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방법 논문

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60291

⸱

2020년 1월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

초록

중추 신경계 (CNS)에서 미세 혈관의 분리는 일반적으로 여러 동물, 가장 자주 설치류에서 피질 조직을 결합하여 수행됩니다. 이 접근은 피질에 혈액 두뇌 방벽 (BBB) 속성의 심문을 제한하고 개별적인 비교를 허용하지 않습니다. 이 프로젝트는 여러 CNS 영역에서 신경 혈관 단위 (NVU)의 비교를 허용하는 격리 방법의 개발에 초점을 맞추고: 피질, 소뇌, 광학 엽, 시상 하부, 뇌하수체, 뇌간, 및 척수. 더욱이, 원래 뮤린 견본을 위해 개발된 이 프로토콜은, 우리가 또한 두뇌 반구 백색 물질에서 microvessels를 격리할 수 있는 작고 큰 척추동물 종에서 CNS 조직에 사용을 위해 성공적으로 적응되었습니다. 이 방법은, 면역 표지와 결합될 때, 개별, 조직 모형, 또는 처리 사이 단백질 발현 그리고 통계적인 비교의 정량화를 허용합니다. 우리는 신경염증성 질환, 다발성 경화증의 뮤린 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 단백질 발현의 변화를 평가함으로써 이러한 적용성을 입증했습니다. 또한, 이 방법으로 분리된 마이크로혈관은 qPCR, RNA-seq 및 웨스턴 블롯과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 이것은 초원심분리 또는 효소 해리를 사용하지 않고 CNS 마이크로 혈관을 분리하려는 첫 번째 시도가 아니지만 단일 개인 및 다중 CNS 영역의 비교에 대한 숙련도가 독특합니다. 따라서, 그것은 그렇지 않으면 모호한 남아있을 수있는 차이의 범위의 조사를 허용: CNS 부분 (피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간, 시상 하부, 뇌하수체, 척수), CNS 조직 유형 (회색 또는 백색 물질), 개인, 실험 치료 그룹, 및 종.

서론

우리의 뇌는 우리 몸에서 가장 중요한 기관입니다. 이러한 이유로, 정상에서 편차를 일으킬 수 있는 외부 요인에도 불구 하 고 뇌 항상성을 유지 하는 것이 우선 순위. 일부 학자에 따르면, 약 400-5억 년 전1,척추 동물은 우리가 지금 혈액 뇌 장벽으로 알고 개발 (BBB)2,3. 이 보호 "울타리"는 혈액과 CNS 자렌 치마 사이의 이온, 분자 및 세포의 수송을 엄격하게 조절하여 중추 신경계 (CNS) 항상성 및 기능에 가장 큰 영향을 미칩니다. BBB가 중단되면 뇌는 독성 노출, 감염 및 염증에 취약해집니다. 따라서, BBB 기능 장애는 많은 연관, 전부는 아니지만, 신경 및 신경 발달 장애4,5,6.

BBB의 정교한 기능은 신경 혈관 단위 (NVU)2,3에의해 부합하는 독특한 CNS 미세 혈관 구조에 기인한다. 고도로 전문화된 내피 세포, 회구 및 성상 세포 끝피트는 NVU2,3의세포 성분이다. 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기matrix는 또한 NVU 및 BBB 생리학2,3에필수적이다. NVU의 필수 세포 및 분자 성분이 척추동물 사이에서 보존되지만, 이질성은 주문 및 종7,8사이에서 보고된다. 그러나, 기술적 한계는 신경 생물학, 생물 의학, 또는 번역 연구에 있는 이 다름을 완전히 고려하는 우리의 기능을 방해합니다.

이 때문에, 우리는 물고기, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류 : 우리는 모든 다섯 척추 동물 그룹에서 수많은 종에 적용 할 수 있도록 CNS 지역 별 마이크로 혈관 격리 방법을 확장했다. 이 프로토콜은 번역 관련성이 있는 종을 포함하는 작은 계수뇌증 및 큰 자뇌척추동물에 사용하기 위해 기술된다9. 추가적으로, 우리는 이 문맥 내의 전에 조사되지 않은 CNS의 그밖 지구를 포함합니다, 그러나 신경 생리학및 엄청난 임상 연루와 관련있는: 시상 하부, 뇌하수체 및 백색 물질. 마지막으로, 우리는 NVU 및 / 또는 BBB9,10,11을따라 단백질 발현의 변화를 식별하는 신뢰할 수있는 도구로이 격리 방법의 용량을 테스트했습니다. 개념 증명으로서, 우리는 면역형광에 이어 격리 방법을 사용하여 EAE 동안 VCAM-1 및 JAM-B 발현의 변화를 결정하는 방법을 보여주었다.

