5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

요약

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

초록

중추 신경계 (CNS)에서 미세 혈관의 분리는 일반적으로 여러 동물, 가장 자주 설치류에서 피질 조직을 결합하여 수행됩니다. 이 접근은 피질에 혈액 두뇌 방벽 (BBB) 속성의 심문을 제한하고 개별적인 비교를 허용하지 않습니다. 이 프로젝트는 여러 CNS 영역에서 신경 혈관 단위 (NVU)의 비교를 허용하는 격리 방법의 개발에 초점을 맞추고: 피질, 소뇌, 광학 엽, 시상 하부, 뇌하수체, 뇌간, 및 척수. 더욱이, 원래 뮤린 견본을 위해 개발된 이 프로토콜은, 우리가 또한 두뇌 반구 백색 물질에서 microvessels를 격리할 수 있는 작고 큰 척추동물 종에서 CNS 조직에 사용을 위해 성공적으로 적응되었습니다. 이 방법은, 면역 표지와 결합될 때, 개별, 조직 모형, 또는 처리 사이 단백질 발현 그리고 통계적인 비교의 정량화를 허용합니다. 우리는 신경염증성 질환, 다발성 경화증의 뮤린 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 단백질 발현의 변화를 평가함으로써 이러한 적용성을 입증했습니다. 또한, 이 방법으로 분리된 마이크로혈관은 qPCR, RNA-seq 및 웨스턴 블롯과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 이것은 초원심분리 또는 효소 해리를 사용하지 않고 CNS 마이크로 혈관을 분리하려는 첫 번째 시도가 아니지만 단일 개인 및 다중 CNS 영역의 비교에 대한 숙련도가 독특합니다. 따라서, 그것은 그렇지 않으면 모호한 남아있을 수있는 차이의 범위의 조사를 허용: CNS 부분 (피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간, 시상 하부, 뇌하수체, 척수), CNS 조직 유형 (회색 또는 백색 물질), 개인, 실험 치료 그룹, 및 종.

서론

우리의 뇌는 우리 몸에서 가장 중요한 기관입니다. 이러한 이유로, 정상에서 편차를 일으킬 수 있는 외부 요인에도 불구 하 고 뇌 항상성을 유지 하는 것이 우선 순위. 일부 학자에 따르면, 약 400-5억 년 전^1,척추 동물은 우리가 지금 혈액 뇌 장벽으로 알고 개발 (BBB)^2,3. 이 보호 "울타리"는 혈액과 CNS 자렌 치마 사이의 이온, 분자 및 세포의 수송을 엄격하게 조절하여 중추 신경계 (CNS) 항상성 및 기능에 가장 큰 영향을 미칩니다. BBB가 중단되면 뇌는 독성 노출, 감염 및 염증에 취약해집니다. 따라서, BBB 기능 장애는 많은 연관, 전부는 아니지만, 신경 및 신경 발달 장애^4,5,6.

BBB의 정교한 기능은 신경 혈관 단위 (NVU)^2,3에의해 부합하는 독특한 CNS 미세 혈관 구조에 기인한다. 고도로 전....

프로토콜

본 연구의 모든 절차는 캘리포니아 대학 (UC), 데이비스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정 된 지침에 따라. UC 데이비스의 동물 보호는 여러 독립적 인 자원에 의해 규제되며 1966 년부터 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증되었습니다. 돼지 CNS 조직은 동물 과학의 UCD 학과에서 얻은, 육류 과학 연구소. rhesus 원숭이에서 CNS 조직은 캘리포니아 국립 영장류 연구 센터 병리학 부 (NIH P51OD011107)에서 수득되었습니다. 돼지와 원숭이에 실험실 직원에 의해 어떤 마취, 안락사, 또는 부검을 수행하지 않았다. 따라서 이러한 문제에 대한 특별한 권장 사항은 없습니다.

참고 : 이 방법은 여러 종에 대해 검증되었지만 제공된 프로토콜은 마우스 및 돼지 조직에 보다 직접적으로 대응합니다. 포유류 표본을 사용할 때 는 광학 엽에 관련된 세부 사항이 적용되지 않습니다. 모든 생체 유해 물질은 적절한 생물 안전 수준(BSL) 시설에서 처리되어야 합니다. 모든 급성 독성 물질은 연기 후드 아래에 처리해야합니다. 모든 생체 유해 의료 폐기물 및 급성 독성 폐기물은 올바르게 폐기해야 합니다.

1. 준비

1. 솔....

