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방법 논문

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

7K 조회수

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DOI:

10.3791/60317

⸱

2020년 1월 7일

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Queen's University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

초록

이식된 생체 재료에 대한 지속적인 염증 성 숙주 반응은 이물질 반응으로 알려져 있으며 생물 의학 장치 및 조직 공학 구조의 개발 및 구현에 중요한 과제입니다. 대식 세포, 타고난 면역 세포, 그들은 장치의 수명 동안 임 플 란 트 사이트에 남아 있기 때문에 이물질 반응에 주요 선수, 그리고 일반적으로이 해로운 호스트 응답의 이해를 얻기 위해 공부. 많은 생체 재료 연구원은 이식된 물질에 흡착된 단백질 층이 대식세포 행동에 영향을 미치고, 이어서 호스트 반응에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 이 백서의 방법은 중합체 생체 재료 표면에 세포 손상 분자를 포함하는 흡착 된 단백질 층을 사용하여 대식세포 반응을 평가하는 생체 외 내 모델을 설명합니다. NF-θB/AP-1 리포터 대식세포주 세포주 및 관련 반색 알칼리성 인산염 분석법은 생체물질 표면에 형성된 복합 흡착 단백질 층과 손상 관련 분자 패턴을 포함하는 복잡한 흡착 단백질 층에 반응하여 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 간접적으로 검사하는 신속한 방법으로 사용되었다.

서론

이물질 반응(FBR)은 염증 성 매개체의 지속적인 방출을 통해 이식된 물질 또는 장치(예를 들어, 약물 전달 장치, 바이오센서)의 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 만성 숙주 반응이며, 이식된 물질과 주변 조직 사이의 통합을 방해한다1. 이러한 선천성 면역 반응은 이식 절차에 의해 시작되며 임플란트1주위의 선천성 면역 세포 및 섬유질 캡슐 형성의 장기적인 존재를 특징으로 한다. 재료 호스트 응답의 맥락에서, 대식세포-물질 상호 작용은 FBR1의호스트 반응 및 개발의 진행에 상당한 영향을 미친다. 대식세포는 다양한 선천성 면역 세포 집단으로, 조직 상주 대식세포 집단또는 단핵구 유래 대식세포로서 혈액에서 임플란트 부위로 모집된다. 그(것)들은 이식 직후에 임플란트 사이트에 축적하기 시작하고, 며칠 안에 임플란트 미세 환경에서 지배적인 세포 인구가 됩니다. 물질-부착 대식세포는 대식세포 융합을 통해 형성된 이물질 거대 세포(FBGC)와 함께, 임플란트의 수명 동안 물질 표면에서 지속될 수 있다2,3. 결과적으로, 대식세포는 급성 염증 반응, 조직 리모델링 및 섬유조직의 형성과 같은 FBR의 특징적인 단계를 조율하는 역할로 인해 이물질 반응의 핵심 플레이어로 간주됩니다1.

톨-유사 수용체(TLRs)는 대식세포를 포함한 많은 면역 세포에 의해 발현되는 패턴 인식 수용체의 가족이며, 염증 및 상처 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 병원균 유래 리간드 이외에, TLRs는 세포 괴사 동안 방출되는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)으로 알려진 내인성 분자를 결합할 수 있으며, 이로 인해 염증성 사이토카인의 생산을 초래하는 염증 성 신호 경로를 활성화할 수있다 4. 당사와 다른 사람들은 연조직 생체물질 이식 시 발생하는 손상이 DP를 방출하고, 이에 따라 혈액 단백질 이외에 생체물질 표면에 흡착하고 후속 세포-물질 상호작용을 조절하는것을제안했다5,6. 대식세포가 임플란트의 흡착 된 단백질 층과 상호 작용할 때, 표면 TRS는 흡착 된 DAMPs를 인식하고 전염증성 신호 캐스케이드를 활성화하여 NF-θB 및 AP-1 전사 인자 활성화 및 전염증성 사이토카인 생산을 유도 할 수 있습니다. 우리는 이전에 뮤린 대식세포가 NF-θB/AP-1 활성및 종양 괴사 인자 α(TNF-α, proinflammatory cytokine) 흡착 된 혈청 또는 플라즈마만을 가진 표면에 비해 다양한 중합체 표면에 DAMP 함유 흡착 단백질 층에 대한 분비 (즉, DAMPs가 존재하지 않는다), 이러한 반응은 TLR2에 의해 주로 매개되는 반면, TLR4는 더 적은 역할을 한다5.

