프로토콜은 맞춤형 광음향 흐름 시스템 및 표적 엽산 덮인 구리 황화물 나노 입자를 활용하여 순환 난소 종양 세포를 검출하기 위해 제시된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
많은 연구는 순환 종양 세포의 열거제안 (CTC) 난소 암에 대한 예후 도구로 약속을 표시 할 수 있습니다. CTC 검출을 위한 현재 전략에는 유세포 분석, 미세 유체 장치 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 포함됩니다. 최근의 발전에도 불구하고, 조기 난소암 전이를 검출하는 방법은 여전히 임상 번역에 필요한 민감도 및 특이성이 결여되어 있다. 여기서, 유동챔버 및 주사기 펌프를 포함하는 맞춤형 3차원(3D) 인쇄 시스템을 활용한 광음향 유동 세포분석(PAFC)에 의한 난소 순환 종양 세포의 검출을 위한 새로운 방법이 제시된다. 이 방법은 엽산으로 덮인 구리 황화물 나노 입자 (FA-CuS NPs)를 사용하여 PAFC에 의해 SKOV-3 난소 암 세포를 표적으로 합니다. 이 작품은 난소 암 세포를 위한 이 조영제의 친화성을 보여줍니다. 결과는 형광 현미경 검사법에 의하여 NP 특성, PAFC 탐지 및 NP 장악을 보여주고, 따라서 생리적으로 관련있는 농도에서 난소 CTC를 검출하는 이 새로운 시스템의 잠재력을 보여줍니다.
서론
난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양 중 하나이며 2018 년 전 세계적으로 약 184,800 명의 사망자가발생했습니다 1. 다중 연구는 난소암 진행 (즉, 전이)과CTCs2,3,4의존재 사이의 상관 관계를 보여주었습니다. CTC의 검출 및 격리를 위한 가장 일반적인 방법은 EpCam 수용체5를표적으로 하는 셀서치 시스템을 이용합니다. EpCam 발현은, 그러나, 암 전이6에서 연루된 중간엽 전이에 상피에서 하향조절된다. 진보에도 불구하고, 현재의 임상 기술은 여전히 낮은 정확도, 높은 비용 및 복잡성으로 고통받고 있습니다. 이러한 단점으로 인해 난소 CTC의 발견 및 열거를 위한 새로운 기술이 연구의 중요한 영역이 되었습니다.
최근, PAFC는 암세포의 비침습적 검출, 나노물질의 분석 및 박테리아의 식별을 위한 효과적인 방법으로 나타났다7,8,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 나노 입자 합성 및 기능화
참고: FA-CuS NPs의 합성은 이전에 게시된프로토콜(21)으로부터적응된 하나의 냄비 합성 방법을 사용하여 달성된다.
주의: 모든 합성은 환기 화학 연기 후드에서 발생해야합니다.
- 합성에 앞서, 0.2 μm 멸균 필터를 통해 약 300 mL의 탈이온화(DI) 물을 걸러낸다.
- 250 mL 유리 둥근 바닥 플라스크를 세제 용액으로 청소하고 DI 물로 헹구세요. CuCl2 0.0134 g을 DI 물 100 mL에 추가하여 1 mM 솔루션을 만듭니다.
- 0.015 g의 엽산(FA)을 CuCl2 용액에 넣고 자기 교반 막대를 사용하여 ~5분 간 저어줍니다.
- Na2S·9H2O(100 μL DI 물에서 0.024 g)를 200 μL 파이펫을 활용한 반응 혼합물에 약 10s이상 첨가한다.