결과

뮤린 CNS로부터 분리된 미세혈관은 신경혈관 단위^2,3의모든 내재세포 성분을 보였다. 내피 세포에 대한 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM, CD31이라고도 함) 또는 isolectin IB4 (내피 세포 글리코칼릭스를 결합하는 당단백질)를 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFRβ) 또는 신경-신경교 항원 2(NG2)는 성상 세포종말피트를 위한 구혈구 및 아쿠아포린-4(AQP4)에 대해(그림 3A, B)이러한 본질적인 성분이 단리된 마이크로혈관에 존재한다는 것을 보여준다. 가시적인 CNS 영역은 피질 미세혈관(도3B),소뇌(도3

토론

BBB는 CNS 항상성에 중요한 단단한, 부착-, "페그 소켓"- 접합부 및 CNS 항상성에 중요한 접착 플라크의 정교한 아키텍처에 의해 결합된 뇌 미세 혈관 내피 세포의 독특한^특성을포함한다^2,3,19. 내피 세포 특성은 주위 세포및 주변 아스트로글리아 말발 공정^2,3,19에의해 유도 및 유지된다. BBB 미세혈관구조는 극성(즉, 발광 또는 분수 내피 세포 표면에 국한된 단백질의 비대칭 발현^{패턴)(20)을}표시한다. 이 간단 하 게 BBB를 정의할 수 있습니다 하는 동안, 현실에서 그것은 신경 과학에서 가장 수수께끼 개념 중 하나 남아. 예를 들어, NVU .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10X PBS	ThermoFisher	BP39920	차단 및 항체 희석제에 사용됩니다.
20% PFA	전자 현미경 과학	15713-S	고정제로 사용(4% PFA)
70,000MW Dextran	Millipore Sigma	9004-54-0	MV-2 솔루션에 사용
Adson Forceps	Fine Science Tools(FST)	11006-12	근육 및 피부 제거에 사용
Adson Forceps, 학생 품질	FST	91106-12	위와 동일하지만 더 저렴한
소 혈청 알부민 (BSA)	Millipore Sigma	A7906-100G	MV-3 용액, 차단 및 항체 희석제에 사용
Corning 100 μ m 세포 여과기	Millipore Sigma	CLS431752-50EA
Corning 70 μ m 세포 여과기	Millipore Sigma	CLS431751-50EA
Corning Deskwork 낮은 바인딩 팁	Millipore Sigma	CLS4151	아래와 동일하지만 더 저렴합니다.
Cultrex 폴리 D- 라이신	R & D	3439-100-01	슬라이드 코팅에 사용
당나귀 안티 염소 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21432	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 마우스 IgG-ALEXA 488	Thermo	A21202	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 토끼 IgG-ALEXA 488	Thermo	A21206	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 토끼 IgG-ALEXA 647	Thermo	A31573	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 항 쥐 IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10029	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
이중 갈래 조직 선택	FST	18067-11	수막 및 맥락막 신경총 제거에 사용
Dumont #3c Forceps	FST	11231-20	보다 섬세하거나 작은 CNS 조직 처리(예: 뇌하수체)에 사용
Dumont #7 Forceps	FST	11274-20	CNS tisssue 해부 및 취급에 사용
Dumont #7 Forceps, student	FST	91197-00	위와 동일하지만 저렴한
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention 팁	Eppendorf	22493008	위의 팁보다 품질이 우수합니다(더 비쌉니다).
엑스트라 파인 Graefe 집게, 톱니 모양의	FST	11151-10	뼈 제거에 사용되는
고급 가위, 날카로운	FST	14060-09	돼지와 원숭이 경막 주머니 제거에 사용
유리 유봉 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 조직 분쇄기 균질화기, 10개 팩	Chang Bioscience Inc. (eBay)	GP1.5_10	작은 vetebrate 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
염소 항-CXCL12, 비오틴화	PeproTech	500-P87BGBT	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 희석량: 1:20.
염소 안티 JAM-B	R & D	AF1074	신경염증을 평가하기 위한 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
염소 안티 마우스 IgG-ALEXA 488	Thermo	A11001	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티 마우스 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21424	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티-PDGFR&베타;	R& D	AF1042	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
염소 항 토끼 IgG-ALEXA 555	Thermo	A21249	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티 토끼 IgG-DyLight 488	Thermo	35552	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 항 쥐 IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10021	2 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Graefe 집게, 곡선 팁, 1X2 이빨	FST	11054-10	나일론 필터 그물 고정 및 흔들기에 사용
, 칼슘 및 마그네슘이 함유 된 1X 완충액	Corning	21-022-CM	MV-1 용액
HEPES, 1M 액체 완충액	Corning	25-060-CI	MV-1 용액에 사용
