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방법 논문

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

6.4K 조회수

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DOI:

10.3791/60297

⸱

2020년 1월 8일

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형 균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

초록

미생물은 유전적으로 다재다능하고 다양하며 많은 상용 제품 및 바이오 의약품의 주요 공급원이 되었습니다. 이러한 제품 중 일부는 자연적으로 유기체에 의해 생산되지만, 다른 제품은 생산의 수율을 높이기 위해 유기체의 유전 공학을 필요로한다. 대장균의 Avirulent 균주는 전통적으로 바이오 의약품을 생산하기위한 바람직한 세균 종이었다; 그러나 일부 제품은 대장균을 생산하기가 어렵습니다. 따라서, 다른 세균성 종의 avirulent 긴장은 몇몇 상업적인 제품의 생산을 위한 유용한 대안을 제공할 수 있었습니다. 슈도모나스 녹농균은 대장균에적합한 대안을 제공할 수 있는 일반적이고 잘 연구된 그람 음성 박테리아입니다. 그러나, P. aeruginosa는 기회 인간 병원체입니다. 여기서, 우리는 pEX100T-NotI 플라스미드를 이용한 순차적 게놈 삭제를 통해 P. aeruginosa의 비병원성 균주를 생성하는데 사용될 수 있는 절차를 상세히 설명한다. 이 방법의 주요 장점은 마커없는 변형을 생성하는 것입니다. 이 방법은 상용 제품의 생산을 위한 고도로 감쇠된 P. aeruginosa 균주를 생성하거나, 또는 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하기 위하여 이용될 수 있다. 우리는 또한 대장균의 FDA 승인 BL21 긴장에 비해 유전자 조작 균주의 감쇠를 테스트하기 위해 검증 된 테스트 균주의 복강 내 주입을 통해 세균 성 전신 감염의 간단하고 재현 가능한 마우스 모델을 설명합니다.

서론

슈도모나스 녹농균은 인간, 특히 면역 손상에서 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수있는 기회 세균성 병원체입니다. P. aeruginosa의 병원성은 프로테아제 및 리포폴리사카라이드를 포함한 많은 독성 인자의 발현뿐만 아니라 보호생물막을형성하는 능력에 기인한다 1. 때문에 독성 요인을 생성하고 인간에서 질병을 일으킬 수있는 능력, 상용 제품을 만들기 위해 P. aeruginosa를 사용하여 안전 문제를 제시. 대장균의 비병원성 균주는 전통적으로 인간의 사용을 위해 의료 및 상업용 제품을 생체 공학하는 데 사용되어 왔습니다. 그러나 일부 제품은 대장균을 만들기가 어렵고, 많은 제품이 포함 기관에 포장되어 추출이 힘들다. 특정 제품을 만들고 분비할 수 있는 능력을 가진 엔지니어링된 세균성 균주는 수율을 증가시키고 정화 과정을 용이하게 하기 때문에 매우 바람직합니다. 따라서, 다른 종의 박테리아(예를 들어, 더 많은 분비 경로를 이용하는 종)의 비병원성 균주는 대장균에유용한 대안을 제공할 수 있다. 우리는 최근에 유기체의 병원성 및 독성이 고도로 감쇠되는 P. aeruginosa,PGN5의 균주의 발달을 보고했다2. 중요한 것은, 이 균주는 여전히 다당류 알긴산, P. aeruginosa 생물막의 상업적으로 흥미로운 성분을 대량생산한다.

PGN5 균주는 5개의유전자(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)를순차적으로 삭제하기 위해 pEX100T-NotI 플라스미드와 2단계 알레릭 교환 절차를 사용하여 생성되었으며, 이는 유기체의 병원성에 기여하는 것으로 알려져 있다. pEX100T-NotI는 허버트 슈바이저의 실험실3,4에서개발된 플라스미드 pEX100T의 다중 복제 부위 내에서 Ti 제한 효소 인식 부위로 SmaI를 변경하여 생성되었다. 제한 효소 NotI에 대한 인식 부위는 SmaI에 비해 드문 DNA 서열이며 복제되는 서열에 존재할 가능성이 적고, 따라서 복제 목적으로 더 편리하다. 플라스미드는 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 ß-lactamase를 인코딩하고 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 블라 유전자와 자당에 대한 민감성을 부여하는 B. subtilissacB 유전자를 포함하여 선택을 허용하는 유전자를 운반합니다(그림 1A). 플라스미드는 또한 대장균과호환되는복제(ori)의기원을 가지고 있으며, 대장균에서 슈도모나스 종으로 플라스미드 이송을 허용하는 이송(oriT)의 기원을 컨쥬게이션을 통해 전달한다. 그러나, 플라스미드는 슈도모나스와호환되는 복제의 기원이 결여되어 있으며, 따라서 슈도모나스 종 내에서 복제할 수 없다(즉, 슈도모나스 자살 벡터). 이러한 특성은 pEX100T-NotI를 슈도모나스 염색체로부터의 유전자 삭제를 표적으로 하는 데 이상적입니다. 플라스미드 클로닝 단계는 대장균을 사용하여 수행되고 결과 플라스미드는 변형 또는 컨쥬게이션에 의해 슈도모나스로 이송된다. 그런 다음, 상동 재조합 이벤트 및 선택적 단계를 통해, 표적 인프레임 삭제가 생성되고, 마커가 없는. P. aeruginosa의 염색체에서 게놈 지구를 순차적으로 삭제하는 이 방법은 PGN5같이 고도로 감쇠된 슈도모나스 균주를 생성하거나, 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하는 데 사용될 수 있습니다(예를 들어, 단백질의 플라스미드 전파 또는 균주 결핍에 대한 종부 결핍균에 대한 균주 결핍).