참고 :Na2S·9H2O를 추가하면 용액이 밝은 노란색에서 어두운 갈색으로 변합니다. - 반응을 캡하고 오일 욕조에 놓고 90°C로 설정하고, 마그네틱 교반 막대로 계속 저어줍니다. 약 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
도 1A는 합성된 나노입자의 전형적인 TEM 이미지를 나타낸다. 전형적인 나노입자의 평균 크기는 약 8.6 nm±2.5 nm이다. 나노입자 측정은 ImageJ에서 수행되었다. 측정을 위해 입자를 분리하기 위해 임계값 및 유역 함수를 적용했습니다. 각 입자의 수평 및 수직 직경은 서로 수직으로 측정되고 더 평균화되었습니다. DLS의 경우 대표적인 측정값이 그림 1B에나와 있습니다. 이 입자에 대한 평균 유체 역학 직경은 73.6 nm입니다. 구리 황화물 나노 입자는 그림 1C와같이 NIR로 확장되는 특성 흡광도 곡선을 갖는다. 분광광도계에 의해 레이저의 전환에 의해 발생 된 약 850 nm의 약간의 유물이있다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 PAFC 및 표적 CuS 조영제를 활용하는 난소 CTC의 검출을 위한 간단한 방법이다. 미세유체 장치, RT-PCR 및 형광 유동세포측정법 23,24,25를포함하는 난소 CTC의 검출을 위한 많은 방법이 탐구되었다. 이러한 복잡성, 비용 및 정확도범위는 임상 환경에서의 효율성을 제한합니다. PAFC는 환자 샘플 내에서 CTC를 검출하는 기능 및 생체 내 응용 프로그램으로의 번역 용이성을 포함하여 CTC 검출을 위한 이러한 전통적인 방법에 비해 몇 가지 이점을 소개합니다. PAFC는 또한 표적조영제(26,27)와결합될 때 생체외 및 생체내 CTC를 정확하게 검출하는 것으로 나타났다.
이 작품에서, .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 합성에 대한 그녀의 도움마들렌 하웰을 인정하고 싶습니다, 흐름 시스템을 설계하는 그의 도움 매튜 가슴, 솔리드 웍스에 대한 도움에 대한 에단 마샬.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Corning | 25-053-Cl | 를 사용한 0.025% 트립신 | |
| ; m 1,000 mL 진공 여과 장치 | VWR | 10040-440 | 더 많은 양의 DI 물을 여과합니다. |
| 0.2 & 마이크로; m 멸균 주사기 필터 | VWR | 28145-477 | |
| 3D 인쇄 탱크 | 맞춤형 | ||
| 수집 카드 | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8채널, 14비트 |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | 유리 제품 세척에 사용되는 세제. |
| Amicon Ultra-15 원심 필터 | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 원심 필터 | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple 광섬유에 펄스 광. |
| 커플링 스테이지 | Newport | F-91-C1-T | 스테이지, 펄스 광을 대물렌즈에 커플링하기 위한 스테이지. FP-1A 및 LMH-10x-532 |
| CPX 시리즈 디지털 초음파 세척 수조 | Fisherbrand | 모델 CPX3800 | |
| 데이터 수집 소프트웨어 | 보유 내쇼날인스트루먼트 | NI LabVIEW 2017 (32비트) | 레이저 펄스를 데이터 수집과 동기화하는 데 사용되는 LabVIEW. |
| 데이터 처리 소프트웨어 | Mathworks | Matlab R2016a | Matlab 소프트웨어를 사용하여 생성된 재구성 및 그래프. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| 섬유 척 | Newport | FPH-DJ | 베어 파이버를 잡는 데 사용됩니다. |
| 파이버 커플러 | Newport | FP-1A | 3축 스테이지는 파이버 척과 광섬유를 대물렌즈의 초점에 배치하기 위한 것입니다. |
| 엽산 | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar 코팅 TEM 그리드 | 전자 현미경 과학 | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex 튜빙 | 콜 파머 | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A 매체 | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10mL 주사기 | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| 광섬유 | Thorlabs | FG550LEC | 샘플을 펄스 광에 노출시키는 데 사용됩니다. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | GIBCO | 15140-122 | |
| 펄스 레이저 | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | 사양 1053nm, 8ns 펄스, 최대 10Hz의 펄스 레이저 소스. |
| 펄서/수신기 | Olympus | 5077PR | 광음향 신호를 수신, 필터링 및 증폭합니다. 59dB 게인으로 작동. |
| 석영 모세관 | 셔터 기기 | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) 엽산 무함유 | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 셀 | ATCC | HTB-77 | |
| 중탄산나트륨 | 시그마-알드리치 | S5761 | |
| 탄산나트륨 | 시그마-알드리치 | S7795-500G | |
| 수산화나트륨 비드 | BDH | BDH9292-500G | |
| 황화나트륨 비수화물 | 시그마-알드리치 | 431648-50G | |
| 주사기 펌프 | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl 에스테르 | Invitrogen | 1949071 | |
| 변환기 | Olynmpus | V214-BB-RM | 초음파 검출기는 50 MHz의 중심 주파수와 82%의 -6 dB 분수 대역폭을 가지고 있습니다. |
| Trypan 블루 솔루션 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| 트윈 20 | 시그마-알드리치 | P7949-100ML | |
| 초음파 젤 | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | 트랜스듀서 커플링용 초음파 젤 |
참고문헌
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
