암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 관련 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침략, 전이 및 암 치료에 대한 저항성을 위한 중요한 구성 요소로 확인되었습니다. 그러나, 종양 관련 대식세포는 종양 미세 환경에 따라 종양에 유해할 수 있고 면역 세포의 세포 독성 활성을 길항하거나 항종양 반응을 강화함으로써 그들의 자형질 특성을 가역적으로 변경할 수 있다. 대식세포의 분자 작용과 종양 세포와의 상호 작용 (예를 들어, 식균증)은 광범위하게 연구되지 않았습니다. 따라서, 종양 미세 환경에서 면역 세포 (M1/M2 아류형 TAM)와 암 세포 사이의 상호 작용은 이제 암 면역 요법 연구의 초점이된다. 본 연구에서, 유도된 M1 대식세포 및 마우스 유방 4T1 암종 세포의 살아있는 세포 동배 모델은 상 대비, 형광, 및 차동 간섭 대조(DIC) 현미경을 사용하여 시간 경과 비디오 기능을 사용하여 대식세포의 식세포 활성을 평가하기 위해 개발되었다. 본 방법은 식세포증의 멀티포인트 라이브 셀 이미징을 관찰하고 문서화할 수 있다. M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 식세포증은 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)로 4T1 세포를 염색하기 전에 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있다. 현재 간행물은 단일 이미징 접시에 대식세포 및 종양 세포를 동배하는 방법, M1 대식세포를 편광하고, 13시간 동안 4T1 세포를 포위하는 대식세포의 다점 사건을 기록하는 방법을 설명합니다.
서론
대식세포는 면역 방어의 첫번째 선이고 암세포를 포함하여 병원체 및 이물질에 대하여 면역 반응을 조율하는 역할을 합니다. 그들은 파괴하고 몸에 원치 않는 입자를 제거하는 전문 식세포입니다. 대식세포는 세포사멸세포및미생물의클리어비큐비와 다른면역세포의 모집과 같은 방어적 기능을 기여한다1. 대식세포는 환경 신호2에대한 응답으로 M1 및 M2 대식세포두 가지 유형으로 구분할 수 있다. M1 편광 대식세포(즉, 고전적으로 활성화된 대식세포)는 사이토카인 인터페론-γ(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 활성화되며 염증 반응, 병원균 클리어런스, 효율적인 식세포증 및 종양성면역에관여한다3,4. M2 대식세포는 종양 관련 대식세포(TAM)와 밀접한 관련이 있으며 항염증 및 종양 촉진 특성을 갖는다4.
고대 그리스어 (파게인)에서 파생 된 식균증은 "삼키기"(kytos)를 의미하며 ,"세포"를의미하고 -osis를 의미하며 "과정"5 . 식세포증은 식세포(대식세포, 단핵구 ....
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프로토콜
참고: 섹션 1-6은 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 RAW 264.7 마우스 대식세포의 동문화 모델을 기술한다. 섹션 7은 M1 대식세포 식세포 식세포 4T1 세포의 시간 경과 평가를 기술한다.
1. 배양 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 RAW 264.7 마우스 대식 세포
- 극저온 보존 된 4T1 및 RAW 264.7 항도 6 세포의 바이알을 37°C에서 수조에서 부드럽게 교반하거나 세포주의 정상 성장 온도에 의해 해동한다.
참고: 해동은 약 2분 이내에 신속하게 수행해야 합니다. 오염을 방지하려면 수조에서 바이알을 제거하고 70 % 에탄올로 살포하여 오염을 제거하십시오. 유전 적 드리프트를 피하기 위해, 특히 대식세포에 대 식, 낮은 통로 수를 사용 하 여 (즉, 20 미만). - 15 mL 원엽 튜브에서 완전한 DMEM 배지의 10 mL에서 해동 된 세포를 희석하고 세포 펠릿을 얻기 위해 5 분 동안 600 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
참고: 10% (v/v) 태아 소 혈청(FBS), 200 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2 mML-글루타민을 보충한 완전한 DMEM 배지가 프로토콜 전체에 사용됩니다. - 조심스럽게 배지를 흡인하고, 완전한 배지의 8 m....