박테리아의 긴장의 전반적인 독성은 돌연변이가 빈번히 생기는 동안 성장 조건 및 단계에 의해 영향을 받습니다. 따라서 유전자 조작 균주의 안전도를 측정하는 것은 어려울 수 있습니다. 전신 독성에 대한 세균 분리를 평가하기 위해, 우리는 C57BL/6 마우스5의복강 내 주사에 의한 감염의 이전에 발표된 프로토콜을 적용하였다. 우리는 주입을 위해 냉동 세균성 주식을 사용하기 위하여 이 절차를 수정했습니다, 사용된 긴장의 정확한 주입 그리고 쉬운 검증을 허용했습니다. 이 모델에서, 바이오 의약품의 생산을 위해 FDA 승인을받은 대장균 균주 BL21은, 균주6,7,8의상대적인 병인을 결정하기 위한 제어 안전성 표준으로 사용되었다. 이 방법을 사용하는 주요 장점은 감염 균주가 감염 전후 의 세균 세포 수, 표현형 및 유전 마커에 대해 검증되기 때문에 재현 가능하고 변이의 근원을 최소화한다는 것입니다. 이러한 제어 단계를 통해 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 이 모델에서, C57BL/6 murine 사망률을 초래하는 P. aeruginosa 균주는 복강 내 주입시 대장균 BL21보다 동일하거나 더 적은 것으로 간주될 수 있다. 감염의 이 간단한 마우스 모형은 또한 참조로 FDA 승인된 대장균 긴장을 사용하여 그밖 종에게서 유전으로 조작된 긴장의 감쇠된 병원성을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 단계 1-7은 P. aeruginosa에서 순차적 게놈 결실의 생성을 상세히(도 1)및 단계 8-12 단계는 P. aeruginosa 균주의 병원성을 시험하기 위하여 마우스 모형의 사용을 상세히.

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프로토콜

동물 실험을 시작하기 전에 사용할 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아야합니다. 설명된 프로토콜에 대한 승인은 마샬 대학교(미국 헌팅턴, WV)의 IACUC를 통해 획득되었습니다.

1. 플라스미드 디자인

  1. pEX100T-NotI 플라스미드를 사용하여 유전적 결실을 생성하기 위해, 원하는 결실 서열을 측면으로 하는 DNA 의 영역을 복제하고 플라스미드의 NotI 제한 부위에 삽입한다. 플라스미드 인서트에는 표적 결실 서열의 약 500개의 뉴클레오티드 하류에 직접 인접한 표적 서열의 상류에 대한 약 500개의 뉴클레오티드를 함유해야 한다. 또한, 인서트에는 5' 및 3' 말단에서 NotI 인식 시퀀스(GCGGCCGC)가 포함되어야한다(도 1B).

2. 플라스미드 준비

  1. 옵션 1: 기존 복제 절차를 활용합니다. PCR을 사용하여 관심 있는 유전자의 상류 및 하류에 게놈 영역을 증폭시키고, 그 다음에 크로스오버 PCR9,10생성된 단편, PCR 생성물 및 플라스미드의 제한 엔도뉴클레스 소화, 및 결찰11(도 1B,C)을결합한다.
  2. 옵션 2: 실리코에서 삭제 시퀀스를 설계한 후, 플라스미드 pEX100T-NotI에 삽입하기 위해 합성하는 de novo를 합성하는 회사를 계약합니다. 많은 기업들이 신속하고 효율적으로 관심의 플라스미드를 생성하기 위해 복제 프로세스를 간소화했습니다. 추가적으로, 서열은 플라스미드가 전달되기 전에 돌연변이가 없는 것을 확인한다.

3. 대장균 변환

  1. 제조업체의 권장 사항에 따라 플라스미드로 전기 유능한 대장균을 변환하십시오. 멸균 접종 루프를 사용하여, 미리 온난한 루리아 국물 (LB) 한천 플레이트에 고립 된 식민지에 대한 변형 반응의 10 μL을 카베니실린 100 μg / mL로 보충하고 37 °C에서 밤새 배양합니다.
    참고: 배양 박테리아에 사용되는 모든 장비와 매체는 기관의 안전 지침에 따라 취급되어야 합니다.
  2. 두 번 통로.
    1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 분리된 콜로니를 식별합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여, 식민지를 선택하고 고립 된 식민지에 대한 카르베니실린의 100 μg / mL로 보충 된 미리 따뜻하게 LB 한천 접시를 줄무늬. 37 °C에서 하룻밤 배양. 이 단계를 다시 반복하여 순수한 문화어를 생성합니다.
  3. 멸균 접종 루프를 사용하여, 최종 한천 플레이트에서 단일 콜로니로 LB의 5 mL을 접종합니다. 배양을 37°C에서 하룻밤 동안 흔들리는 인큐베이터에 놓는다. 다음날, 이 배양물의 1 mL을 1 mL의 저온 에 5%와 혼합하고 -80°C에서 저장하여 균주의 동결 된 스톡을 생성한다.

