Method Article

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

DOI:

10.3791/60282

⸱

June 2nd, 2020

 , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Parc Científic de Barcelona, 2The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

Abstract

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다세포 유기체 내에서, 성숙한 조직 및 기관은 그들의 구성 세포의 공간 배열에 순서의 높은 학위를 표시합니다. 놀라운 예는 동일하거나 명백한 정체성의 세포가 고도로 조직된 평면 패턴을 보여주는 세포 세포 접착을 통해 함께 모이는 감각 에피텔리아에 의해 주어집니다. 셀은 동일한 방향으로 서로 정렬하고 큰 거리에서 동등한 극성을 표시합니다. 성숙한 상피의이 조직은 형태 형성의 과정을 통해 확립됩니다. 성숙한 상피의 평면 배열이 달성되는 방법을 이해하기 위하여는, 생체 내에서 발달 도중 높은 주시부 충실도를 가진 세포 배향 그리고 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다. 또한 로컬-글로벌 전환을 식별하고 특성화하는 데 강력한 분석 도구도 필수적입니다. Drosophila pupa는 상피 형태 형성의 근본적인 지향성 세포 모양 변경을 평가하는 이상적인 시스템입니다. pupal 개발 상피는 움직이지 않는 바디의 외부 표면을 구성합니다, 손상되지 않은 동물의 장기 적인 화상 진찰을 허용하. 여기에서 기술된 프로토콜은 퍼팔 복부 표피에 있는 글로벌 그리고 현지 수준 둘 다에 있는 세포 행동을 심상하고 분석하기 위하여 디자인됩니다. 기술된 방법론은 그밖 발달 단계, 조직, 세포이하 구조물, 또는 모형 유기체에 세포 행동의 화상 진찰에 쉽게 적응될 수 있습니다.

Introduction

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그들의 역할을 달성하기 위해 상피 조직은 세포 구성 요소의 공간 조직에 완전히 의존합니다. 대부분의 에피텔리아에서 세포는 정확한 조약돌 층을 만들기 위해 서로 에피테일뿐만 아니라 신체 축을 기준으로 방향을 조정합니다.

정확한 조직 조직의 기능적 중요성은 척추 동물 내이및 망막과 같은 감각 상피에서 명백합니다. 첫 번째 경우, 머리카락과 지지 셀은 특정 축 방향으로 정렬되어 소리 및 동작1,,2와같은 기계적 입력을 효율적으로 감지합니다. 유사하게, 광수용체 세포 공간 조직은 망막3에의해 최적의 광학 적 특성을 달성하기 위해 필수적이다. 세포 위치 및 방향의 공간 제어는 따라서 적절한 생리 기능에 대한 특정 관련성이다.

Drosophila는 변형을 통해 애벌레 신체 구조의 완전한 변형을 겪는 홀로 메타 볼곤충으로 성인 조직을 초래합니다. Drosophila pupa는 발달 세포 이동4,세포 분열 및 성장 역학5,근육 수축

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Protocol

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참고 : 이 프로토콜은 다섯 단계로 나뉩니다 : (1) 번데기, (2) 이미징을위한 번데기를 준비하고, (3) 성장하는 복부 상피의 라이브 이미징, (4) 유전 모자이크의 생성, (5) 데이터 처리 및 분석 (세포 접합 윤곽선및 세포 클론에서 성장 역학에서 세포 배향 역학을 분석하는 방법을 설명하는 섹션 포함).

