마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Summary

근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.

Abstract

1 차 근세포는 골격 근의 미분화 증식 선구자입니다. 그들은 배양 하 고 근육 선구자로 공부 하거나 근육 개발의 나중 단계로 분화 유도 수 있습니다. 여기에 제공된 프로토콜은 젊은 성인 마우스 골격 근 이식으로부터 의 골수 세포집단의 고도로 증식성 집단의 격리 및 배양에 대한 강력한 방법을 설명한다. 이들 세포는 다른 마우스 모델의 골격 근의 대사 특성의 연구뿐만 아니라 바이러스 발현 벡터를 가진 외인성 DNA 또는 형질전환과 같은 다른 다운스트림 응용 분야에서 유용하다. 이들 세포의 분화 및 대사 프로필의 수준은 근구 분화를 유도하는 데 사용되는 매체의 노출 길이 및 조성에 따라 달라집니다. 이들 방법은 마우스 근육 세포 대사 엑생체의 연구를 위한 견고한 시스템을 제공한다. 중요한 것은, 생체 내 모델과는 달리, 여기에 기술된 방법은 높은 수준의 재현성으로 확장되고 연구될 수 있는 세포 집단을 제공한다.

Introduction

종종 전반적인 신진 대사 건강의 표시로 인용 하는 동안, 여러 연구 는 체 질량 지 수 (BMI) 노인에서 일관 되 게 사망의 높은 위험과 관련 되지 않습니다. 현재까지, 이 인구에 있는 감소된 사망률과 일치하는 것으로 나타난 유일한 요인은 증가된 근육 질량^1. 근육 조직은 신체에서 인슐린에 민감한 세포의 가장 큰 공급원 중 하나를 나타내며, 따라서 전반적인 대사 항상성의 유지에 중요합니다^2. 운동을 통한 골격근 조직의 활성화는 국소 인슐린 감수성 및 전반적인 대사 건강 의 증가와 관련이^{있다 3.} 생체 내 모델은 근육 생리학과 통합 신진 대사에 대한 근육 기능의 영향을 연구하는 데 필수적이지만, myotube의 기본 문화는 동물 연구의 복잡성을 줄이는 견인 시스템을 제공합니다.

산후 근육에서 파생된 근세포는 매우 재현가능한 방식으로 수많은 치료 및 성장 조건의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 오랫동안 인식되어 왔으며 근강초 격리 및 문화에 대한 여러 가지 방법이^4,5,6,

Protocol

이 프로토콜은 스크립스 연구의 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 근육 조직 이식의 수집 및 처리

1. 해부 전날, 모든 해부 장비(집게, 면도날 및 가위)를 소독하고 필요한 모든 매체를 준비합니다: 인산염 완충식염수(PBS), MB 도금 매체(DMEM 12.5 mL, HAMS F12 12mL, 열-불활성화 태아 소 20mL) 혈청 (FBS), 양수 배지 보충의 5 mL), 및 코팅 용액 (DMEM의 24 mL, HAMS F12의 24 mL, 콜라겐 1.7 mL, 마트리겔 1 mL).
2. 해부 당일, 각 근육에 대한 코팅 용액으로 6cm 접시 하나를 코팅하십시오. 각 플레이트의 표면에 2 mL의 코팅 용액을 추가하고 부드럽게 흔들어 표면에 균일 한 코팅을 만들고 4 °C에서 용액으로 플레이트를 1 시간 동안 배양하십시오.
3. 플레이트에서 코팅 용액을 제거하고 재고 용액으로 돌아갑니다.
   참고: 코팅 용액은 최대 6개월 동안 재사용할 수 있으며 4°C에서 보관해야 합니다.
4. 2 mL의 PBS로 접시를 두 번 헹구어 언바운드 콜라겐과 마트리겔을 제거합니다.
5. 플레이트를 해부 동안 37°C 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.
6. 두....