4. 세균성 긴장 준비 및 삼부모 적 연상

  1. 다음 균주의 한천 플레이트에서 단일 분리 된 콜로니를 사용하여 국물 배양물을 접종하고 37 °C에서 밤새 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
    1. 대장균 pEX100T-NotI를 5 mL의 LB에 넣고 100 μg/mL의 카베니실린을 보충합니다.
    2. P. aeruginosa 균주 PAO1을 슈도모나스 절연 국물 (PIB)의 5 mL에 추가하십시오.
    3. 대장균 prk2013을 5 mL의 LB에 넣고 카나마이신 50 μg/mL로 보충했습니다.
      참고 : prk2013 플라스미드는 대장균에서 복제되지만 P. aeruginosa에서복제되지 않는 도우미 플라스미드입니다. 대장균 공여자로부터 P. aeruginosa 수용자(12)까지pEX100T-NotI 플라스미드를 동원하는 트랜스-액이징 전달 유전자를 운반한다. P. aeruginosa는 생물 안전성 수준 2 (BSL-2) 병원체입니다. BSL-2 유기체와 함께 작업 할 때 안전에 대한 기관의 지침을 따르십시오.
  2. 다음날, 인큐베이터로부터 하룻밤 배양을 제거하고 각 배양액의 0.5 mL를 1.5 mL 의 미세원심지 튜브에 첨가한다. 원심분리기는 5분 동안 6,000 x g에서 5분 간. 상급체를 버리고 LB의 50-100 μL에서 세포 펠릿을 일시 중단한다.
  3. 전체 셀 현탁액을 한 방울에 미리 데운 LB 한천 플레이트에 파이펫합니다. 물방울이 건조되도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 반전시키고 4-6 시간 동안 37 °C에서 배양합니다.
  4. 배양 후, 살균 접종 루프를 사용하여 세포를 마이크로 원심 분리튜브에서 1 mL의 LB로 수집합니다. 피펫을 위아래로 하여 세포를 혼합합니다.
  5. 세포 스프레더를 사용하여, 줄무늬 세포는 카르베니실린의 300 μg/mL로 보충된 건조한 미리 온난한 슈도모나스 격리 한천(PIA) 플레이트에 고르게 발라주며, 카르베니실린을 300 μg/mL로 보충하였다. 세포 혼합물의 부피가 증가하는 다중 플레이트(예를 들어, 10 μL, 100 μL, 500 μL). 37 °C에서 하룻밤 배양.

5. P. aeruginosa의 단일 크로스 오버 재조합의 검출

  1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 분리 된 카베니실린 내성 식민지를 검사하십시오. pEX100T-NotI 플라스미드는 P. aeruginosa에서복제할 수 없기 때문에, 카르베니실린 보충판에서 자란 식민지는 플라스미드가 염색체에 통합된 세포에서 생겨났어야 합니다.
    1. 이 콜로니 중 적어도 4개를 선택하고 300 μg/mL의 카르베니실린으로 보충된 PIA의 미리 따뜻한 접시에 격리하십시오. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 플레이트.
  2. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장을 검사합니다. 카르베니실린 내성 콜로니는 단일 크로스오버 재조합제(즉, 플라스미드 삽입의 상동 영역과 P. aeruginosa의염색체 사이의 재결합 이벤트를 통해 염색체 내로 플라스미드를 통합한 것)이어야 한다.
    1. 미리 따뜻해진 접시에 멸균 이쑤시개를 장착한 8개 이상의 콜로니를 1) 300 μg/mL의 카르베니실린과 2) PIA보충제로 보충한 카베니실린 300 μg/mL, 10% 자당(글리세롤 제외).
    2. 5.1단계에서 콜로니 성장이 수득되지 않은 경우, 이영을 반복하고 4.5단계에서 줄무늬세포 혼합물의 부피를 증가시켰다. 너무 많은 성장이 발생하면, 컨쥬게이션을 반복하고 줄무늬 볼륨을 감소.
    3. 컨쥬게이션이 반복적으로 실패하면 P. aeruginosa 균주의 전기 유능한 세포를 준비하고 pEX100T-NotI 플라스미드로 직접 변형시킵니다. 전기 유능한 P. aeruginosa 및 변환의 준비를 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있습니다13,14.
  3. 하룻밤 동안 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.
  4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장을 검사합니다. 진정한 단일 크로스 오버 재조합 될 것입니다 carbenicillin 저항 하 고 자 당 에 민감한 (즉, 카베니실린보충 PIA에 성장 하는 식민지, 하지만 카베니실린과 자당 보충 PIA에 성장 하지 않았다).
    1. 4 개 이상의 진정한 단일 크로스 오버 재조합을 선택하고 선택하지 않고 LB의 5 mL로 각각 접종. 37°C에서 밤새 교반된 인큐베이터에 인큐베이터를 배양한다.
    2. 단일 크로스오버 재조합이 발견되지 않은 경우, 컨쥬게이션을 반복합니다.