본 프로토콜에 사용되는 NF-θB/AP-1 리포터 대식세포주(표오브 머티리얼)는대식세포5,7,8에서상대적인 NF-θB 및 AP-1 활성을 측정하는 편리한 방법이다. TLR 통로 억제제와 조합하여, 이 세포주들은 다양한자극5,7,8에반응하여 염증에서 TLR 활성화 및 그 역할을 조사하는 데 유용한 도구이다. 리포터 세포는 NF-θB 및 AP-1 전사 인자 활성화시분비된 배아 알칼리성 인산염(SEAP)을 안정적으로 생성할 수 있는 변형된 마우스 대식세포형 세포주이다. 색색 효소 알칼리성 인산염 분석법(물자표)은NF-θB/AP-1 활성의 간접 측정으로서 SEAP 발현의 상대적 양을 정량화하는데 사용될 수 있다. NF-θB 및 AP-1은 많은 세포 신호 경로의 다운스트림으로서, 특정 TLR(예를 들어, TLR2) 또는 TLR 어댑터 분자(예를 들어, MyD88)를 표적화하는 항체 및 억제제 중화는 특정 경로의 역할을 검증하는데 사용될 수 있다. 이 문서에 기술된 방법론은 이식된 생체 재료의 체외 모델로서 혈액 단백질과 DAMPs를 모두 포함하는 흡착단백질 층을 가진 다양한 중합체 표면에 대한 뮤린 대식세포 반응에서 TLR 신호의 기여도를 평가하기 위한 간단하고 신속한 접근법을 제공한다.

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프로토콜

1. 미디어 및 시약 준비

  1. 섬유아세포 매체를 준비합니다. Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM), 태아 소 혈청 50 mL (FBS), 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 mL를 결합하십시오. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  2. 50 mL aliquots에서 리포터 대식세포 성장 매체를 준비합니다. 45 mL의 DMEM, 5 mL의 FBS, 5 μg/mL 마이코플라즈마 제거 시약(재료 표),200 μg/mL phleomycin D1(재료 표)을결합합니다. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  3. 50 mL aliquots에서 기자 대식세포 분석 매체를 준비합니다. 45 mL의 DMEM, 5 mL의 열 불활성화 FBS (HI-FBS), 5 μg / mL 마이코 플라즈마 제거 시약 및 200 μg / mL phleomycin D1을 결합하십시오. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.

