방법 논문

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

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DOI:

10.3791/60316

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2020년 3월 20일

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1Molecular Mechanism Section, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, 2Small Animal Imaging Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research, Inc.

이 논문에서

요약

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

초록

삼중 음성 유방암 (TNBC)는 제한된 치료 옵션을 가진 공격적인 유방암 특수형입니다. 덜 공격적인 유방 종양을 가진 환자에 비교될 때, TNBC 환자의 5 년 생존율은 그들의 특징적인 약 저항하는 표현형 및 전이성 부담 때문에 77%입니다. 이를 위해, murine 모형은 TNBC 종양 성장 및 전이성 퍼짐을 제한하는 새로운 치료 전략을 확인하기 위한 목적으로 설립되었습니다. 이 작품은 지하 막 매트릭스에 중단 된 MDA-MB-231 유방암 세포가 인간의 암 세포 행동을 밀접하게 모방하는 네 번째 유방 지방 패드에 이식되는 TNBC 정형 외 모델에 대한 실용적인 가이드를 설명합니다. 캘리퍼스에 의한 종양의 측정, 생체 내 및 생체 내 영상 을 통한 폐 전이 평가, 및 분자 검출이 논의된다. 이 모델은 치료 효능을 연구하는 우수한 플랫폼을 제공하고 1 차적인 종양과 원위 전이성 부위 사이의 상호 작용의 연구에 특히 적합하다.

서론

미국에 있는 8명의 여자에 대하여 대략 1개는 그녀의 일생 도중 침략적인 유방암을 개발할 것이고, 이 여자의 10%-20%는 공격적인 삼중 음성 유방암 (TNBC) 특수형으로 진단될 것입니다. 1 차적인 병변은 대부분의 경우에 외과로 제거될 수 있는 동안, subclinical micrometasis 및 화학저항은 그것을 난치성 질병합니다. 중요한 것은, 전이성 TNBC를 가진 대부분의 환자는 결국 초기 단계1에서처리를 겪더라도, 재발합니다. 따라서, 암 이질성, 미세 전이성 및 치료 내성은 TNBC 환자의 성공적인 임상 결과를 제한하는 세 가지 주요 과제이다. 따라서, TNBC의 다형성 분자 배경을 더 잘 이해하고 전이성 질환을 제한하는 효과적인 치료제를 개발하는 것이 시급하다.

종양 전이는 종양 세포가 1 차 병변에서 막 분해 및 종양 세포 탈출을 통해 자신의 보급을 촉진하기 위해 미세 환경을 제어하고 유도하는 다단계 과정으로, 진입 (즉, 내막)을 통해 (즉, 외래) 혈관 내, 및 궁극적으로 적응 및 결식2. 동물 모델은 유방암 전이를 연구하기 위해 개발되었으며, 여기서 두 가지 방법론이 일반적으로 구현됩니다: 직접 혈액 순환 주사 및 직교 이식. 직접 혈액 순환 주사를 위해 일반적으로 고용된 방법은 꼬리 정맥 주입을 포함하고, 직접 적인 심장주입을포함하여 그밖 접근동안 3, 직접 두뇌 주입4,및 직접 간 주입5또한 채택되었습니다. 직접 혈액 순환 주사는 종종 인공 전이 모델로 불리며, 이는 1 차적인 병변 및 내적 병변으로부터종양 탈출을 우회하기 때문에 빠르고 쉽지만 생리학적으로 덜 정확하다6,7,8.,8 직접 주사 모델과 비교할 때, 정형면역 유방암 모델은 폐와 같은 원격 기관에서 검출 가능한 전이성 병변의 발생에 더 오래 걸리지만, 인간에서 발생하는 다단계 전이성 과정을 밀접하게 모방하기 때문에 생리학적으로 더 관련성이 높다. 중요한 것은, 2013년 연구9는 꼬리 정맥 주입 및 정형외 모델을 비교하고 꼬리 정맥에 주입된 유방암 세포와 꼬리 정맥 주사 후 폐 전이성 병변에서 분리된 유방암 세포가 유사한 글로벌 유전자 발현 프로필을 나타냈다는 것을 발견했습니다. 대조적으로, 정형전형 주사된 유방암 세포의 글로벌 유전자 발현 프로필은 직교 주입 세포로부터 발생하는 폐 전이성 병변의 프로필과 는 극적으로 달랐다9. 이러한 관찰은 전이성 병변이 인간에서 발생하는 전이의 다단계 과정과 유사한 선택 과정을 거치기 때문에 정형화 모델이 더 생리학적으로 관련이 있음을 시사합니다.