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프로토콜

본 연구의 모든 절차는 캘리포니아 대학 (UC), 데이비스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정 된 지침에 따라. UC 데이비스의 동물 보호는 여러 독립적 인 자원에 의해 규제되며 1966 년부터 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증되었습니다. 돼지 CNS 조직은 동물 과학의 UCD 학과에서 얻은, 육류 과학 연구소. rhesus 원숭이에서 CNS 조직은 캘리포니아 국립 영장류 연구 센터 병리학 부 (NIH P51OD011107)에서 수득되었습니다. 돼지와 원숭이에 실험실 직원에 의해 어떤 마취, 안락사, 또는 부검을 수행하지 않았다. 따라서 이러한 문제에 대한 특별한 권장 사항은 없습니다.

참고 : 이 방법은 여러 종에 대해 검증되었지만 제공된 프로토콜은 마우스 및 돼지 조직에 보다 직접적으로 대응합니다. 포유류 표본을 사용할 때 는 광학 엽에 관련된 세부 사항이 적용되지 않습니다. 모든 생체 유해 물질은 적절한 생물 안전 수준(BSL) 시설에서 처리되어야 합니다. 모든 급성 독성 물질은 연기 후드 아래에 처리해야합니다. 모든 생체 유해 의료 폐기물 및 급성 독성 폐기물은 올바르게 폐기해야 합니다.

1. 준비

  1. 솔루션 준비(표 1)적어도 하루 전에.
    참고 : 70 kDa 분자량 (MW) 덱젠을 용해하는 것은 매우 어렵습니다. 용액이 파라핀 필름 또는 호일로 덮여 밤새 교반하게하는 것이 더 효율적입니다. 이 프로토콜은 조사 중인 시편에 따라 두 가지 다른 MV-2 용액을 사용해야 합니다. 18% 덱스론은 작은 lissencephalic 견본에 프로토콜을 능력을 발휘할 때 마이크로 혈관 펠릿에서 myelin를 효율적으로 분리합니다. 그러나, 그것은 큰 gyrencephalic 견본에서 CNS 조직의 계면 내의 myelin의 얼룩을 개발합니다, 뿐만 아니라 작은 견본에서 시상 하부 및 뇌하수체. 이 얼룩은 20% 덱스렌을 사용하여 방지됩니다.
  2. 폴리-D-리신의 웰당 50 μL을 적재하여 잘 슬라이드를 준비하고 바람직하게는 생물학적 안전 캐비닛 클래스 2 (BSC-2)에서 실온 (RT)에서 2 시간 동안 건조시십시오. 지나치게 말리지 마십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 헹구고 사용할 준비가 될 때까지 냉장고에 보관하십시오.

2. 작은 Lissencephalic 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부

참고 : 이 문서는 C57BL6 / J, 10 주 된, ~ 25g, 남성 마우스에 프로토콜의 응용 프로그램을 보여줍니다.

