고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

요약

신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.

초록

암 연구의 약물 발견 및 개발은 점점 더 3D 형식으로 약물 스크린을 기반으로하고 있습니다. 암세포의 철새 및 침습적 잠재력을 표적으로 하는 새로운 억제제, 그리고 결과적으로 질병의 전이성 퍼짐은, gliomas와 같은 고침성 암에 있는 상보적인 처리로 발견되고 고려되고 있습니다. 따라서, 약물을 첨가한 후 3D 환경에서 세포의 상세한 분석을 가능하게 하는 데이터를 생성하는 것이 요구된다. 여기서 설명한 방법론은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 고해상도 이미지 캡처 및 데이터 분석과 스페로이드 침입 분석법을 결합하여 잠재적인 항철 억제제의 효과에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 했습니다. 신경교종 세포에 MI-192. 스페로이드는 낮은 부착 성 96 웰 플레이트에서 침략 분석세포주에서 생성된 다음 CLSM 분석을 위해 제조하였다. 설명된 워크플로우는 용이성과 재현성 모두로 인해 일반적으로 사용되는 다른 스페로이드 생성 기술보다 선호되었습니다. 이는 기존의 광시야 접근법에 비해 공초점 현미경 검사법에 의해 달성된 향상된 이미지 해상도와 결합하여 3D 환경에서 철새 세포의 뚜렷한 형태학적 변화를 식별하고 분석할 수 있었습니다. mi-192 의 제과약물로 치료할 수 있습니다.

서론

전임상 신약 발견 및 잠재적인 항암제 개발을 위한 3차원 스페로이드 기술이 기존의 약물 스크린보다 점점 더 선호되고 있다; 따라서, migrastatic의 더 많은 개발이있다 ―이주 및 침략 방지 - 마약. 암 치료에 있는 이 발달의 뒤에 근거는 분명합니다: 3D spheroid 어설아지는 세포 단층 배양 보다는 더 충실하게 3D 종양 건축을 모방하기 때문에 잠재적인 항암약을 검열을 위한 보다 현실적인 접근을 나타냅니다, 약물-종양 상호 작용(역학)을 보다 정확하게 재구성하고 종양 관련 설정에서 약물 활성의 특성화를 허용한다. 또한, 많은 암 유형에서 화학 독성 약물에 대한 내성의 증가와 암 세포가 먼 종양 부위로 이동하는 능력에 의해 전이에 의한 높은 사망률은 화학 요법 제의 포함을 뒷받침합니다. 향후 임상시험에서 보조치료제로 암세포의 철새전위를 표적으로^1. 이것은 고도로 침략적인 암에 있는, 고급 교모세포종 (GBM)와 같은 경우에 특히 입니다. GBM 관리에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함됩니다. 그러나, 조합 처리로조차, 대부분의 환자는 11-15 달^의중간 생존을 가진 초기 진단의 1 년 안에 재발^2,3. 3D 기술 분야의 거대한....

프로토콜

1. 세포 스페로이드의 생성

1일차

1. 조사 중인 세포주에서 요구하는 표준 배양 배지를 준비한다.
2. 멸균 처리 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 조직 배양 관련 단계를 수행합니다.
3. 트립시니화 하고 암 세포를 계산합니다. 플레이트당 20 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 셀 현탁액을 명확하게 라벨이 부착된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오.
4. 각 웰에 미리 정해진 수의 셀을 추가합니다. 필요한 세포의 초기 수와 궁극적인 스페로이드 크기는 조사중인 세포강의 증식 속도에 달려 있습니다.
   참고: U251 및 KNS42^9,10,5 x 10³ 세포/mL과 같은 확립된 신경교종 세포주들의 경우 4일간의 배양 후 현미경으로 보이는 스페로이드(200 또는 800 μm)를 생성합니다.
5. 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 범용 튜브의 세포를 다시 중단하십시오. 피펫 200 μL의 셀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰내로. 모든 웰이 필요하지 않은 경우 증발을 피하기 위해 각 빈 우....