1. 화상 진찰의 앞에 초파리 pupae의 발판

  1. 배양은 계란 누워 후 5 일 동안 25 °C (±12 h)에서 플라스틱 바이알에서 표준 배지에 적절한 유전자형을 날아다닙니다 (AEL).
    참고 : 변태는 puparium 형성 후 0 시간까지 120 h AEL에서 pupal 케이스로 세 번째 instar 애벌레의 감금 내에서 시작됩니다 (APF). 이러한 전이는 유충이 먹이와 이동을 멈추고 0-12 h APF에서 안방영역이A형성되어 있기 때문에 쉽게 식별할 수 있다. 퍼파륨은 처음에는 부드럽고 흰색이지만 점진적으로 굳어지고 황갈색이 됩니다.
  2. 촉촉한 페인트 브러시를 사용하여 신선한 플라스틱 바이알에 흰색 prepupae (0 h APF)를 옮김. 동물은 원하는 나이까지 설계된 실험에 따라 다른 온도로....

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Results

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위에서 설명한 프로토콜은 장기 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupae의 준비와 복부 표피의 세포 배향 및 성장 역학의 분석을 위한 절차를 다룹니다. 이 방법론을 적용함으로써 유의한 광표백 또는 광독성 없이 최대 48시간 동안 개발 된 번데의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. 상이한 시점과 다른 각도에서 배반되는 번데기에서 복부 표피(예를 들어, 히스토블라스트 및 LEC)를 묘사하는 스냅샷은 도 4에나와 있다. 이러한 영화의 후속 분석을 통해 히스토블라스트의 확장 및 LEC 교체 중에 변조된 주요 기하학적 및 형상 파라미터의 국부적 및 글로벌 변화의 역학을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 분석은 다양한 시나리오 및 특정 돌연변이 배경에서 수행될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 유전자 발현이 변경되는 클론을 위해 채택될 수 있습니다, 자율적인 손실 또는 기능 조건의 이득으로 이끌어.......

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Discussion

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장거리 주문은 대부분의 기능성 생리학적 단위의 필수 특성입니다. 형태 형성 동안, 순서는 높은 시간 및 공간 정밀도로 구현 된 복잡한 명령의 통합을 통해 달성된다. 다중 및 다단계 구속은 스테레오타입 조직 배열로 통합됩니다.

극성과 지향성은 개발 중에 정렬된 공간 배열에 매우 중요합니다. 극성은 개발 중에 대칭 파괴를 의미합니다. 비대칭의 성취는 배아 전방 후방 (A/P) 및 dorsoventral (D/V) 축 및 성인 조직(26)의결정에 필요하다. 이 초기 역할 외에도 지역 비대칭은 모든 수준에서 형태학적 다양성에 필수적입니다. 지향성은 형태 형성 동안 비대칭과 극성의 필수적인 보완이다. 글로벌 순서는 정확한 감각 또는 방향을 가진 셀 대 세포 기지에 로컬로 신호를 감지하고 전송하는 셀의 능력에 의해 구현됩니다. 단일 세포 비대칭은 공간에서 특정 방향 내에서 위치 또는 움직임을 방향을 지정하여 시간이 지남에 따라 협력적으로 조화를 이.......

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Disclosures

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저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 도움이 토론에 대한 마틴 - 블랑코 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 닉 타폰 (크릭 연구소, 런던, 영국), 블루밍턴 스톡 센터 (인디애나 대학, 미국) 및 FlyBase (초파리 유전자 별표)에 감사드립니다. 페데리카 만지오네는 JAE-CSIC 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다. 마르틴-블랑코 연구소는 프로그램 아토타 에스타탈 드 포멘토 드 라 인베스티가시온 Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P 및 BFU2017-82876-P)와 Fundación 라몬 아레세스로부터 자금을 지원받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
분석 소프트웨어-ImageJ데이터 분석
DrosophilaAtpa::GFP-데이터 수집에 사용되는 균주
Drosophilahsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls-Strains 데이터 수집에 사용
Dumont 5 집게FST11251-20해부용 직경 1.5mm
유리 바닥 플레이트Mat TekP35G-0.170-14-C데이터 수집을 위한 장착 번데기
할로카본 오일 27Sigma-Aldrich9002-83-9장착 번데기
도립 컨포칼 현미경ZeissLSM700데이터 수집
실체현미경LeicaDFC365FX해부 중 번데기 시각화

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae....

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