 각 유기체의 단일 식민지를 뇌 심장 주입 (BHI)의 5 mL로 채워진 시험관으로 옮니다. 37 °C에서 에어로빅 조건하에서 18 시간 동안 자랍니다.
3. 1,200 x g에서 5 분 동안 하룻밤 배양. 상류를 버리고 생리식염수로 세포를 다시 중단하고 C. albicans (~ 10⁷ 세포 / mL) 및 S. 뮤탄 (~10⁸ 세포 / mL)에 대해 OD_{550 nm을} 0.5로 조정하십시오. S. 뮤탄스 현탁액을 멸균 생리식염수(~10 7세포/mL)로 희석합니다.
4. 피펫 50 μL의 멸균 침 액은, de Jong et al.^19의방법에 따라 제조되어, 현미경 검사법용 광학 바닥 96-웰 플레이트의 우물내로.....

결과

24 시간 및 48 시간 후, 우물 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. C. albicans는 필라멘트 성장의 다양한 정도를 보여주었고, S. 뮤탄은 높이가 최대 35 μm의 조밀 한 클러스터를 형성했습니다. 단일 세포 및 S. 뮤탄의 사슬은 곰팡이 하이페 주위에 그룹화되고, 큰 세포 간 공간은 볼륨감 있는 매트릭스의 존재를 나타냈다(도S1).

비대칭 염료의 보정은 비대칭 시그모이드 곡선^13,14를산출한다. 생물막에 있는 세포외 pH는 보기의 다른 현미경 필드에 있는 다른 비율로 포도당에 노출 후에 처음 5 분에서 빨리 떨어졌습니다. 그 후, 산성화는 둔화, 일반적으로 15 분 후 5.5-5.8의 값에 도달(그림 1). 복제 생물막.......

토론

C. 알비칸스 및 연쇄상 구균 spp를 포함하는 크로스 킹클크로스 킹에 대한 상이한 프로토콜은 이전에^{9,22,23,24,25를}기술되었다. 그러나, 현재설정은 단순 성장 조건, 정규 근무일과 호환되는 시간 일정, 균형 잡힌 종 조성 및 방대한 생물막 매트릭스 의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 96웰 플레이트는 어느 정도 접착의 경구 조건을 모방하기 위해 타액용액으로 코팅되었다.

C-SNARF-4를 이용한 pH 비측정법의 사용은 바이오필름 pH의 신속한 측정을 위한 저렴한 방법이며, 그 중 장점과 단점은^다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
혈액 한천 플레이트	Statens 혈청 Institut	677
뇌 심장 주입	Oxoid	CM1135
뇌 심장 주입 + 5 % 자당	BDH 실험실 용품	10274
칸디다 알비 칸스	국립 병원성 곰팡이 컬렉션	NCPF 3179
D-(+) - 포도	시그마 - 알드리치	G8270
Daime: 미생물 생태학의 디지털 이미지 분석	Universitä t Wien	N/A	프리웨어; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
소 태아 혈청	Gibco Life technologies	10270
GS-6R 냉장 원심분리기	Beckman	N/A
ImageJ	National Institutes of Health	N/A	프리웨어; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java	Oracle	해당 없음	ImageJ를 실행하는 데 필요한 프리웨어; V8.0; https://java.com/en/download
µ -Plate 96 Well Black	Ibidi	89626
MyCurveFit	MyAssays Ltd.	N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer	Bioworld	700728
PHM210 pH-meter	Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion	objective Zeiss	N/A	NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
멸균 생리식염수	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC	VWR	N/A
XL 인큐베이터	PeCON	N/A
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A

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