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결과
4T1 마우스 유방암종 세포주의 동문화 모델의 타임랩스 2차원(2D) 이미지는 13시간 동안 M1 대식세포에 의해 침몰되는 4T1 세포를 보여준다. 면역 염색을 수행함으로써 M1 대식세포의 완전한 분광을 보장하는 것이 중요하다. 결과(도 1)는100 ng/mL 리포폴리당(LPS) 및 20 ng/mL IFN-γ의 농도가 M1 상태로 의 한RAW 264.7 대식세포로 편광되었다는 것을 보여준다. 표적 세포를 형광 염료로 표지하고 이펙터 세포를 얼룩지게 하지 않은 상태로 두면 살아있는 세포 동배모델(Movie 1)을허용한다. 13시간 및 15분 간격을 통하여, 4T1 세포와의 동문화에서 M1 대식세포의 식세포 활성을 문서화하였다(Movie2). 6개의 멀티포인트비디오(A−F in Movie 2)는단일 35mm 유리 바닥 이미징 접시 내에서 여러 이벤트를 평가하기.......
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토론
기재된 프로토콜은 2단계를 필요로 한다: 1) 4T1 마우스 유방암종 세포 및 M1 편광 대식세포의 공동배양, 2) 타임랩스 현미경을 이용한 대식세포 식세포 활성의 평가. 살아있는 세포 동문화는 식세포증 및 이동 세포 세포에서 널리 사용된다. 여기서 살아있는 세포 동배 모델은 4T1 표적 세포를표지하는 데 사용되는 형광 염료, CFSE를 활용하는 간단하고 적응력이 있는 체외 시술(도 2)이다. 이것은 살아있는 세포 화상 진찰 도중 세포 모형의 적당한 추적을 위해 이용됩니다. 타임랩스 라이브 셀 이미징은 13시간 의 동문화 전에 다점 타임랩스 2D 이미징을 사용하여 M1 대식세포의 식세포 활성을 평가하는데 사용되었다.
살아있는 세포 동배 모델은 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 M1 마우스 대식세포를 사용하여 확립되었다. 세포를 서로 구별하기 위해, 4T1 세포를 CFSE 형광 염료를 사용하여 염색하였다(섹션 4 참조). CFS.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 재정적으로 제란 푸트라 Berimpak에 의해 투자되었다 (GBP), 대학 푸트라 말레이시아: 9542800. 우리는 농업 생명 공학 연구소, 말레이시아 (ABI) 실험실 및 현미경 이미징 시설에 감사드립니다. 이 작품에 대한 실험 비디오를 편집하고 녹화하는 데 도움을 주어 Mohd Daniel Hazim에게 특별한 감사를 드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항-INOS 항체 접합체 FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µ g 1mL |
| 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE) | 인비트로젠 | C1157 | 25mg |
| DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드) | 인비트로젠 | D1306 | 10mg |
| DMEM/고포도 | HyClone | SH30003.04 | 670.0g |
| 소 태아 혈청 | Tico Europe | FBSEU500 500mL | |
| 리포다당 | 시그마 | L4516-1MG | 1 mg |
| 마우스 재조합 인터페론-감마 | 스템셀 기술 | 78021 | 100 &마이크로; g |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 팩 |
| 트립신 EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 &마이크로; L 피펫 팁 | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 팁/케이스 |
| 2 mL 혈청학 피펫 | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µ L 피펫 팁 | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 세포 배양 플라스크 | Corning | CLS430639 | 조직 배양 처리 |
| 벤치 탑 원심 분리기 | Dynamica | FA15C | 모델: Velocity 14R |
| 생물학적 안전 흄 후드 | Nuaire | NU-565-400 | 모델: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) |
| 유량계 포함 Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | 모델: MCO-19M(UV) |
| 컨포칼 현미경 | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| 유리 바닥 접시 | Ibidi | 81218-200 | 35mm |
| NIS 요소 소프트웨어 | Nikon Instruments Inc. | 사용 가능한 온라인 다운로드 | |
| 피펫 컨트롤러 | CappAid | PA-100 | CappController 피펫 컨트롤러, 0.1-100ml |
| 온도 조절기 | Shinko | 단종 | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
참고문헌
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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재인쇄 및 허가