이 작품은 화상 진찰 탐지 기술뿐만 아니라 새로운 바이오마커의 식별 및 표적으로 한 화학요법 에이전트의 발달을 위해 우리의 실험실에서 최적화된 누드 마우스에 있는 정형외 유방암 (MDA-MB-231-Luc/GFP) 모형을 기술합니다.

프로토콜

종양 성장의 분석은 국립 암 연구소의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행되었으며 미국 국립 연구위원회의 "치료 및 사용에 대한 가이드"의 권고사항을 준수했습니다. 실험실 동물", 미국 공중 보건 서비스의 "실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드", 그리고 "인간적인 관리 및 실험실 동물의 사용에 대한 정책".

1. 이식을위한 세포의 준비

참고: MDA-MB-231 인간 유방 선암세포(상업적으로 획득)는 렌티바이러스에 의한 루시퍼라아제 유전자 III 및 강화된 녹색 형광 단백질(GFP) 마커로 안정적으로 형질감염되었고 선택항생제(puromycin)의 존재하에서 성장하였다. .

  1. 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP 세포로 세포 배양을 시작하고 T75 배양 플라스크에 10% 태아 소 혈청(FBS)을 가진 프리웜(37°C) RPMI 1640 배지 15 mL을 첨가합니다. 5%CO2를가진 37°C에서 온도 조절 세포 배양 인큐베이터에서 성장하는 세포를 유지한다. 일주일에 적어도 2회 전체 매체를 교체하십시오.
    참고: 세포 성장을 방해 하지 마십시오 하 고 매일 세포 성장 조건을 확인 유지. 세포는 증식 단계를 유지하기 위해 85%-90% 동률에 도달할 때 배양될 필요가 있다.
  2. 세포 이식 단계 1주일 전에, 배양 플라스크내의 모든 배지를 먼저 제거한 다음, 1x 인산완충식염수(PBS)의 10mL로 2x를 헹구고, 마지막으로 배지를 완전한 배지로 대체하여 세포 배양 플라스크로부터 퓨로마이신을 제거하였다. 푸로마이신없이. 중간 첨가 및 헹구 단계 동안 세포를 방해하지 마십시오. 모든 배지 보충 단계에 대해 지금부터 선택 항생제와 함께 완전한 배지를 사용하지 마십시오.
  3. 이식에 대 한 세포를 준비 하는 날에, 트립신을 비활성화 하지 않도록 트립시니화 하기 전에 모든 완전 한 매체를 제거. 플라스크에 트립신 5 mL을 추가하여 세포를 트립시니화합니다. 세포를 모니터링하고 배양 플라스크에서 분리되어 있는지 확인합니다.
  4. 일단 세포의 대다수가 분리되면, 트립신 활성을 중화하기 위해 완전한 배지의 10 mL를 추가하십시오. 다음으로, 세포 현탁액을 50 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 ~150 x g에서 펠릿 세포로 옮긴다. 원심분리 후 상급체를 제거한 다음 1x PBS 10 mL을 추가하여 세포를 다시 중단하고 세포 계수를 준비합니다.
  5. 세포 카운터로 세포를 계산하고 25% 지하 막 매트릭스를 포함하는 차가운 1x PBS에 있는 20 x 106 세포/mL로 세포 농도를 조정합니다. 0.1 mL 1x PBS에 2 x 106 세포를 주입하고 25% 지하 막 매트릭스를 각 마우스의 제 4 유방 지방 패드에 주입합니다. 세포 이식을 위해 여분의 바늘과 주사기를 가져오고 이식 하기 전에 얼음에 세포-지하실 막 매트릭스 혼합을 유지 합니다.
    참고 : 주사기와 바늘에 죽은 공간이 있습니다. 바늘 및 주사기의 선택에 따라 길이, 유형 및 크기, 26 G 바늘에 0.5를 가진 결핵 주사기는 최대 70 μL 데드 스페이스10을가질 수 있다. 죽은 공간 및 기타 우발적 인 손실을 보상하기 위해 40 %-50 % 더 많은 세포 이식 믹스를 준비하십시오.