6. P. aeruginosa의 이중 크로스 오버 재조합의 검출

  1. 각 국물 배양에 대해, 10%의 자당(글리세롤 제외)과 고립된 콜로니를 위한 줄무늬로 보충된 미리 따뜻한 PIA 접시에 10 μL의 배양을 접종합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 플레이트.
  2. 다음 날, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 성장을 검사합니다. 자당 내성 콜로니는 이중 크로스오버 재조합이어야 한다(즉, 플라스미드 삽입물의 다른 상동성 영역과 P. aeruginosa 염색체 사이의 재조합 이벤트를 통해 염색체로부터 플라스미드를 제거한 것이다).
    1. 멸균 이쑤시개로 최소 20개의 콜로니를 미리 데운 접시에 1) PIA, 2) 10% 자당(글리세롤 제외) 및 3) 카베니실린 300 μg/mL로 보충한 PIA로 보충한 PIA.
  3. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 플레이트.
  4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장을 검사하십시오. 진정한 더블 크로스 오버 재조합 카베니실린에 민감하고 자당 에 저항 할 것이다 (즉, 자당으로 보충 PIA와 PIA에 성장 식민지, 하지만 카베니실린 보충 PIA에 성장하지 않았다).

7. 식민지 PCR을 통한 유전자 삭제 확인

  1. PCR로 삭제 화면을 위해 10-20 개의 식민지를 준비하십시오.
    1. 멸균 이쑤시개를 가진 의심되는 이중 크로스오버 재조합으로부터 성장을 포착하고 1x 인산완충식염수(PBS)의 50 μL에서 세포를 현탁시한다. 100 °C에서 10 분 동안 현탁액을 끓이고, 13,000 x g에서3 분 동안 원심 분리기를 한 다음 얼음위에 놓습니다.
  2. 대상 삭제에 대 한 콜로니를 화면 PCR을 수행 합니다.
    1. 관심 있는 유전자의 결실을 확인하기 위해 25 μL PCR 반응에서 주형의 1 μL을 템플릿으로 사용한다.
    2. 게놈 결실의 영역을 증폭시키는 유전자 특이적 프라이머를 사용한다. 게놈 결실 의 영역을 증폭시키는 프라이머와 100-200 bp의 측면 업스트림 및 다운스트림 서열을 사용하십시오.
    3. 모 균주(예를 들어, PAO1)와 별도의 대조군 PCR 반응을 준비한다.
      참고: 써모사이클러 조건은 프라이머 쌍의 최적 어닐링 온도, 사용된 폴리머라제 칵테일 및 증폭될 영역의 길이에 따라 달라집니다.
  3. PCR 제품에 아가로즈 겔 전기 동동을 수행합니다. 관심 영역이 삭제된 콜로니는 결실이 결여된 콜로니보다 더 작은 증폭 생성물을 산출한다(그림2).
  4. PCR이 확인된 삭제를 통해 하나 이상의 콜로니를 선택합니다. 미리 온난한 PIA 플레이트(들)에 고립된 콜로니를 행진하고 밤새 37°C에서 배양한다.
  5. 적어도 한 번 더 통과하십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 분리된 콜로니를 식별합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 식민지를 집어 들고 고립 된 식민지를 위해 미리 따뜻하게 한 PIA 한천 접시를 줄무늬. 37 °C에서 하룻밤 배양.
  6. 각 최종 플레이트에서 식민지를 선택하고 PIB 의 5 mL을 접종하는 데 사용합니다. 밤새 37°C에서 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
    1. 이 배양물의 1 mL을 1 mL의 5% 탈지 우유를 저온에 혼합하고 -80°C에서 저장하여 균주의 스톡을 생성한다.
    2. 이러한 배양을 사용하여, 균주로부터 게놈 DNA를 준비한다(예를 들어, DNA 정제 키트를 사용). 관심 영역별 PCR 및 프라이머를 사용하여 게놈 결실 영역을 증폭시다.
      1. 이러한 PCR 생성물(예를 들어, DNA 정제 키트, 또는 페놀-클로로폼 추출)을 정제하고 유전자 특이적 프라이머와 직접 서열 또는 플라스미드 특이적 프라이머로 시퀀싱을 위한 벡터로 결찰한다.
  7. 유전자 결실이 시퀀싱을 통해 확인된 후, 새로운 결실 균주와 함께 이 절차를 반복하여 순차적으로 수많은 마커 없는 게놈 결실을 생성한다. 원하는 균주가 생성될 때, 전체 게놈 시퀀싱을 사용하여 표적 삭제를 확인하고 공정 전반에 걸쳐 발생한 게놈에 대한 다른 변화(예를 들어, PAO1참조 균주와 비교)를 검출한다. 유전자에 추가한 후, GenBank에 서열을 입금하고 가입 번호를 기록합니다.