  1. 시편당 MV-1 용액의 각각 5mL 및 1mL로 2개의 15mL 원점 튜브와 1.7mL 미세원원각지 튜브를 준비합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  2. 마취
    1. 케타민, 자일라진, 아세프로마진 마취칵테일을 kg 체중당 100/10/3 mg으로 주사제하고 70% 에탄올로 스프레이하여 마우스를 마취시고. 눈을 만지고 발을 꼬집어 팔목과 페달 반사의 부재를 각각 평가하여 마취를 확인하십시오.
    2. 유도 마취 상자를 사용하여 5 %의 이소플루란을 흡입하여 비둘기를 마취시다.
    3. 물고기와 개구리를 1% 트리카인으로 마취시키면 물탱크나 수륙양용 링거용액(재료표)을들고 있는 물고기입니다.
    4. 안락사 전에 4 °C에서 냉각하여 도마뱀을 마취.
  3. 수술 용 가위로 동물을 참수하고, 두개골을 노출시키기 위해 집게로 피부를 벗기고, LaGrange 가위로 자르고 포라멘 매그넘 (그림 1A).
  4. 주걱으로 뇌를 해부하고 MV-1 용액으로 15 mL 원엽 튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  5. 포셉으로 두개골의 셀라 터시카에서 뇌하수체를 검색하고 MV-1 용액으로 1.7 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  6. 척추 기둥을 노출하기 위해 피부와 근육을 제거합니다. 사지, 흉곽 및 내부 장기를잘라냅니다(그림 1B).
  7. 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나에 의해 척수를 해부하십시오. 이어서, MV-1 용액을 사용하여 5 mL 원엽 튜브로 이송한다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    1. 요추에 도달 할 때까지, 자궁 경부 척추 포어를통해 시작, LaGrange 가위로 꼬리 방향으로 로스트랄에서 절단하여 laminectomy을 수행합니다.
    2. MV-1 용액이 적재된 18 G 바늘과 10 mL 주사기로 요추 척추 포라멘 전체에 걸쳐 로스트랄 방향으로 캐걸로 플러싱을 수행합니다(그림1C,D).
      참고 :이 방법은 매우 작은 표본, 주로 설치류 (<100g)에서만 작동합니다.
  8. 해부 범위를 사용하여 스프링 가위로 척수에서 경막 낭을 자르고 이중 갈래 로 나머지 수막을 제거합니다(그림 2).
  9. 페트리 접시에 뇌를 전송하고, 해부 범위를 사용하여, 이중 갈래 선택(그림 2A-C)로수막을 제거합니다.
  10. 후각 전구와 시상집, 홍채 가위, 스프링 가위로 절제합니다. 이중 갈래 선택을 사용하여 모든 뇌실에서 촉막 신경총신경절을 제거하십시오. 모든 경막염 신경총이 제거되었는지 확인하십시오.
    참고 : 경막염 신경총과 후각 전구는 오염의 거대한 소스입니다. BBB와는 달리, 이러한 모세 혈관은 매우 페네스트화되고 제거되지 않으면 후속 실험의 결과가 손상됩니다.
  11. 집게를 사용하여 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 (포유류 표본이 아님) 및 시상 하부와 같은 뚜렷한 CNS 영역을 분리합니다.

3. 큰 자뇌척성 척추 동물 표본에서 CNS 조직 해부

참고 : 이 프로토콜은 아바토이르에서 얻은 돼지 CNS 조직을 사용합니다. 따라서 마취, 안락사 또는 부검은 여기에 설명하거나 표시되지 않습니다.

  1. 얼음 가슴/양동이 내부에 MV-1 용액이 적재된 0.946 L(32 oz) 조직학 용기에 돼지 CNS 조직을 운반합니다.
  2. 해부 범위를 사용하여 각 CNS 조직에서 이중 갈래 선택, 집게, 홍채 가위 및 봄 가위로 수구를 제거하십시오. 뇌실에서 촉막 신경총 조각을 제거해야합니다.

4. CNS 조직 균질화

참고 : 두 명의 조사자가 균질화 과정에 참여할 때 더 효율적입니다 : 하나는 스테레오 스코프 하에서 수막을 해부하고 다른 하나는 다진 조직을 균질화합니다. 이렇게하면 조직은 신속하게 얼음 양동이로 돌아와 차갑게 유지됩니다.