Results

제공된 프로토콜의 섹션 1에 따라 표준 광 현미경 하에서 볼 수 있는 이식으로부터 나오는 1차 세포를 산출해야한다(도 2). 이기종 세포 인구에서 성장 하 고 각 근육 조직 이식 주위 볼 것 이다. 근체는 작고 둥글고 밝은 구체로 나타납니다. 프로토콜의 섹션 2에 따라 조직 이식에서 조세포의 조기 수확을 얻을 것이다, 이는 몇 가지 세포를 포함하고 이기종 될 것입니다(그림 3). 프로토콜의 섹션 3 PBS와 초기 수확을 통과 설명 (보다는 트립신), 추가 배양에 대 한 myoblasts의 상대적으로 순수한 인구를 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 4에 따라 추가 실험 조작을 위해 완전히 차별화 된 myotubes를 얻을 것이다. 근체 세포의 분화는 전형적으로 4-6 일이 걸리며, 그 동안 세포의 형태는 단일 원형 구체에서 길쭉한, 융합된 긴 다중 핵 섬유로 바뀝니다

Discussion

골격 근은 대사 항상성의 설립 및 유지보수에 필수적입니다^11. 근육 생리학의 연구는 개별적인 가변성에 의해 복잡합니다, 뿐만 아니라 견본을 얻기에 있는 어려움, 특히 인간 적인 연구 결과의 경우에. 배양된 1차 묘튜브는 칼슘 항상성^12,손상된 근육 조직 재생^5,운동에 대한 반응으로 대사 변경^13,및 근육 생리학의 많은 특징을 되풀이하는 것으로 나타났다. 당뇨병과 같은 질병으로 인한 신진 대사에 대한 변경^14. 마우스에서 근세포체와 myotubes의 1 차적인 배양은 잘 정의된 유전 조작을 품고 있는 근육 세포의 조사를 가능하게 하고, 인간 근육 생검^{12,15에서 파생된 myotubes의 연구 결과에 보완.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
코팅 솔루션:
DMEM	Gibco	10569010	항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 24 mL
Collagen	Life Technologies		A1064401 1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	사용 전에 항상 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 12.5 mL
열 비활성화 FBS	Life Technologies	16000044	20 밀리리터; 일반 FBS로 구매하고 40 °에 배치하여 열 비활성화할 수 있습니다. 20분 동안 C 수조
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	는 항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 17.5 mL
열 비활성화된 FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; 일반 FBS로 구매할 수 있으며 40 °에 넣어 열 비활성화할 수 있습니다. 20분 동안 C 수조
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	항상 사용 전에 겐타마이신(1:1,000 용량)을 추가하십시오; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	사용 전에 항상 겐타마이신(1:1,000 부피)을 추가하십시오; 24 mL
열 불활성화 호스 세럼	Sigma	H1138	1.5 mL
인슐린-셀레늄-트랜스페린	라이프 테크놀		41400045 0.5 mL
기타 재료:
PBS	Gibco	14040133
겐타마이신	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	시그마	472301	세포 동결을 위해 Myoblast Media에서 10% DMSO로 준비
	모든
면도
가위	모든
Whatman 종이	VWR	21427-648
60mm 플레이트	VWR	734-2318
10cm 플레이트	VWR	25382-428 (CS)
T25 플라스크	ThermoFisher	156367
T75 플라스크	ThermoFisher	156499
원심분리기 튜브(15mL)	BioPioneer	CNT-15
산소 소비율:
Seahorse XFe96 분석기	Agilent	Seahorse XFe96 분석기	세포 외 매체의 산성화로 판독된 산소 소비율을 측정하는 데 사용되는 기기
: Seahorse XFe96, FluxPak	Agilent	102416-100	XFe96 분석기,
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	구성 요소는 분석이 확립되면 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다. 몇 가지 권장 사항은 Seahorse
XF Palmitate-BSA, FAO 기질에 나열되어 있습니다.	Agilent	102720-100	구성 요소는 분석이 확립되면 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다. 몇 가지 권장 사항은 다음과 같습니다
지방산 산화 측정을 위한	팔미트산	Sigma	P5585-10G
지방산 산화 측정을 위한	Carnitine	Sigma	C0283-5G
산화 측정을 위한	Etomoxir	Sigma	E1905
BSA	Sigma	A7030	지방산 산화 측정에 사용하기 위해 팔미트산과 대조군 또는 결합으로 사용됩니다.