8. 동물 실험을 위한 세균성 긴장의 준비

  1. P. aeruginosa 균주의 감쇠 된 병원성을 테스트하려면 먼저 검증 된 문화와 주식을 준비하십시오. 관심있는 P. aeruginosa 균주, P. aeruginosa의 야생 형 균주 (악성), 및 대장균의 FDA 승인 균주 (예를 들어, BL21)를 준비하여 비 병원성 안전 제어 역할을합니다.
  2. 연속 및 검증 된 냉동 주식에서 선택적 한천에 테스트되는 박테리아의 균주를 줄무늬. 밤새 37°C에서 배양합니다.
  3. 멸균 접종 루프로, 각 균주에서 단일 식민지를 선택하고 다시 선택적 미디어에 고립 된 식민지에 대한 줄무늬. 밤새 37°C에서 배양합니다.
  4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 각 변형률에 대해 LB 플레이트에 격리하려면 단일 콜로니와 줄무늬를 선택합니다.
  5. 37°C에서 24시간 성장한 후, 각 균주로부터 분리된 단일 콜로니로 LB의 250 mL을 함유하는 500 mL 플라스크를 접종하였다.
    1. 유효성 검사 단계: 동일한 콜로니의 잔재를 사용하여, PCR 및 변형특이 프라이머 및/또는 프라이머를 사용하여 균주를 검증하여 균주에 대한 유전자 변형의 존재를 확인합니다. 제시된 예에서 균주의 검증을 위해 아래 프라이머를 사용하십시오.
      대장균 BL21:
      T7 폴리머라제 F:TGGCTCTCTTTACG
      T7 폴리머라제 R:TTACGCGAACGCGAGCC

      VE2 및 PGN5:
      아로아 (aroa) F: GCGAACGCCAACAGCGCAAAAAGC
      아로아 (aroa) R: ATCTGGCGCGGCCGCC
  6. 160 rpm 및 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에서 배양하여 로그 상 성장에 도달할 때까지 배양합니다(즉, 분광광도계에서 0.4-0.6의 OD600 측정).
  7. 로그 상이 달성될 때 얻어진 OD600 값을 사용하여 mL당 2.5 x 109 콜로니 형성 단위(CFU)를 산출하는 데 필요한 국물의 부피를 계산합니다. 펠렛 50 mL 튜브에서 계산 된 국물의 부피 4,500 x g에서 10 분.
  8. 상급체를 버리고 세포를 세척하기 위해 1x PBS의 50 mL을 사용하여 하나의 튜브에 펠릿을 다시 중단하십시오. 4,500 x g에서 10 분 동안 다시 원심 분리기.
  9. 상급을 버리고 1 x PBS에서 5 % 탈지 우유의 25 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
    1. 유효성 검사 단계: 25mL 재서스펜션 샘플을 사용하여 실행 가능한 플레이트 카운트를 수행하여 CFU/mL 수를 결정합니다.
  10. Aliquot 25 mL 탈지 유유 배양 재서스펜션 2 mL 저온 에서 2 mL 배양 주식. 액체 질소에 플래시 동결 및 사용 하기 전에 적어도 하룻밤 -80 °C에서 저장.

9. 동물 실험을 위해 저장된 주식의 성장과 변형의 유효성 검사.

  1. 테스트할 각 균주에 대해 -80°C 저장에서 냉동 된 주식의 적어도 3 개의 cryovials를 제거하고 2-4 시간 동안 4 °C에서 해동하십시오. 냉동 된 재고가 남아있는 경우, 37 °C에서 잠시 따뜻하게.
  2. 각 극저온에서 작은 샘플을 채취하여 각 균주를 검증합니다.
    1. 실행 가능한 플레이트 수를 수행하여 CFU/mL 수를 결정합니다. 몇몇 세균성 세포의 죽음 때문에 동결 후에 더 적은 CFU/mL가 있는 것이 정상입니다.
    2. PCR 및 변형률 별 프라이머를 사용하여 각 균주를 검증합니다.
    3. 표현형을 확인하기 위해 선택적 매체에 각 변형을 줄무늬.
  3. 균주가 올바른 유전자형 및 표현형임을 확인하고 CFU/mL을 검증한 후 동물 실험을 진행합니다.