2. 정형 외 유방암 모형 및 종양 크기 측정

  1. 6주 된 암컷 아티믹 누드 마우스가 세포 이식 전에 적어도 1주일 동안 하우징 시설에 적응하도록 허용하십시오.
    참고: 동일한 연령의 마우스를 사용하면 데이터 변형이 줄어듭니다.
  2. 각 라운드마다, 3-4 분 동안 1 L /min의 유량으로 여과 (0.2 μm) 공기로 4 %에서 이소플루란으로 5 마리의 마우스를 마취시키고 마우스호흡률과 패턴 변화에주의를 기울이고 발가락 핀치를 사용하여 마우스가 적절한 마취 상태에 있는지 확인하십시오. 더 이상 움직이지 않으면 마우스 한 개를 제거하고 코와 입에 같은 마취를 합니다.
  3. 알코올로 왼쪽 4번째 유방 땀샘을 면봉. 미세 한 쥐 치아 집게를 사용 하 여, 4유 방 동맥 을 약간 들어 올려 25 G 바늘을 삽입 합니다. 바늘이 경사지도록 한 다음 플런저를 약간 당겨 바늘이 혈관에 부딪히지 않도록하십시오. 주사기로 혈액이 들어가지 않으면, 세포 지하 막 매트릭스 혼합물의 100 μL을 유방 지방 패드에 천천히 주입하십시오.
    참고: 피부 아래에 둥근 상승 영역이 나타납니다.
  4. 지하 멤브레인 매트릭스가 경화될 때까지 10-15s를 기다린 다음 바늘을 제거하십시오. 유도 챔버에 남아있는 마우스와 과정을 반복합니다. 사용한 모든 바늘과 주사기를 날카로운 상자에 놓습니다.
  5. 모든 마우스에 대해 동일한 유선 주사 부위를 사용하십시오. 사출 부위를 주의 깊게 주시하고 주사 부위에서 누출되는 세포 이식 혼합물에 주의하십시오.
    참고 : 몇 분 이내에 마우스가 의식을 회복하기 시작합니다.
  6. 이종이식은 종양 크기 측정 전 7-10일 동안 중단 없이 자유롭게 자랄 수 있도록 하십시오.
  7. 모든 마우스에 대한 이종이식 크기를 검사합니다. 캘리퍼로 종양 크기를 측정합니다. 다음 방정식으로 종양 부피(mm3)를결정합니다.

    figure-protocol-1

    여기서 L은 가장 긴 치수이고 W는 L에 수직인 가장 짧은 치수입니다.
  8. 평균의 표준 편차를 초과하는 이상값을 식별하고 제거합니다. 실험에 비슷한 종양 크기의 마우스만 사용하십시오. 무작위로 다른 처리 단으로 마우스를 분할하고 처리를 시작합니다.
  9. 일주일에 2 배 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하십시오. 이종이식의 모든 물리적 변화 (즉, 괴사, 열상)를 기록하십시오.

3. 생체 내 생물 발광 및 생체 내 형광 이미징

참고: 본 연구에서는 2차원 생물 발광 및 형광 이미징이 실험의 종점에서 수행됩니다. 생물 발광 이미징(BLI)은 16비트 냉각 CCD 카메라및 가열된 이미징 스테이지가 장착된 상용 전임상 광학 스캐너를 사용하여 수행하였다.