결과

3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 스페로이드의 생성은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다; 낮은 준수 96 웰 플레이트는이 프로토콜에 사용되었다. 다른 제조업체의 여러 제품을 테스트 한 후, 여기에서 사용되는 플레이트는 성공적인 스페로이드 생산 및 균일성 측면에서 일관되게 최고의 성과를 보였기 때문에 선택되었습니다. 성장 배지가 콜라겐 매트릭스로 대체되는 대체 단계는 프로토콜의 중요한 점입니다. 세심한주의는 스페로이드 자체를 방해하지 않고 매체의 대부분을 제거하기 위해 주의해야합니다. 광시야 현미경 검사법에 의한 약물 유발 효과의 특성화를 위한 자동 이미징은 처리기 편향을 제거하는 것으로 간주될 수 있지만, 현재 시판되는 기기는 이미징 접근법보다 상당히 더 비쌉처리됩니다. 여기에 설명되어 있습니다.

토론

고분해능 공초점 현미경을 사용하여 경화약 활성을 식별하기 위한 암세포 스페로이드를 만드는 새로운 방법이 기술되어 있다. 매달려 방울^(15)과같은 다른 기술에 낮은 부착 플레이트의 사용은 콜라겐 이동 및 침략 검정에 사용하기 위해 재현 가능하고 균일 한 스페로이드를 생성하는 수단을 용이하게하고있다. 이 프로토콜의 중요한 점은 콜라겐 매트릭스에 세포 스페로이드가 포함되기 전에 96 웰 플레이트로부터 성장 배지를 제거하고 그 후 스페로이드를 함유하는 콜라겐 플러그를 주의 깊게 취급하는 것이다. 디지털 미세 유체 공학^16과 같은 새로운 기술을 사용할 수 있으며, 더 비싸지 만 미디어 및 유체의 수동 제거에 대한 대안을 제공 할 수 있습니다. 기술된 프로토콜의 주요 한계는 억제제 약물 활성을 평가하기 위해 단일 스페로이드를 이미지화한 다음 밝은 필드 현미경검사법에 의해 수동으로 분석할 때 시간이 많이 걸린다는 것입니다. 또한, 공정의 모든 단계에 필요한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 I, 쥐 꼬리,	Corning	354236	; 이는 많은 유통업체/제조업체에서 제공하며 의도한 분석 유형과 사용된 세포주 모두에 대해 결정해야 합니다. 신경교종 암 세포주의 경우 콜라겐 쥐꼬리 유형 1(예: Corning)이 선호되는 선택입니다. 콜라겐은 4 °에서 보관해야 합니다. C, 어둠 속에서, 필요할 때까지. 다른 배치의 콜라겐을 혼합하는 것은 중합된 콜라겐의 일관성에 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않습니다.
Coverslips,		현미경 검사, 화상 진찰을 위해
각종 각종 DMEM 분말	, 시그마	D5648	신경교종 침입 분석을 위한 교원질 해결책을 위한 5x 농도에 필요한;   이것은 이중 증류수로 구성된 분말 형태로 구입할 수 있으며 성장 매체의 최종 구성에 따라 필요한 첨가제로 완성 할 수 있습니다. 완전한 5x 용액은 주사기 필터 시스템(0.22 μ m) 사용하기 전에.
태아 송아지 혈청	Sigma	F7524-500ML	신경교종 세포주의 세포 배양에 필요
유리 슬라이드	현미경 이미징에		다양한
포도당 DMEM	Gibco	41965062	신경교종 세포주의 세포 배양에 필요
억제제	Tocris	다양한	다양 한 - 실험 설계에 따라; 억제제는 Selleckchem 및 Tocris와 같은 제조업체에서 구입할 수 있습니다. 이러한 제조업체는 억제제 특성에 대한 자세한 설명, 관련 참고 문헌에 대한 링크 및 작업 농도에 대한 제안을 제공합니다. 모든 억제제와 마찬가지로 잠재적으로 독성이 있을 수 있으므로 건강 및 안전 지침에 따라 취급해야 합니다. 억제제는 제조업체가 권장하는 원액으로 제조됩니다. 예를 들어, 우리는 이러한 억제제의 사용을 입증하기 위해 migrastatic 억제제 MI-192를 사용했습니다. 우리는 이러한 방식으로 다양한 편이중력 억제제를 테스트했으며 유사한 결과를 얻었습니다.
현미경 이미징을 위한	다양한		Mountant
NaOH (1 M)	다양한	다양한	NaOH는 필요한 몰 농도에서 구입하거나 고체 형태로 제조 할 수 있습니다. 준비된 용액은 주사기 필터 시스템을 사용하여 필터 멸균해야 합니다. One M NaOH는 부식성이 있으므로 용액 준비 중에 주의해야 합니다.