10. 주입에 의한 세균성 균주를 가진 동물의 접종

  1. 주사의 아침에, 테스트 되는 세균성 균주의 cryovials를 제거 하 고 해 동 4 °C에 대 한 3-4 시간. 해동 0.5 주입 될 각 마우스에 대 한 mL. 해동 후 얼음에 바이알을 유지하고 2 시간 이내에 마우스를 주입하십시오.
  2. 해동 후, 각 cryovial을 새로운 2 mL 튜브 및 원심 분리기로 10 분 동안 4,500 x g으로 옮기고 상체를 버리고 1 x PBS의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
  3. 10m에 대해 4,500 x g에서 다시 원심 분리기를 폐기하고 1x PBS에서 펠릿을 최종 농도 2.5 x 109 CFU/mL로 다시 중단합니다. 재서스펜션에 필요한 1x PBS의 양을 확인하려면 2.2.1단계에서 냉동 된 주식에 대한 실행 가능한 플레이트 카운트에서 얻은 CFU / mL 데이터를 사용합니다. 사용되는 1x PBS의 정확한 양은 균주 사이에 약간 다를 것이다.
    1. 위에서 설명한 대로 각 균주의 최종 현탁액에서 3개의 샘플을 채취하여 CFU/mL, 유전자형 및 표현형을 검증합니다.
  4. 각 균주에 대해, PBS/세포 현탁액의 1.5 mL을 5마우스당 2 mL 튜브1개로 aliquot하여 튜브가 입력되는 횟수를 제한한다. 또한 제어 주사를 위해 1x PBS 튜브를 준비하십시오.
  5. 쥐 (이 실험을 위해 그룹당 10 남성 및 10 여성 C57BL /6)와 주사에 필요한 재료 (주사기, 바늘,날카로운 용기, 마커, 펜 및 종이 등)를 수집합니다. 멸균 동물 수술실로 이동합니다. 살균 물티슈로 모든 표면을 닦으소.
    1. 실험자에게 상해의 고민그리고 리스크를 제거하기 위하여는, 단지 한 번에 수술실에 마우스의 1개의 성 및 실험군을 가지고 (예를 들면, 특정 긴장에 감염되는 10마리의 남성 마우스의 단). 라텍스 장갑 두 켤레를 착용하여 물린 경우 장갑의 펑크를 제거하십시오. 오염을 방지하기 위해 실험실 코트, 안전 안경 및 얼굴 마스크를 착용하십시오.
  6. 1x PBS로 대조군의 주사를 시작합니다. 이 어떤 불리 한 효과 혼자 주입에서 발생 여부를 확인 합니다.
    1. 케이지에서 마우스를 제거합니다. 한 번에 하나의 마우스만 제거합니다.
    2. 마우스를 무게와 체중 감소 후 주입에 대 한 추적 영구 마커와 꼬리를 표시.
    3. 새로운 1 mL 주사기와 27 G 바늘을 열고 (오염을 제거하기 위해 각 마우스에 대한 새로운 주사기와 바늘을 사용)를 열고 멸균 1x PBS 의 200 μL을 주입합니다.
      1. 엄지와 집게 손가락으로 귀 뒤에 마우스를 잡아. 목덜미에 피부 주름을 만들어 고정하십시오 - 더 단단한 주름은 목의 움직임과 주입 중에 물린 위험을 줄입니다. 새끼 를 사용하여 손바닥에 꼬리를 고정하여 마우스를 거의 움직이지 않게 평평하게 잡습니다.
      2. 마우스를 뒤집어 30° 각도로 바늘을 중간선의 왼쪽 또는 오른쪽으로 복강으로 삽입합니다. 바늘을 한 번 삽입하여 장기내 영역이 아닌 복강 내 부위에 삽입되었는지 확인합니다. 천천히 PBS를 주입한 다음 바늘을 철회하십시오.
      3. 사용된 바늘을 지정된 생체 위험 날카로운 용기에 놓습니다. 주사기 나 바늘을 다시 사용하지 마십시오. 주사 부위의 볼루스는 전형적입니다.
    4. 주입 후 마우스를 별도의 케이지로 옮습니다.
    5. 다음 마우스로 절차를 반복합니다. 한 케이지의 모든 마우스가 주입 된 후 즉시 원래 케이지로 되돌리십시오.
  7. 대조군을 주입 한 후, 동일한 절차에 따라 테스트 할 균주의 현탁액을 주입하기 시작합니다.
    1. 세포 현탁액의 200 μL을 주입합니다. 2.5 x 109 CFU/mL의 셀 현탁액으로 시작하면 각 마우스는 5 x 108 CFU를 받습니다.
      참고: 이러한 농도는 각 균주의 치명적인 복용량을 결정하기 위해 예비 동물 연구에 최적화되었습니다. 다른 균주/종에 대 한 조정 해야 할 수 있습니다.
  8. 모든 주사가 완료되면, 고민을 완화하기 위해 하우징 룸에 마우스를 반환합니다. 살균 물티슈로 작업 공간을 청소하십시오.
  9. 죽은 쥐에 대 한 케이지를 확인 하 여 주사 다음 사망에 대 한 동물을 모니터링 3 72 시간 동안 그리고 매 12 시간 대 10 일. 질병으로 인한 체중 감소를 결정하기 위해 12시간마다 마우스의 체중을 기록합니다.
  10. 자세의 차이, 그루밍 또는 잠복 부족, 부동성 또는 호흡 의 변화와 같은 주사 후 몇 시간 동안 불리한 행동을 기록하십시오. 주사와 관련 된 부상에서 사망 하는 쥐 불리 한 행동을 전시 하 고 주사 다음 신속 하 게 죽을 것 이다. 다른 한편으로는, 감염에서 정지하는 마우스는 18 시간 후에 불리한 행동 또는 죽음을 전시하기 시작하지 않을 것입니다. 신속하거나 수고한 호흡, 부동성, 구부러진 자세, 침몰한 눈, 심한 탈수 증세를 포함하여 불리한 행동 또는 광범위한 이환 징후를 보이는 모든 마우스는 불필요한 고통을 줄이기 위해 안락사되어야 합니다(당사의 규정을 준수하는 경우) 승인된 IACUC 프로토콜)을 참조하십시오. 그러나, 우리의 실험에서, 안락사 실험 동안 어떤 마우스에 대 한 요구 되지 않았다. 생존 마우스는 시험 완료 후 10일 동안 안락사시켰다.
  11. 10일 의 모니터링 기간을 거쳐 남은 동물들이 완전히 회복되고 검사 중에 투여된 감염이 제거될 수 있도록 하십시오. IACUC 절차에 따라 동물을 안락사.