  1. 각 CNS 영역을 MV-1 용액의 ~1 mL로 페트리 접시에 놓습니다. 단일 에지 블레이드를 사용하여 조직을 잘라 서 1-2mm 조각을 얻습니다.
    1. 작은 척추동물 표본의 경우 100mm x 20mm 페트리 접시를 사용하십시오.
    2. 큰 척추 동물 표본의 경우 150mm x 15mm 페트리 접시를 사용하십시오.
  2. 작은 척추동물 표본의 균질화(표 2 및 표 3)
    1. 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 및 척수를 개별 10 mL Potter-Elvehjem 유리 조직 분쇄기로 개별 10 mL에서 MV-1 용액의 ~1 mL로 전사 파이펫을 사용하여 PTFE 유봉으로 옮김을 옮김을 전달한다. MV-1 용액 5 mL을 추가하고 각 조직 (~10 스트로크)을 균질화하십시오. 개별 15 mL 원엽 튜브로 전송합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
      참고: 작은 척추동물의 경우, 광학 엽유무에 관계없이 각각 10 mL Potter-Elvehjem 그라인더와 15 mL 원추형 튜브가 필요합니다.
    2. 개별 1.7 mL 튜브에서 MV-1 용액의 ~ 100 μL에 집게로 시상 하부 와 뇌하수를 전송하고 조심스럽게 유리 마이크로 페슬로 균질화. MV-1 용액의 ~ 1 mL로 각 마이크로 페슬을 헹구고. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
      참고: 작은 척추동물의 경우 2개의 유리 마이크로페스트와 1.7mL 튜브가 필요합니다.
  3. 큰 척추동물 표본의 균질화(표 4 및 표 5)
    1. 전사 파이펫을 사용하여, 다진 티슈를 PTFE 유봉으로 55 mL Potter-Elvehjem 유리 조직 분쇄기로 옮기고 오버헤드 교반기에 부착한다. 균질화되는 특정 CNS 부분에 따라 MV-1 용액의 권장 부피의 절반을 추가한다(표5).
    2. 매우 낮은 속도 (~ 150 rpm)에서 오버 헤드 교반기의 켜고 조심스럽게 약 30 s에 대한 위아래로 유리 튜브를 이동합니다.
    3. 오버헤드 교반기의 끄기, MV-1 용액 을 더 추가하고, 균일한 슬러리를 얻을 때까지 4.3.2 단계를 반복합니다.
    4. 50 mL 원엽 튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    5. 각 CNS 조직 균질화 사이에 탈이온수로 분쇄기를 세척합니다.
      참고: 백색 물질의 유무에 관계없이 큰 척추동물 5 또는 4의 경우 각각 50mL 원추형 튜브가 필요합니다. 마찬가지로, 두 (2) 15 mL 원추형 튜브 는 시상 하 부와 뇌 하 수 체에 필요한.

5. 마이크로 혈관 정화

  1. 원심분리기 조직은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 4.2.1 단계, 4.2.2 또는 4.3.4에서 유래한다. 미엘린의 큰 흰색 인터페이스는 붉은 미세 혈관의 펠릿의 상단에 형성됩니다. 상급자를 버리십시오.
    1. 작은 척추 동물 표본(표 2 및 표 3)
      1. 5 mL의 혈청학적 파이펫 (~10 플러시)으로 얼음 차가운 MV-2 용액 5 mL에서 피질, 소뇌, 뇌간, 광엽 및 척수 펠릿을 다시 중단하십시오. 각 서스펜션에 5mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하고 튜브를 뒤집어 조심스럽게 섞습니다.
      2. MV-2 용액 1 mL로 시상 하부 및 뇌하수체 펠릿을 다시 중단하십시오.
    2. 큰 척추 동물 표본(표 4 및 표 5)
      1. 피질, 소뇌, 뇌간 및 척수 미세 혈관 펠릿에 20 mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하십시오. 튜브 리볼버 셰이커에 혼합하여 펠릿을 다시 중단하고 40 rpm에서 ~ 5 분 동안 교반하십시오.
      2. 5 mL 혈청학적 파이펫 (~10 플러시)으로 MV-2 용액의 5 mL에서 시상 하부 및 뇌하수체 미세 혈관 펠릿을 다시 중단하십시오. 서스펜션에 5mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하고 튜브를 뒤집어 조심스럽게 섞습니다.
  2. 4°C에서 15분 동안 4,400 x g의 원심분리기.
  3. 조심스럽게 천천히 튜브를 회전하고 상층이 벽을 따라 통과 할 수 있도록하여 각 튜브의 벽에서 액체 인터페이스에 두껍고 조밀 한 myelin 층을 분리합니다.
  4. 미엘린과 액체 인터페이스를 버리고 각 튜브의 내부 벽을 낮은 보풀 종이 닦음으로 감싼 주걱으로 얼룩지십시오. 작은 척추 동물 표본의 경우, 전사 파이펫으로 조심스럽게 흡입하여 각 시상 하부와 뇌하수체 튜브에서 미엘린 층을 제거하십시오.
  5. 꼬인 낮은 보풀 종이 닦음으로 여분의 액체를 닦아냅니다. 낮은 바인딩 팁을 사용하여 MV-3 용액 1mL로 각 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.