  1. 이미징 전에, 유도 챔버에서 최대 5 개의 종양 베어링 마우스를 여과 (0.2 μm) 공기로 3-4 분 동안 1 L / min의 공기로 설정하여 마취하십시오. 인덕션 챔버가 환기 후드 내부에 보관되어 직원이 이소플루란에 노출되는 것을 최소화하십시오.
  2. D-루시페린(150 mg/kg)을 27 G 바늘을 사용하여 복강 내 경로로 마취된 마우스에 투여하고 마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮긴다. 스캐너 이미징 챔버에서 이소플루란을 2%-2.5%로 유지하고O2를 1L/min의 유속 캐리어로 유지합니다.
    참고 : 마취 유도 챔버, 이미징 테이블 (단계가 가열되지 않은 경우) 및 절차 후 복구 케이지 아래에 가열 된 패드를 유지하여 절차 중에 ~ 37 °C에서 마우스의 체온을 유지합니다.
  3. 연구 마우스를 이미징하기 전에, 3개의 추가 종양 베어링 마우스(어떤 연구 그룹에 할당되지 않은 동물)를 총 40분 간격으로 이미징하여 루시페린 역학을 얻어내십시오: 여기 필터 차단, 방출 필터 개방, f/stop 1, FOV-D, 중간 비닝(8 x 8), 및 자동 노출. 측정된 피크 생물 발광 신호를 사용하여 모든 후속 시점의 최적의 이미지 수집 시간 창을 정의합니다.
  4. 전이 화상 진찰을 능력을 발휘하는 동안, 검은 장갑에서 잘라낸 소매로 그것을 엄호해서 1 차적인 종양에서 높은 BLI 신호를 차폐하십시오. 3.3단계에서 설명한 것과 동일한 파라미터를 사용하여 마우스의 복부 측이 폐 전이 이미징을 위해 카메라를 향하고 있고, 뇌 전이 이미징을 위해 카메라를 향한 마우스의 등쪽을 사용하여 이미지를 획득한다.
    참고 : 최소한의 자동 발광으로 하나를 선택하는 검은 장갑의 몇 가지 다른 브랜드를 테스트하는 것이 필수적이다.
  5. 스캐너 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 흉강 또는 뇌에 대한 표준 모양 영역(ROI)을 그려 관심 기관 전체가 전이성 부담을 평가하도록 보장합니다. 생물 발광 (BL) 출력을 총 플럭스 (광자 / 초)로 정량화합니다.
  6. BLI 직후,CO2 질식(ACUC 지침 및 기관에서 승인한 동물 프로토콜에 따라)을 통해 마우스를 안락사시키고 생체 내 이미징을 위해 해부 가위와 집게로 폐와 뇌를 추출합니다.
    참고: 생체 내 이미징 및 폐 전이 결절 계수에 대해 추출된 폐는 호환되지 않는 절차로 인해 동일한 마우스에서 수행될 수 없습니다.
  7. 1 x PBS로 모든 장기를 신속하게 헹구어 피상적 인 혈액 얼룩을 제거하고 낮은 자동 형광, 검은 색 플라스틱 판에 장기를 놓습니다. GFP 검출을 위한 12비트 CCD 카메라가 장착된 스펙트럼 언혼합 기능(고체 액정 파장 튜닝)을 갖춘 다중 스펙트럼 형광 스캐너로 기관을 운반합니다.
  8. 추출된 장기 및 비종양 베어링 대조군 마우스의 다중 스펙트럼 GFP 이미지(여기 필터 = 457±23 nm; 방출 필터 = 490 nm 긴 패스)를 10 nm의 스텝 크기에서 500-720 nm를 스캐닝하여 획득한다. 비종양 베어링 대조군 마우스의 절제된 장기를 사용하여 자가형광을 교정합니다.
  9. 다중 스펙트럼 GFP 이미징 후 최적의 이미징 설정을 결정합니다. 모든 표적 기관의 이미지 수집을 수행하고 제조업체의 프로토콜에 따라 이미지 분석(즉, 자동 형광및 스펙트럼 언혼합 절차에 대한 GFP에 대한 스펙트럼 라이브러리 생성)을 수행합니다.

4. 전이성 유방암 세포의 분자 검출

  1. 생체 내 화상 진찰 후에, 스냅은 액체 질소에 있는 전체 두뇌를 동결하고 DNA 추출을 위한 준비가 될 때까지 냉동실에 -80°C에서 저장합니다.
  2. DNA 추출을 위해, DNA 용해 완충제의 2 mL를 가진 5 mL 균질화 관에 전체 두뇌를 두십시오. 50에서 전원 설정이있는 균질화를 사용하여 스냅 냉동 전체 뇌 조직을 균질화하십시오. 뇌 조직이 완전히 균질화되면, 1 mL 현탁액 (용해)을 DNase가없는 RNase및 RNase가없는 2 mL 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA를 계속 분리합니다.
    참고: 이월 DNA 오염을 최소화하기 위해 먼저 DNase 프리 및 RNase 가없는 물로 75 % 에탄올로 헹구고 1 M NaOH 용액으로 헹구고 DNase가없는 75 %의 에탄올로 헹구고 각 샘플 후 균질 화제를 철저히 청소하고 RNase-free 물은 DNA 잔류물을 효과적으로 줄이고 파괴합니다.
  3. 0.5 mL의 100% 에탄올을 DNA 매해 완충액에 첨가한다. 샘플을 반전하여 혼합하고 실온에서 3분 동안 보관합니다.
    참고: 너무 여러 번 또는 너무 힘차게 반전하지 마십시오. DNA는 양모와 같은 침전물로 볼 수 있습니다.
  4. 파이펫 팁을 사용하여 DNA를 신선한 DNase 프리 및 RNase 프리 2 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 제거합니다. 샘플을 1 분 동안 공기 건조시키십시오. 1 mL 75 % 에탄올을 추가하고 DNA 샘플을 세척하기 위해 미세 원심 분리 튜브 를 3−6x 반전시. 파이펫팅으로 세척한 후 에탄올을 폐기합니다. 세척 단계를 2x 반복합니다.
  5. 10s에 대한 DNA 샘플을 공기 건조. 이어서 DNA 샘플을 용해시키기 위해 8 mM NaOH의 52 μL을 첨가하였다. DNA 정립을 위한 DNA 샘플의 파이펫 2 μL을 사용하고, 농도 조정 후 실시간 PCR 분석에 나머지 50 μL을 사용한다.
    참고: NaOH는 DNA 샘플을 완전히 용해시키는 데 도움을 줍니다.
  6. 분광광도계로 각 DNA 샘플의 2 μL을 정량화하고 품질 검사 참조로 A260/280 사이의 흡광도 비율을 사용합니다. 이 수식으로 DNA 농도를 계산합니다.