11. 동물 사망률 통계 분석

  1. 그래프 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 그래프를 생성하고 통계 분석을 수행할 수 있는 모든 소프트웨어가 적합합니다.
  2. 치수데이터를 플로팅하려면 X 열을 사용하여 시간(h) 및 Y 열을 사용하여 테스트된 그룹을 나타냅니다.
  3. 각각 생존 또는 사망을 나타내는 코드 = 0(0) 또는 코드 = 1을 사용하여 연구에서 각 마우스 또는 주제를 나타낸다.
    1. 죽는 각 동물에 대해 X 열에 사망 시 해당 그룹의 Y 열에 1을 배치합니다. 그룹 내의 단일 시점에서 여러 사망자가 있는 경우 해당 시간 점의 복사본을 X 열에 배치할 수 있습니다. 예를 들어, 그룹 내의 세 과목이 3시간으로 죽으면 3시간 시점이 X 열에 세 번 나타납니다.
    2. 그룹 내의 모든 생존 동물의 경우 측정된 최종 시점에서 Y 열에 0을 배치합니다. 예를 들어 마우스 4개가 살아남으면 Y 열에 4개의 영점으로 표시된 X 열에 4개의 끝 시간점을 배치합니다.
  4. 모든 그룹에 대해 동물 데이터를 입력한 후 생존 그래프 템플릿을 사용하여 생존 그래프를 생성합니다.
    1. 기본 코딩을 0과 1로 둡니다.
    2. 그래프의 매개변수를 백분율로 설정합니다.
  5. 생존 곡선에 대한 매개변수가 선택되면 Mantel-Cox(로그 랭크) 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  6. 통계 데이터를 사용하여 카플란-마이어 플롯 을 포맷합니다.
    참고: 모균종 이하 또는 이와 동등한 사망률을 나타내는 균주 및 FDA 승인 균주(예를 들어, 대장균 BL21)는 감쇠된 것으로 간주될 수 있습니다.

12. 생물 발광 감염의 시각화

  1. 감염의 진행 상황을 시각화하기 위해, PGN5 및 VE2 균주 시험에 염색체 생물 발광 오페론(luxCDABE)을삽입하십시오. 이 긴장을 표지하기 위하여 이용된 플라스미드 및 프로토콜은 Schweizer 실험실에서 개발되고 박테리아13의모든 종/긴장과 호환되지 않을 수 있습니다. 중요한 것은 감염의 시각화는 선택 사항입니다. 따라서, 이러한 오페론의 게놈 삽입은 전술한 사망률 연구를 수행할 필요가 없다.
  2. 위에서 설명한 방법을 사용하여 균주를 준비하고 유효성을 검사합니다. 또한 각 검증 단계에서 표지된 균주에서 생물 발광을 확인합니다.
  3. 균주가 준비된 후, 위의 단계에 따라 생물 발광 균주와 함께 10의 그룹으로 동물을 주입하십시오.
  4. 생물 발광이 가능한 동물 이미징 시스템을 사용하여 24시간 동안 3시간마다 동물을 이미지화합니다.
    1. 먼저 카메라 매개 변수를 설정하고 동물의 무대를 가열하여 이미저를 준비합니다. 또한 산소 흐름을 분당 1.5L(또는 제조업체의 권장 사항 따르기)로 설정합니다.
    2. 이미서와 스테이지가 안정화된 후, 주사 직후 마취챔버에 마우스 1개를 넣고 약 4분 동안O2 흐름을 가진 챔버 내로 3.5% 이소플루란을 투여한다. 마취 방법은 사용되는 약실 및 / 또는 마취제에 따라 다를 수 있습니다. 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 철수 반사 테스트를 통해 적절한 마취를 결정하십시오.
    3. 마우스를 온도 안정화 단계로 이동합니다. 마우스를 팔을 뻗어 뒷면에 놓고 이미징 절차 전반에 걸쳐 2.5 % 이소플루란을 투여하기 위해 코 콘으로 마우스를 맞춥시다.
    4. 문을 닫고 생물 발광 이미지와 마우스의 X 선을 찍습니다.
    5. 이미징이 완료되면 마우스를 케이지로 되돌리고 모니터링합니다. 마우스는 3-5 분 안에 의식을 회복해야 합니다.
    6. 마우스를 24시간 동안 3시간마다 이미지화하고, 매번 각 군에서 상이한 마우스를 사용한다. 마취에 다시 노출되기 때문에 부작용의 가능성으로 인해 24 시간 이내에 마우스를 다시 이미지하지 마십시오. 단일 마우스는 24-36 시간마다 마취의 한 복용량을 받아야합니다. 각 마우스가 이미지 화 된 후 이미징 플랫폼을 청소하십시오. 이미징 시간 지점 사이에 이미저를 끕니다.
      참고: 생체 발광은 주입된 균주에 관계없이 퇴색합니다. 생물 발광의 강도와 수명은 주입 된 박테리아의 수, 마우스 변형, 세균 변형 등을 포함한 많은 요인에 따라 달라집니다.