6. 마이크로 용기 용출 및 여과

  1. 각 CNS 영역에 대한 개별 비커에 얼음 차가운 MV-3 용액을 붓습니다. 4 °C에서 유지합니다.
    1. 작은 척추동물 표본의 경우 50mL 비커당 10mL의 MV-3 용액을 사용하십시오. 광학 엽이 포함되는지 여부에 따라 총 6-7개의 비커가 필요합니다.
    2. 큰 척추동물 표본의 경우 100mL 비커당 30mL의 MV-3 용액을 사용하십시오. 백색 물질이 포함되어 있는지 여부에 따라 총 6-7 개의 비커가 필요합니다.
  2. 50 mL 원엽 튜브 위에 세포 스트레이너를 놓습니다. CNS 리전당 하나를 사용합니다. 피질, 뇌간, 광학 엽, 척수 및 뇌하수체에 100 μm 스트레이너를 사용하십시오. 소뇌와 시상 하부70 μm 세포 여과기를 사용하십시오.
  3. 얼음 차가운 MV-3 용액 1 mL로 각 스트레이너를 적시세요.
  4. 응집체를 피하기 위해 혼합하는 동안 혈청학적 파이펫으로 5.5 단계에서 제조된 현탁액에 더 많은 MV-3 솔루션을 추가합니다. 조심스럽게 스트레이너 위에 마이크로 선박을로드합니다. 얼음으로 차가운 MV-3 용액으로 헹네하십시오.
    1. 작은 척추 동물 표본(표 2 및 표 3)의경우 혈청 학적 파이펫으로 MV-3 용액 10-15 mL을 추가하고 MV-3 용액 5 mL로 헹구습니다.
    2. 큰 척추 동물 표본의 경우 혈청 학적 파이펫으로 MV-3 용액 20 mL을 추가하고 MV-3 용액 10 mL로 헹급하십시오.
  5. 수정된 필터홀더(그림 2D)에 20 μm 나일론 그물 필터를 배치하여 여과 유닛을 조립합니다(그림 2D),CNS 영역당 하나.
    1. 작은 척추동물표본(표 2 및 표 3)의경우 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 및 척수에 대해 25mm 변형 필터 홀더를 사용합니다. 시상 하부와 뇌하수체에 13mm 변형 필터 홀더를 사용하십시오.
    2. 큰 척추 동물 표본(표 4 및 표 5)의경우 피질, 소뇌, 뇌간 및 척수에 대해 47mm 변형 필터 홀더를 사용합니다. 시상 하 부와 뇌 하 수 체에 대 한 25 mm를 사용 하 여.
  6. 50mL 원추형 튜브와 습식 필터 위에 5mL의 얼음-차가운 MV-3 용액을 장착하여 버퍼가 원추형 튜브에 필터 홀더를 쏟아붓도록 합니다.
  7. 용출 된 마이크로 혈관 (단계 6.4에서)을 20 μm 나일론 그물 필터 위에 옮기고 얼음 차가운 MV-3 용액 5-10 mL로 마이크로 혈관을 헹구습니다.
  8. 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 회수하고 6.1단계에서 제조된 얼음 차가운 MV-3 용액을 함유하는 비커에 담급질한다.
  9. 약 30초 동안 부드럽게 흔들어 서 필터에서 마이크로 혈관을 분리합니다. 작은 척추 동물 표본의 경우 15 mL 원추형 튜브에 비커 함량을 붓습니다. 큰 척추 동물 표본의 경우 비커 함량을 50 mL 원추형 튜브에 붓습니다.
  10. 2,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고, 저결합 파이펫 팁을 사용하여 1 mL의 얼음-차가운 MV-3 용액으로 펠릿을 재중단시켰다.
    1. 작은 척추동물 표본의 경우, 현탁액(6.10단계)을 1.7mL 미세원심지 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 옮니다.
      참고: 이 스핀은 강력한 수율을 보장하기 위해 최대 속도(~20,000 x g)의벤치탑 원심분리기에서 수행됩니다.
    2. 큰 척추 동물 표본의 경우, 5.0 mL 미세 원심 분리 튜브로 단계 6.10에서 현탁액을 전송, MV-3 용액의 4 mL를 추가하고, 4 °C에서 5 분 동안 2,000 x g에서 원심 분리.