    figure-protocol-2
  7. DNA 농도를 50 ng/μL로 조정합니다. 각 DNA 샘플에 대해, 실시간 PCR 분석에 대한 시작 템플릿으로 DNA 50 ng를 사용한다. DNA 샘플을 희석하기 위해 8 mM NaOH 용액 또는 DNase 가없는 RNase가없는 물을 사용하십시오.
  8. 멸상 반위 부위를 침입하고 식민지화한 전이성 세포에서 GFP 태그의 실시간 PCR 검출을 위한 오픈 소스 프라이머 설계 웹 포털을 사용하여 사내 외인성 녹색 형광 단백질(GFP) 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 설계한다.
    참고 : 이 연구는 F를 사용: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGTGTCG-3'.
  9. 빠른 실시간 PCR 시약과 빠른 실시간 PCR 프로토콜을 지원하는 실시간 PCR 기계를 사용하십시오. 일반 30 사이클 증폭 단계 이외에, 임의의 비특이적 증폭의 검출을 위해 실행의 끝에 해리 곡선 단계를 추가한다.
    참고: 분자 검출을 위해 다음 조건이 사용되었다: 95°C 2 분 고온 스타트, 95°C 5s의 40 사이클, 60°C 15s, 및 마지막으로 용융 곡선 분석. GFP 앰플리곤의 크기는 135bp입니다.
  10. 순진한 마우스 뇌 DNA (MDA-MB-231 세포 임플란트가 아님)를 음성 대조군으로 사용하십시오. MDA-MB-231-GFP/Luc 세포에서 추출한 DNA를 양성 대조군으로 사용하십시오. DNA 템플릿없이 모든 PCR 시약을 무 템플릿 제어 (NTC)로 추가하십시오.
    참고: 각 PCR 분석에 대해 PCR 제어가 필요합니다.

5. 폐에서 전이성 유방암 세포 검출

  1. 전이성 폐 결절 계수에 대해 선택된 마우스 소군의 경우, 생체 내 이미징 직후 이소플루란(2.2단계)으로 마우스를 마취시키고, 혈액 수집을 위해 심장 천자를 수행한 다음 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시한다.
  2. 해부 가위로 가슴 구멍을 열고 심장과 흉선과거를 잘라 기관을 노출시다.
  3. 부인의 용액이 들어있는 22 G 바늘로 10 mL 주사기를 기관에 삽입하십시오. 붕괴된 폐가 부인용액의 ~2 mL로 부어오를 때까지 주사기 플런저를 밀어 넣습니다. 폐가 팽창되면 주사기와 바늘을 제거하십시오.
  4. 전체 폐를 Bouin의 용액이 들어있는 15 mL 튜브에 넣고 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시키고 실온에서 24 시간 동안 담가 둡니다.
  5. 24 시간 후, 튜브에서 Bouin의 용액을 제거하고 폐를 물로 헹구고 70 % 에탄올로 튜브에 다시 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 폐 표면에 전이 (흰색 패치 또는 작은혹)를 계산합니다.

6. 데이터 수집 및 분석

  1. 쉬운 데이터 입력, 수집 및 관리를 위해 전자 스프레드시트에 종양 볼륨 데이터뿐만 아니라 생체 내 및 생체 내 이미징 데이터를 기록합니다.
  2. 실험이 끝나면 모든 데이터를 전자 스프레드시트및 통계 소프트웨어로 전송하여 데이터 플로팅 및 통계 분석을 합니다.

결과

캘리퍼스에 의한 종양 부피 측정은 치료 효능을 평가하는 잘 확립된 방법이다(도1). 이식된 세포의 수, 지하 막 매트릭스의 사용, 미생물군유전체, 시설 청결, 및 주사 부위는 종양 성장 속도에 영향을 미치는 주요 요인입니다.

GFP 이미징과 는 달리, BLI는 BLI 이미징 전에 적어도 15-20 분 동안 루시퍼라아제 기판을 투여해야 했습니다. 더욱이, 마우스 스트레인, 세포주, 치료, 및 루시퍼라제 리포터는 모두 생물발광 신호 수준에 영향을 미친다. 따라서, 연구 그룹 간의 비교 가능한 신호를 얻으려면, 사전 이미징 BLI 운동 연구가 최적의 이미징 시간 프레임을 결정하기 위해 수행되어야한다(도 2).