2. 폴리 (메틸 메타 크릴레이트)로 세포 배양 표면코팅

  1. 20 mg/mL(예: 클로로포름 5 mL에서 PMMA 100 mg)에서 클로로포름에 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)를 20 mL 유리 림틸레이션 바이알에 용해시. 마그네틱 교반 막대를 바이알에 넣고 모든 고체가 용해될 때까지 적어도 2시간 동안 저어줍니다.
    주의 사항: 클로로포름은 흡입하면 유해합니다. PVA 장갑을 착용하는 동안 연기 후드에 용매를 사용해야합니다.
  2. PMMA 용액의 피펫 400 μL을 스핀 코터에서 보로실리케이트 유리 현미경 슬라이드의 중앙에 넣고 2분 동안 3000 rpm으로 회전합니다. 슬라이드를 깨끗한 상자에 보관(스프레이하고 70% 에탄올로 닦음)하여 나중에 사용할 수 있습니다.
    참고: 스핀 코팅은 종종 평평한 표면에 얇고 균일 한 코팅을 증착하는 데 사용됩니다. 스핀 코터는 원심력을 사용하여 코팅 용액을 표면에 확산시키는 고속으로 기판을 회전시다.
    1. 유리 표면이 폴리머로 완전히 코팅되었는지 확인하기 위해 goniometer로 여분의 코팅 된 슬라이드 (즉, 세포 배양에 사용되는 슬라이드가 아닌)의 표면에 있는 두 개의 임의의 위치에서 물 접촉 각도를 측정합니다.
      참고: 물 접촉각 측정에는 가장 높은 순도(예: 유리 삼중 증류)의 물만 사용해야 합니다.
  3. 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 멸균 집게를 사용하고 무균 기술을 따르는 PMMA 코팅 슬라이드에 8 챔버 끈적 끈적한 우물을 부착하십시오. 끈적끈적한 우물 의 상단에 단단히 눌러 강하게 부착되었는지 확인합니다. 밀봉을 확보하기 위해 밤새 37 °C에서 부착 된 끈적 한 우물로 슬라이드를 배양하십시오.
    1. 각 우물에 200 μL의 세포 배양 등급 (내독소가없는) 물을 추가하여 끈적 끈적한 우물의 씰을 테스트하십시오. 실온(RT)에서 60분 동안 배양하고 진행하기 전에 누출이 없도록 하십시오. PMMA 코팅을 방해 하지 않도록 주의 하 고 물을 흡인 합니다.
  4. 내독소가 없는 물 세안은 각 우물에 300 μL의 내독소가 첨가하고 남은 용매를 제거하기 위해 사용하기 전에 1 시간 (3 회), 12 시간 및 24 시간 동안 배양하여 수행됩니다.
  5. 세포 배양에 사용되는 슬라이드의 내독소 농도를 시험한다. 인큐베이트 200 μL의 내독소 없는 시약물(표)을 각 슬라이드의 1웰에 1시간 동안 잘 인큐베이션하여 끝점 염색체 내독소 분석(표)을 사용하여 추출물에서 내독소 농도를 측정하였다.
    참고: 다음 프로토콜은 재료 표에나열된 내독소 분석 키트에 만연합니다.
  6. 이 작업에는 열균이 없는 인증된 물과 소모품(예: 파이펫 팁, 미세 원심 분리튜브 및 우물 플레이트)만 사용하십시오. 또한, 중합체 코팅 표면의 제조에 사용되는 모든 유리 제품은10을사용하기 전에 건식 열 살균 (30 분 동안 250 °C)을 사용하여 depyrogenated되어야한다. 여기에 설명된 바와 같이 추출물 용액에서 내독소를 측정하면, 물질표면(11,12)에내독소의 과소평가를 초래할 수 있다. 따라서, 중합체 코팅 프로토콜을 개발할 때, 코팅 된 샘플을 포함하는 웰 내에서 직접 테스트 샘플 [시약 물] 또는 스파이크 컨트롤에 대한 내독소 분석 반응 (즉, 단계 2.5.4-2.5.6 단계)을 수행하여 코팅 공정 중에 엔도독소의 공급원이 실수로 시스템에 유입되지 않도록하는 것이 좋습니다.
    1. 모든 시험 샘플(즉, 추출물) 및 내독소 분석 시약을 RT. 분석 완충제및 내독소 표준에 재구성하여 5분 동안 용해시키고 사용하기 전에 부드럽게 소용돌이치게 한다. 사용하지 않을 때는 모든 병을 파라핀 필름으로 덮으세요.
    2. 시약물에서 내독소 표준의 직렬 희석을 수행함으로써 분석의 하부에서 상한까지에 이르는 엔도톡신 표준의 5-8포인트 표준 희석 곡선을 생성한다.
    3. 시험 견본에 있는 endotoxin 분석실험의 강화 또는 억제를 위한 통제를 위해, 사용되지 않는 시험 견본 해결책에 있는 endotoxin의 알려진 양을 희석해서 양성 대조군 (또한 스파이크 통제 또는 스파이크 견본에게 불린)를 준비하십시오.
      참고: 양성 대조군 농도는 표준 곡선의 중간에 있는 표준과 동일한 농도여야 합니다. 내독소 스파이크의 회수량이 (즉, 양성 대조군 농도에서 비스파이크 시험 샘플의 농도를 뺀) 내독소 스파이크의 명목 농도의 50-200% 이내인 경우, 추출 용액은 분석법을 현저하게 방해하지 않는 것으로 간주될 수 있다.
    4. 50 μL의 표준, 샘플 또는 스파이크 컨트롤을 중복 또는 삼중으로 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 시약 물을 음의 대조군으로 사용하십시오.
    5. 모든 우물에 50 μL의 염색체 시약을 추가하십시오. 모든 웰에 신속하게 시약을 추가하십시오. 타이머를 사용하여 모든 웰에 시약을 추가하는 데 걸리는 시간을 기록합니다. 37°C에서 접착제 씰로 플레이트를 덮고 배양합니다(인큐베이션 시간은 부지에 의존적이며 염색체 시약 키트에 포함된 분석 인증서에 명시되어 있음). 또는 모든 표준 우물에서 색상 변화가 관찰될 때까지 배양 중에 15분마다 플레이트를 확인합니다.
    6. 배양 후, 각 웰에 50% 아세트산 25 μL을 첨가하여 반응을 멈추게 합니다(웰당 최종 농도 10% 아세트산). 염색체 시약과 동일한 순서로 아세트산을 첨가하였습니다. 405 nm에서 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 흡광도를 판독합니다. 액체를 흡인하고 플레이트를 폐기하십시오.
      참고: 아세트산 첨가는 염색체 시약이 취한 것 뿐만 아니라 각각에 첨가하는 데 동일한 시간이 소요되어야 한다(±30 s).
  7. 자외선(UV)은 세포 배양 실험 전에 30분 동안 슬라이드를 살균한다.