7. 면역 염색

참고: 헤마톡신 및 에오신(H&E) 염색은 프로토콜 타당성의 개념 증명으로 파충류, 수륙 양용 및 어패류 표본에서 수행되었습니다. 따라서, 이 견본을 위한 면역 표지를 위한 추천이 없습니다.

  1. 미세 원심 분리튜브에서 상급체를 제거합니다.
  2. 저결합 파이펫팁(재료 표)을사용하여 1x 멸균 PBS에서 펠릿을 다시 놓습니다. 여러 번 파이펫팅하여 미세 혈관이 응집체를 형성하지 못하게하십시오. 작은 척추 동물 표본(표 3)의경우 펠릿 크기에 따라 ~ 100 μL-2,000 μL을 사용하십시오. 큰 척추 동물 표본(표 5)의경우 펠릿 크기에 따라 ~ 1,000 μL-4,000 μL을 사용하십시오.
  3. 낮은 바인딩 파이펫 팁을 사용하여, 잘 슬라이드에 미세 혈관을 전송, 측면 벽을 피하면서, 각 우물의 중심에 추가조심.
  4. BSC-2 내부에 잘 미끄러지기, 덮여, 설정하고 RT에서 20~30 분 동안 건조시키십시오.
    참고: 골재 형성을 피하기 위해 비교적 많은 부피가 1x PBS로 사용됩니다. 이 때문에, 마이크로 혈관이 폴리 D-리신 코팅에 의해 개최되고 있는지 확인하기 위해 고정하기 전에 슬라이드를 건조하게 할 필요가있다.
  5. 이송 파이펫으로 파이펫팅하여 잔류 1x PBS를 제거하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)의 200 μL을 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
  6. 파이펫을 꺼내 서 RT에서 5 분 동안 1x PBS의 200 μL로 3 x를 세척하십시오.
    참고 : 물고기, 수륙 양용 및 파충류 CNS 마이크로 선박에 H & E 염색이 시점에서 수행되었다.
  7. 웰 슬라이드에 200 μL의 블로킹 버퍼를 넣고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
  8. 이송 피펫으로 차단 완충제를 제거하고 1차 항체 칵테일의 200 μL을희석항체(표)에첨가한다. 밤새 4°C에서 배양합니다.
  9. 1차 항체 칵테일을 파이펫아웃하고 RT에서 5분 동안 1x PBS의 200 μL로 3x를 세척합니다.
  10. 1x PBS로 희석된 이차 항체 칵테일(재료표)을적재하고 RT에서 2시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
  11. 이차 항체 칵테일을 파이펫 아웃하고 RT에서 5 분 동안 1 x PBS의 200 μL로 3 x를 씻어 빛으로부터 보호합니다. 마지막 세척 후 잘 슬라이드의 프레임을 분리하고 낮은 보풀 종이 닦아 여분의 1x PBS를 블롯 건조.
  12. 핵 염색을 위해 커버슬립, 액체 안티페이드 마운트 매미, 4′,6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)를 추가합니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 밤새 건조시키세요.
  13. 건조가 끝나면 공초점 현미경 및 데이터 수집준비가 될 때까지 4°C의 슬라이드 박스의 빛으로부터 보호하십시오.