우수한 신호 대 배경 비26,,27,생체 내 생체 발광 이미징은 GFP 접근법에 비해 낮은 수준의 전이 신호를 검출하는 데 매우 민감했다(도3). 더욱이, 생물 발광 신호는 몇 밀리미터에 의해 GFP보다 더 깊은 침투를 제공했다. 그러나, 생물 발광 신호 생산은 EX 생체 조직 샘플을 평가하는 제한 인자인 ATP를 필요로 합니다. 동물이 빨리 처리되는 경우에, BLI는 전이에 양적 결과를 얻기 위하여 실행 가능한 접근일 수 있었습니다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 한 번에 한 동물을 처리하는 것입니다. 그러나, 이 접근은 마우스의 큰 코호트가 이용되었기 때문에 이 연구 결과를 위해 가능하지 않았습니다. BLI 신호는 장기가 약 45 분 후 루시페린 주사를 이미지 화했을 때 검출되지 않았다. 이중 리포터 셀라인의 사용은 이러한 상황에서 유용합니다. GFP 분자의 안정적 특성으로 인해 연구자들은 표적 장기로부터 GFP 신호를 포착하기 전에 시체를 처리하기에 충분한 시간을 가질 것입니다(그림 4).

도 5는 이종이식은 생존 가능한 종양 세포 함량의 대부분을 잃었지만 여전히 큰 질량과 모양을 유지했기 때문에 캘리퍼스 종양 크기 측정이 데이터 해석을 왜곡할 수 있는 방법의 실제 예를 제공합니다. 그 이종이식의 조직 병리학 검사는 질량 내부의 괴사를 나타냈다(그림 5B).

정형외 유방암 모델에서 뇌 전이에 관한 이미징 결과에 도전하는 연구자의 경우, 실시간 PCR에 의한 분자 검출은 설득력 있는 증거를 제공할 수있다(도 6). 이 경우, 외인성 GFP DNA 서열은 인간 또는 설치류에 자연적으로 존재하지 않기 때문에, 형질감염된 GFP DNA 서열이 이 문제를 해결하는 가장 좋은 방법이었다.

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그림 1: 종양 부피 측정. 캘리퍼스를 가진 종양 부피/로딩 측정은 이종이식 이식 이식 후 10일째에 시작하여 실험이 끝날 때까지 일주일에 2회 측정하였다. 오류 막대는 SEM 값으로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 최적의 이미지 수집 창 측정. 왼쪽: 큰 이종이식을 가진 마우스 1마리와 작은 이종이식을 가진 마우스 1개를 선택하여 최적의 루시페린 운동 범위 측정을 위해 선택했습니다. 오른쪽: 루시페린 운동 곡선은 40분 동안 2분마다 이미지를 획득하여 획득합니다. 15-22분 사이에 고원이 관찰되었고, 이는 모든 후속 이미징을 위한 최적의 이미지 수집 시간으로 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 전신 BLI 이미징. L: 전신 BLI 이미징. M: 하반신이 검은 장갑소매로 덮여 있는 복부 보기. R: 검은 장갑소매로 덮인 하반신이 있는 등도전. 차축 림프절 전이는 BLI 화상 진찰에 의해 복부 보기에서 검출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: Ex 생체 내 BLI/GFP 신호 감지. GFP 신호는 마우스가 희생된 후 20분 후에 동일한 마우스로부터 뇌및 폐에서 검출되었다. BLI 신호는 45분 후 루시퍼린 주사를 검출하지 못했다. 순진한 마우스 뇌와 폐에서 GFP 신호가 검출되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 캘리퍼 측정에 비해 광학 이미징 기술의 장점. (a)원발성 종양에서 생체 내 GFP 신호 검출을 나타내는 대표적인 영상. 이종이식의 사소한 부분만 GFP 신호를 보였으며, 이는 질량의 상당 부분이 기질이었다는 것을 시사한다. 이는 기존의 캘리퍼스 측정에 의해 결정될 수 없으며 부정확한 결론으로 이어질 수 있습니다. 이 예제에서는 동물 모델 연구를 위한 광학 화상 진찰의 중요성을 강조합니다. (b)동일한 마우스의 조직병리학 과장은 괴사 영역(즉, 내부 영역)도 종양 크기 계산에 기여한다는 것을 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 용융 곡선 분석. GFP 앰플리온의 특이성을 보여주는 용융 곡선 플롯. MDA-MB-231-Luc/GFP 이식 마우스로부터 얻은 뇌로부터의 DNA와 배양에서 성장한 MDA-MB-231-Luc/GFP 세포로부터 분리된 DNA(양성 대조군)를 분석하였다. 실시간 PCR 분석은 뇌 조직에서 GFP 함량을 평가하기 위해 수행되었다. (A, B) 양성 대조군과 마우스 뇌로부터 추출된 DNA의 용융 곡선은 각각. (C)패널 A와 B의 중첩된 곡선은, 마우스 뇌로부터의 피크 신호를 나타내는 DNA는 외인성 GFP 서열에 특이적이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