파라포름알데히드	스페로이드와 세포를 고정하기 위한 다양한 종류; 4%로 구성하며, 건강 위험을 주의하고, 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 대한 건강 및 안전 규정이 준수되도록 보장합니다
Pastettes (졸업 피펫, 3 mL)	는 침입 분석, 용액 제거
PBS, 조직 배양을 위한 sterile	Sigma	D1408-500ML	신경교종 세포주의 세포 배양에 필요 및 염색을 위한 세척
Pen/strep (항생제)	Sigma	P4333	신경교종 세포주의 세포 배양에 필요
1차 항체, 2차 항체, DAPI, Phalloidin	등	다양한	시약을 제조하고 있으며, 2차 표지 항체의 경우 Alexa Fluor(Molecular Probes)를 권장합니다. 여기에서는 1차 항체에 대해 마우스 항아세틸화 튜불린 항체(1/100, Abcam)를 사용했습니다. 2차 항체의 경우 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 복합 항체인 Molecular Probes를 사용했습니다. 핵 염색의 경우 DAPI(많은 제조업체)와 액틴 염색 Phalloidin(많은 제조업체)을 사용했으며, 둘 다 1/500의 권장 희석으로 사용되었습니다.
중탄산나트륨	Sigma	S5761	5배 농도의 신경교종 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 필요
피루브산 나트륨	Sigma	P5280	5배 농도의 신경교종 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 필요
신	Sigma	T4049	초
저 부착 플레이트	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	신경교종 침입 분석용; 낮은 접착성 플레이트가 필요하며, 조사 중인 화합물의 대규모 스크리닝을 허용하기 위해 96웰 플레이트가 선호됩니다. 상업적으로 이용 가능한 몇 가지 낮은 접착 플레이트가 있습니다. 최적의 스페로이드 생성을 위해 다양한 플레이트를 테스트하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 따르면 뚜껑이 있고 바닥이 둥근 Costar Ultra Low Cluster는 100% 스페로이드 형성 및 재현성 측면에서 신경교종 암세포에서 스페로이드 생성에 가장 적합합니다. 이 플레이트는 또한 우리 실험실에서 환자 유래 물질, 방광 및 난소암 세포에서 신경교종 스페로이드를 생성하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 줄기 또는 전구 신경구는 표준화 된 신경 구체 - 스페로이드
스트라이프 (혈청 학적 피펫, 멸균, 5 mL 및 10 mL)	(예 : Costar	CLS4488-50; 조직	배양 및 콜라겐 준비를 위한
다양한 다중 채널(50 - 250 μ L) 및 싱글채널 피펫(10 μ L, 50 μ L, 200 &뮤; L 1 mL)		세포 및 스페로이드 처리를 위한	다양한
와이드필드 현미경 다양	한		스페로이드 생성 및 스페로이드 이미징 관찰을 위해 다양함; 여기서는 EVOS FL 세포 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 광시야 형광 이미지를 캡처했습니다
Apochromat 63x 1.4 NA 오일 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 880 CLSM		컨	포칼 이미지는 Plan Apochromat 63x 1.4 NA 오일 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 880 CLSM을 사용하여 캡처했습니다. 다이오드 405nm, 458/488/514nm 아르곤 멀티라인 및 HeNe 594nm 레이저를 사용하여 각각 Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 및 DAPI를 여기시켰습니다. 각 이미지에 대해 하나의 대표적인 광학 섹션이 캡처되었으며, 사전 및 사후 이미지 캡처의 모든 설정은 비교 목적으로 유지되었습니다. 모든 이미지는 관련 Zen 이미징 소프트웨어 및 Adobe Photoshop을 사용하여 이후에 처리되었습니다.

신경교종 침입 분석을 위한 100mg , 고. 을 위해 다양하게 사용됩니다. 은 은 트립의 생성을 촉진하기 위해 이러한 플레이트에 사용될 수 있습니다 CLS4487-50. Plan