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결과

뮤린 CNS로부터 분리된 미세혈관은 신경혈관 단위2,3의모든 내재세포 성분을 보였다. 내피 세포에 대한 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM, CD31이라고도 함) 또는 isolectin IB4 (내피 세포 글리코칼릭스를 결합하는 당단백질)를 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFRβ) 또는 신경-신경교 항원 2(NG2)는 성상 세포종말피트를 위한 구혈구 및 아쿠아포린-4(AQP4)에 대해(그림 3A, B)이러한 본질적인 성분이 단리된 마이크로혈관에 존재한다는 것을 보여준다. 가시적인 CNS 영역은 피질 미세혈관(도3B),소뇌(도3

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토론

BBB는 CNS 항상성에 중요한 단단한, 부착-, "페그 소켓"- 접합부 및 CNS 항상성에 중요한 접착 플라크의 정교한 아키텍처에 의해 결합된 뇌 미세 혈관 내피 세포의 독특한특성을포함한다2,3,19. 내피 세포 특성은 주위 세포및 주변 아스트로글리아 말발 공정2,3,19에의해 유도 및 유지된다. BBB 미세혈관구조는 극성(즉, 발광 또는 분수 내피 세포 표면에 국한된 단백질의 비대칭 발현패턴)(20)을표시한다. 이 간단 하 게 BBB를 정의할 수 있습니다 하는 동안, 현실에서 그것은 신경 과학에서 가장 수수께끼 개념 중 하나 남아. 예를 들어, NVU ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