동물에서 TNBC의 연구를 위해, 2개의 뮤린 모형이 개발되었습니다: 면역성이 손상된 마우스에 있는 MDA-MB-231 인간 유방 선암세포 (즉, 심상 누드 마우스, NSG 마우스), 및 면역유능한 BALB/c 마우스에 있는 4T1. 두 모델 모두 장점이 있습니다. 연구를 위한 동물 모형의 선택은 연구 목표에 달려 있습니다. 예를 들어, MDA-MB-231 모델은 면역억제된 인간 유방암 환자를 모방하는 면역손상 마우스에서 성장한 인간 TNBC 세포주이다. 한편, BALB/c 마우스에서 정형포린 4T1의 침습적 표현형은 인간 유방암 환자에서 발생하는 전이성 과정을 밀접하게 모방한다. 정맥내 세포 주사 접근법과는 달리, 인간 MDA-MB-231 유방암 세포는 정형암 유방암 모델,11,13에서유방 지방 패드11,,12에 유사하게 주사되었다. 종양 성장과 획득한 전이성 능력이 더 생리적으로 관련이 있으므로 인공 전이성 암 모델4,,14가아니다. 이러한 자발적전이모델은 개시단계를 제외한 인간 유방암 발병을 밀접하게 모방한다. 이것은 전이성 유방암에 있는 생체 내 약물 검열 및 치료 효험 평가를 위한 결정적인 모형입니다.

마우스에 있는 종양 이식 사이트는 인간에서 생기는 것과 유사한 전이성 표현형의 종양 성장 그리고 선택을 지탱하는 미세 환경을 제공하는 중요한 역할을 합니다. 근위 림프절및 지방조직의 존재는 유방암의 질병 진행에 영향을 미치는 주요 인자이다15,,16. 인간 환자에서, 림프절 및 지방 조직은 모두 유방암의 악성 종양 및 발생률에 영향을 미치는 주요 상호 작용 인자17,,18,,19. 따라서, 주사 부위에 대한 정확한 해부학적 위치의 선택은 인간 질환에 비해 종양 모델의 관련성에 매우 영향을 미칠 수 있다. 이 연구는 주로 전술 한 요구 사항으로 인해 이식 사이트로 네 번째 유선사용과 해부학적으로 더 접근하고 조작하기 쉽다는 것을.

다른 종양 부피 계산 방법을 사용할 수 있으며, 연구원은 적합하다고 판단되는 모든 것을 선택할 수 있습니다. 본 연구를 위해 선택된 알고리즘은 파우스티노-로차(Faustino-Rocha) 등의 연구 결과를 기반으로 하며, 이들은 서로 다른 종양 부피 계산 공식을 비교하고 아래 의 공식이 가장 정확한20이라는결론을 내렸다.

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지하막 매트릭스는 생체외21 및 생체내22,,23개 세포내 세포내 매트릭스에 사용되는 중요한 세포외 매트릭스이다. 이종이식 악성종양에 대한 지하 막 매트릭스의 영향에 관한22,,24,,25의 모순된 보고가 있다. 그것은 단지 이종이식의 초기 설립에 영향을 미치고 이종이식 성장(25)에더 이상 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 기재된 이종이식 이식의 경우, 지하 막 매트릭스를 암세포와 혼합하여 이식 전에 세포/겔 혼합 용액 점도를 증가시킵니다. 지하 멤브레인 매트릭스의 존재는 주사 부위에서 혼합 용액의 손실을 감소시키고 이식 부위에 혼합 용액을 유지하여 이식 된 이종이식 부피의 균일성을 증가시킵니다.