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX	ThermoFisher Scientific (Thermo)	I21414	콩과 식물 Griffonia simplicifolia에서 분리된 당단백질은 내피 세포 glycocalysx의 D-갈락토실 잔기에 결합합니다. 조류 및 돼지 CNS 미세혈관에 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
LaGrange 가위, 톱니 모양의	FST	14173-12	두개골 해부 및 후판 절제술에 사용(돼지 및 원숭이 제외)
Millicell EZ 슬라이드 8웰 유닛	Millipore Sigma	PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5	Thermo	35-2500	모든 표본의 CNS 미세혈관에 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-GGT1	Abcam	ab55138	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 안티 휴먼 CD31	R& D	BBA7	영장류 CNS 미세혈관의 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 16.5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-NFM	Thermo	RMO-270	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-αSMA	Thermo	MA5-11547	모든 표본의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
나일론 필터 네트, 롤	Millipore Sigma	NY6000010	직경 13mm의 필터 네트 디스크로 레이저 절단. 작은 vetebrate 시상 하부 및 뇌하수체에 사용됩니다.
나일론 여과망, 25 mm	Millipore 시그마	NY2002500	시상하부와 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물, CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
나일론 필터 네트, 47mm	Millipore Sigma	NY2004700	시상하부와 뇌하수체를 제외한 원숭이와 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
ThermoFisher	P36935	가 포함된 ProLong Gold 퇴색 방지 시약	슬라이드를 커버슬립하는 데 사용됩니다.
Rabbit anti-AQP4	Millipore Sigma	A5971	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Rabbit anti-LSR	Millipore Sigma	SAB2107967	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rabbit anti-NG2	Millipore Sigma	AB5320	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Rabbit anti-OSP	Abcam	ab53041	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 1 μ g/mL입니다.
토끼 항-VE-Cadherin	Abcam	ab33168	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rabbit anti-ZO-1	Thermo	61-7300	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
쥐 항 CD31	Becton Dickinson	BD 550274	쥐 CNS 미세혈관의 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rat anti-GFAP	Thermo	13-0300	모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
쥐 항 VCAM-1	Becton Dickinson	BD 553329	신경 염증을 평가하기위한 1 차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Sterile Ringer's Solution, Frog	Aldon Corporation	IS5066	암피비아 마취에 사용
Streptavidin-ALEXA 555	Thermo	S32355	비오틴화된 1차 항체를 라벨링하기 위한 2차 항체로 사용됩니다. 1:500의 권장 희석.
Streptavidin-ALEXA 647	Thermo	S32357	비오틴화된 1차 항체를 라벨링하기 위한 2차 항체로 사용됩니다. 1:500의 권장 희석.
수술 용 가위, 날카로운	FST	14002-12	근육 및 피부 제거에 사용
수술 용 가위, 날카롭게 뭉툭한	FST	14001-16	참수에 사용 (돼지 및 원숭이 제외)
Swinnex 필터 홀더, 13mm	Millipore Sigma	SX0001300	레이저 컷으로 수정. 작은 vetebrate 시상 하부 및 뇌하수체에 사용됩니다.
Swinnex 필터 홀더, 25mm	Millipore Sigma	SX0002500	레이저 컷으로 수정됨. 시상하부와 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물, CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
Swinnex 필터 홀더, 47mm	Millipore Sigma	SX0004700	레이저 컷으로 수정되었습니다. 시상하부와 뇌하수체를 제외한 원숭이와 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
Triton X-100	ThermoFisher	50-165-7277	차단 및 항체 희석제에 사용됩니다.
Wheaton 120 Vac 오버헤드 교반기	VWR(공급업체 DWK Life Sciences)	62400-904(DWK #903475)	시상하부 및 뇌하수체를 제외한 55mL 조직 분쇄기가 있는 원숭이 및 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
PTFE 유봉이 있는 Wheaton Potter-Elvehjem 티슈 그라인더, 10mL	VWR(공급업체 DWK Life Sciences)	14231-384(DWK #357979)	시상하부 및 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물 CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
PTFE 유봉이 있는 Wheaton Potter-Elvehjem 티슈 그라인더, 55mL	VWR(공급업체 DWK Life Sciences)	14231-372(DWK #357994)	시상하부 및 뇌하수체를 제외한 원숭이 및 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.