크루즈 오렌고 박사는 캘리포니아 대학, 데이비스, 수의학 창업 기금의 학교에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10X PBSThermoFisherBP39920차단 및 항체 희석제에 사용됩니다.
20% PFA전자 현미경 과학15713-S고정제로 사용(4% PFA)
70,000MW DextranMillipore Sigma9004-54-0MV-2 솔루션에 사용
Adson ForcepsFine Science Tools(FST)11006-12근육 및 피부 제거에 사용
Adson Forceps, 학생 품질FST91106-12위와 동일하지만 더 저렴한
소 혈청 알부민 (BSA)Millipore SigmaA7906-100GMV-3 용액, 차단 및 항체 희석제에 사용
Corning 100 μ m 세포 여과기Millipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m 세포 여과기Millipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork 낮은 바인딩 팁Millipore SigmaCLS4151아래와 동일하지만 더 저렴합니다.
Cultrex 폴리 D- 라이신R & D3439-100-01슬라이드 코팅에 사용
당나귀 안티 염소 IgG-ALEXA 555ThermoA214322 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 마우스 IgG-ALEXA 488ThermoA212022 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 토끼 IgG-ALEXA 488ThermoA212062 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 안티 토끼 IgG-ALEXA 647ThermoA315732 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
당나귀 항 쥐 IgG-DyLight 650ThermoSA5-100292 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
이중 갈래 조직 선택FST18067-11수막 및 맥락막 신경총 제거에 사용
Dumont #3c ForcepsFST11231-20보다 섬세하거나 작은 CNS 조직 처리(예: 뇌하수체)에 사용
Dumont #7 ForcepsFST11274-20CNS tisssue 해부 및 취급에 사용
Dumont #7 Forceps, studentFST91197-00위와 동일하지만 저렴한
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention 팁Eppendorf22493008위의 팁보다 품질이 우수합니다(더 비쌉니다).
엑스트라 파인 Graefe 집게, 톱니 모양의FST11151-10뼈 제거에 사용되는
고급 가위, 날카로운FST14060-09돼지와 원숭이 경막 주머니 제거에 사용
유리 유봉 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 조직 분쇄기 균질화기, 10개 팩Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10작은 vetebrate 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
염소 항-CXCL12, 비오틴화PeproTech500-P87BGBT모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 희석량: 1:20.
염소 안티 JAM-BR & DAF1074신경염증을 평가하기 위한 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
염소 안티 마우스 IgG-ALEXA 488ThermoA110012 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티 마우스 IgG-ALEXA 555ThermoA214242 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티-PDGFR&베타;R& DAF1042모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
염소 항 토끼 IgG-ALEXA 555ThermoA212492 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 안티 토끼 IgG-DyLight 488Thermo355522 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
염소 항 쥐 IgG-DyLight 650ThermoSA5-100212 차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Graefe 집게, 곡선 팁, 1X2 이빨FST11054-10나일론 필터 그물 고정 및 흔들기에 사용
, 칼슘 및 마그네슘이 함유 된 1X 완충액Corning21-022-CMMV-1 용액
HEPES, 1M 액체 완충액Corning25-060-CIMV-1 용액에 사용
Isolectin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414콩과 식물 Griffonia simplicifolia에서 분리된 당단백질은 내피 세포 glycocalysx의 D-갈락토실 잔기에 결합합니다. 조류 및 돼지 CNS 미세혈관에 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
LaGrange 가위, 톱니 모양의FST14173-12두개골 해부 및 후판 절제술에 사용(돼지 및 원숭이 제외)
Millicell EZ 슬라이드 8웰 유닛Millipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500모든 표본의 CNS 미세혈관에 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-GGT1Abcamab55138모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 안티 휴먼 CD31R& DBBA7영장류 CNS 미세혈관의 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 16.5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-NFMThermoRMO-270모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
마우스 anti-αSMAThermoMA5-11547모든 표본의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
나일론 필터 네트, 롤Millipore SigmaNY6000010직경 13mm의 필터 네트 디스크로 레이저 절단. 작은 vetebrate 시상 하부 및 뇌하수체에 사용됩니다.
나일론 여과망, 25 mmMillipore 시그마NY2002500시상하부와 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물, CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
나일론 필터 네트, 47mmMillipore SigmaNY2004700시상하부와 뇌하수체를 제외한 원숭이와 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
ThermoFisherP36935가 포함된 ProLong Gold 퇴색 방지 시약슬라이드를 커버슬립하는 데 사용됩니다.
Rabbit anti-AQP4Millipore SigmaA5971모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Rabbit anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rabbit anti-NG2Millipore SigmaAB5320모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
Rabbit anti-OSPAbcamab53041모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 1 μ g/mL입니다.
토끼 항-VE-CadherinAbcamab33168모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rabbit anti-ZO-1Thermo61-7300모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
쥐 항 CD31Becton DickinsonBD 550274쥐 CNS 미세혈관의 1차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Rat anti-GFAPThermo13-0300모든 검체의 CNS 미세혈관에서 1차 항체로 사용됩니다. 1:200의 권장 희석량.
쥐 항 VCAM-1Becton DickinsonBD 553329신경 염증을 평가하기위한 1 차 항체로 사용됩니다. 권장 농도: 5 μ g/mL입니다.
Sterile Ringer's Solution, FrogAldon CorporationIS5066암피비아 마취에 사용
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355비오틴화된 1차 항체를 라벨링하기 위한 2차 항체로 사용됩니다. 1:500의 권장 희석.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357비오틴화된 1차 항체를 라벨링하기 위한 2차 항체로 사용됩니다. 1:500의 권장 희석.
수술 용 가위, 날카로운FST14002-12근육 및 피부 제거에 사용
수술 용 가위, 날카롭게 뭉툭한FST14001-16참수에 사용 (돼지 및 원숭이 제외)
Swinnex 필터 홀더, 13mmMillipore SigmaSX0001300레이저 컷으로 수정. 작은 vetebrate 시상 하부 및 뇌하수체에 사용됩니다.
Swinnex 필터 홀더, 25mmMillipore SigmaSX0002500레이저 컷으로 수정됨. 시상하부와 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물, CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
Swinnex 필터 홀더, 47mmMillipore SigmaSX0004700레이저 컷으로 수정되었습니다. 시상하부와 뇌하수체를 제외한 원숭이와 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277차단 및 항체 희석제에 사용됩니다.
Wheaton 120 Vac 오버헤드 교반기VWR(공급업체 DWK Life Sciences)62400-904(DWK #903475)시상하부 및 뇌하수체를 제외한 55mL 조직 분쇄기가 있는 원숭이 및 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
PTFE 유봉이 있는 Wheaton Potter-Elvehjem 티슈 그라인더, 10mLVWR(공급업체 DWK Life Sciences)14231-384(DWK #357979)시상하부 및 뇌하수체를 제외한 대부분의 작은 척추동물 CNS 조직에 사용됩니다. 원숭이와 돼지, 시상 하부와 뇌하수체에 사용됩니다.
PTFE 유봉이 있는 Wheaton Potter-Elvehjem 티슈 그라인더, 55mLVWR(공급업체 DWK Life Sciences)14231-372(DWK #357994)시상하부 및 뇌하수체를 제외한 원숭이 및 돼지 CNS 조직에 사용됩니다.
DAPI

참고문헌

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