MDA-MB-231 세포주 악성 불멸 인간 유방 선암 세포주이며 삼중 음성 상태 때문에 유방암 연구에서 인기있는 도구입니다. 이중 리포터(luciferase 및 GFP) 세포주사용은 생체내 및 생체내 이미징을 보다 유연있게 처리합니다. 생물 발광 신호는 GFP 신호보다 더 높은 감도, 깊이 감지성 및 우수한 콘트라스트(신호 대 잡음 비)를 가지고 있다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 이 때문에, 그것은 전신 화상 진찰을 위해 널리 이용된 화상 진찰 양식입니다. 불행히도, 생물 발광 검출은 신호 검출이 선형인 좁은 시간 윈도우(~15-20분 포스트 루시페린 주입)에 의해 제한됩니다. 동물이 안락사될 때 BLI 신호는 급격히 감소합니다. 이것은 많은 마우스가 안락사될 필요가 있고 다중 조직 또는 기관을 수확하는 것을 요구하는 경우에 실험적인 디자인 문제점이 됩니다. 이러한 연구에서, 혈액은 직접 심장 천자에 의해 수확되었고, 뇌, 원발성 종양, 폐 및 영향을 받는 림프절은 40마리의 마우스에서 조사되었다. 장기를 수확하고 생체 내 이미징을 위해 준비될 때까지 생물 발광 신호는 감지할 수 없었습니다. 따라서 GFP 검출은 이러한 상황에서 더 적합합니다. GFP 신호의 방출은 가시 범위에 있으며, 이러한 파장에서, 혈액 (즉, 헤모글로빈)에 의한 신호 흡수가 상당히 높다. 또한 NADH, 리포 안료 및 플라빈으로 인한 가시 범위내의 자가형광은 저수준 GFP 신호와 자가형광 배경을 구별하기 어려운 중요한 배경을 초래합니다. 전통적인 필터 쌍 화상 진찰 대신다 스펙트럼 형광 화상 진찰 접근을 채택하고 스펙트럼 unmixing 알고리즘을 사용하여 관심 있는 기관에 있는 실제 GFP 신호를 확인하는 것을 돕습니다. 따라서 생체 내 암진/조직 평가에서 생체 내 검출 및 다스펙트럼 GFP 이미징에서 전신의 생물 발광 이미징의 강점을 결합함으로써, 정량화 가능한 데이터는 쥐의 큰 코호트에서 최대화될 수 있다.

동물 연구를 위해 어떤 접근법이 선택되든, 장기/조직 검색 전에 모든 혈액을 추출하는 것이 좋습니다, 특히 전이성 부담을 표적으로 하는 연구 결과를 위해. 이 프로토콜은 실시간 PCR 분석에 의해 정형외 유방암 모델에서 마우스로부터 수득된 전혈 샘플로부터 GFP 신호를 검출한다(데이터 미표시). 기관/조직에 있는 혈액 양을 최소화하는 것은 표적 기관에 있는 거짓 양성 신호를 감소시킬 것입니다.

결론적으로, MDA-MB-231-Luc/GFP 세포를 이용한 정형외 유방암 모델은 인간 TNBC 환자 상태를 밀접하게 모방하는 매우 관련성이 높은 동물 모델이다. 이 모형은 인간과 유사한 종양 미세 환경에서 치료 효험을 공부하고, 감시하고, 평가하기 를 위해 필수적입니다. 이중 리포터 세포주의 사용은 이 정형암 유방암 모델의 실용성을 더욱 향상시킵니다.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 건강의 국가 학회, 국립 암 연구소, 베데다 MD, 암 및 염증 프로그램 및 프레드릭 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원을 인정하고 싶습니다 - 작은 동물 이미징 프로그램, 레이도스 생물 의학 연구, Inc. 프레드릭 메릴랜드, 미국.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bouins 솔루션시그마HT10132-1L폐 전이성 결절 염색
D-루시페린, 칼륨 염금BioLUCK-1GLuciferase 기질
DNAzolThermoFisher10503027DNA 추출 키트
ExcelMicrosoft스프레드시트 소프트웨어
균질화 장치VirtisCyclone Virtishear조직 균질화용
IVIS SPECTRUM 스캐너Perkin Elmer형광 및 BLI 이미징 시스템
Maestro GNIR-FLEX 형광 스캐너Perkin Elmer형광 이미징 시스템
MatriGel MatrixCorning356234-20°C에서 보관하고 사용 시 낡은(4C) 상태로 유지합니다.
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP 안정 세포주GenTargetSC044듀얼 리포터 인간 유방암 세포주
현미경ThermoFisherEVOS조직학 이미지 캡처
인산염 완충 식염수ThermoFisher10010049린스 버퍼
Primer3MIT프라이머 디자인
프리즘GraphPad통계 분석 소프트웨어
PuromycinThermoFisherA1113803Antibiotics,
RPMI 1640 배지ThermoFisher61870127배양 배지
SeniFAST SYBR Lo-ROX 키트BiolineBIO-94020Fast Real-Time PCR 시약
, StepOne Plus Real-Time PCR 시스템, ThermoFisherReal-Time PCR 기계
: , , , ,

참고문헌

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