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결과

도 2에도시된 바와 같이, 표적 게놈 결실은 관심 영역을 증폭시키는 특정 프라이머와 함께 콜로니 PCR을 사용하여 확인할 수 있다. 게놈 결실을 전송하는 식민지는 야생 형 식민지에 비해 더 짧은 PCR 대역 크기를 산출할 것입니다. 10-12 개의 식민지의 PCR 스크린은 일반적으로 표적 삭제를 전송하는 적어도 1개의 식민지를 검출하기 위하여 충분합니다. 여러 번의 스크린 을 통해 삭제가 감지되지 않으면 컨쥬게이션으로 시작하는 절차를 반복합니다. 삭제가 여전히 실패하면 시퀀싱, 재설계 또는 삭제를 통해 플라스미드 인서트를 확인해야 할 수 있습니다. PCR을 통한 유전자 결실이 확인되면 시퀀싱을 통해 삭제를 확인합니다. 생성된 균주는 순차적 게놈 변형을 생성하기 위해 반복적으로 절차를 행할 수 있다.

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토론

pEX100T-Not1 플라스미드는 마커가 없고 프레임 내에 있는 순차적 게놈 제거의 효율적인 중재자입니다. 감쇠된 독성을 위한 세균성 긴장을 기술할 때, 점 돌연변이를 생성하는 보다는 오히려 전체 유전자 순서의 삭제는 악성 표현형으로 복귀의 가능성을 감소시다. 추가적으로, 각 병원성 유전자 삭제는 감쇠의 안정성을 강화, 병원체를 더 감쇠합니다.

이 방법은 또한 플라스미드 인서트의 설계를 수정하기만 하면 점 돌연변이 및 삽입과 같은 삭제 이외의 게놈 변형을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 수정은 예를 들어, 변형된 대사를 가진 공학 박테리아에 대한 전체 유전자 삭제보다 더 유용할 수 있다. 순차적 게놈 수정은 연구 및 산업에서 특정 목적에 맞게 디자이너 세균 균주를 생성하는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 박테리아에서 원하는 마커 없는 게놈 변형을 생성하는 다른 방법은15,

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공개 사항

저자 Hongwei D. Yu는 Progenesis Technologies, LLC의 최고 과학 책임자 겸 공동 설립자입니다.

감사의 글

이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플랫 캡이 있는 0.2 mL 튜브Fisher Scientific을 통한ThermoScientificAB-0620
1 mL 주사기BD22-253-260Fisher Scientific을 통한
1.5 mL 일회용 폴리스티렌 큐벳, Fisher Scientific
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브, FisherScientific 05-408-129
2.0 mL 극저온 바이알CorningFisher Scientific
27G 니들BD14-821-13B를 통한 430659 Fisher Scientific
50 mL 튜브Fisher Scientific05-539-13Fisher Scientific
Accu 블록 디지털 건식 수조LabnetNC0205808Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804REppendorf04-987-372Fisher Scientific
Fisher Scientific벤치탑 마이크로 원심분리기Sorvall75-003-287
VWR1540
카르베니실린 디소듐 염Fisher ScientificBP2648250
배양 시험관, 폴리스티렌Fisher Scientific14-956-6DFisher Scientific
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
Dneasy UltraClean 미생물 키트 (50)Qiagen12224-50또는 선호하는 방법/공급업체
E.Z.N.A. 사이클 퓨어 키트 (50)Omega bio-tekD6493-01또는 선호하는 방법/공급업체
EcoRI-HF, 제한 엔도뉴New England BioLabsR3101L
전기천공법 큐벳Bulldog BioNC0492929via Fisher Fisher
LK6201HFastLink II DNA 결찰 키트, 진원지 기술Fisher Scientific
겐타마이신 황산염, Fisher ScientificBP918-1
글리세롤, Fisher ScientificBP229-4
GoTaq G2, 무색 마스터 믹스PromegaM7833Fisher Scientific,
Isothesia, Isoflurane, Henry Schein 동물 건강29405
IVIS Lumina XRMS 시리즈 III 생체 내 이미징 시스템Perkins 및 ElmerCLS136340
Kanamycin monosulfateFisher ScientificBP906-5
LE 아가로 오스Genemate3120-500via Fisher Scientific
Luria BrothDifco240230Fisher Scientific
MicroPulser ElectroporatorBioRad1652100
Noble 한천, Fisher를 통한Affymetris/USBAAJ10907A1
, 제한 엔도뉴클레아제New England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliFisher Scientific
을 통한 인비트로젠 C404052SigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas 분리 한천Difco292710Fisher Scientific
Pseudomonas isolation 육수Alpha BiosciencesP16-115맞춤형 배치
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106또는 선호하는 방법/공급업체
쉐이킹 인큐베이터New Brunswick ScientificInnova 4080쉐이크 200rpm에서
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA24811
탈지 우유DifcoDF0032-17-3비아 Fisher Scientific
소형 플레이트(100 O.D. x 10mm)Fisher ScientificFB0875713
SmartSpec Plus 분광광도계Bio-Rad170-2525또는 선호 방법/공급업체
SucroseFisher ScientificS5-500
이쑤시개, 원형다이아몬드모든 브랜드의 이쑤시개, 오토클레이브
TOPO TA 클로닝 키트, 시퀀싱용Invitrogen45-0030
XAF-8 마취 시스템 필터Perkins 및 Elmer118999
XGI 8 가스 마취 시스템캘리퍼 생명 과학/제노젠
, , , , 14955127 via 캐비닛 인큐베이터를 통한 클레아제 Scientific을 통해 Scientific, , , , , , , , via Scientific NotI-HF초순수 Phosphate 완충 식염수 분말 via

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