3. 다디메틸실록산으로 세포 배양 표면 코팅

  1. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 10:1 중량 비(염기:경화제)로 혼합합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서, 피펫 약 10 mL의 폴리디메틸실록산 염기멸균 튜브로. 튜브의 무게를 측정하고 10%가 추가될 때까지 경화제를 천천히 추가합니다.
    주의 사항: 통풍이 잘 되는 장소에서 PDMS 시약을 사용하고 안전 안경을 착용하여 눈접촉을 피하십시오.
  2. 멸균 된 혈청 피펫 팁으로 교반하고 위아래로 파이펫팅하여 엘라스토머를 철저히 섞습니다. 용액의 약 200 μL을 48웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 엘라스토머 용액으로 우물의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 우물 플레이트를 천천히 기울입니다.
  3. 엘라스토머가 있는 웰 플레이트를 50 cmHg, 40°C로 설정된 진공 오븐에 놓습니다. 뚜껑을 제거하고 다른 이물질이 우물에 떨어지는 것을 방지하기 위해 단일 플리 와이프로 덮으하십시오. 적어도 48 시간 동안 배양하십시오.
    1. 우물이 육안으로 완전히 코팅되어 있는지 확인하십시오. 제거하기 전에 멸균 피펫 팁으로 부드럽게 구부려 서 엘라스토머가 완전히 경화되었는지 확인하십시오.
  4. 700 μL의 70 % 에탄올 (절대 에탄올및 내독소가없는 물로 만든)을 RT에서 1 시간 동안 배양하고 에탄올을 제거하고 각 우물에 300 μL의 내독소가없는 물을 추가하고 1 시간 (3 회), 12 시간 동안 배양하여 내독소가없는 물 세정을 수행합니다. , 24 시간 전에 남은 용매를 제거한다.
    1. 200 μL의 내독소가 없는 물을 각 플레이트의 3개의 우물에서 1시간 동안 배양하여, 종점 발색성 내독소 분석(단계 2.5.1-2.5.6 단계)을 사용하여 물 추출물의 내독소 농도를 측정하였다.

4. 불소 폴리 (테트라 플루오로에틸렌)로 세포 배양 표면코팅

  1. 불소 폴리 (테트라 플루오로에틸렌)(fPTFE)의 1 mg /mL 용액을 만드십시오 (예를 들어, 불소 용매의 10 mL에 fPTFE 10 mg을 추가 [재료표])20 mL 유리 송신 바이알. 마그네틱 교반 막대를 바이알에 넣고 모든 고체가 용해될 때까지 적어도 24시간 동안 저어줍니다.
  2. 폴리스티렌 48웰 플레이트의 각 웰에 중합체 용액의 약 150 μL을 첨가한다(즉, 조직 배양 처리되지 않음). 폴리머 용액으로 모든 웰의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 웰 플레이트를 천천히 기울입니다. 뚜껑을 닫습니다.
    1. 우물의 효과적인 fPTFE 코팅을 보장하기 위해 유리 커버슬립은 fPTFE로 코팅하고 물 접촉각 측정에 사용해야 합니다(단계 4.3.1). 24 웰 플레이트의 우물 내부에 덮개를 놓습니다. 커버슬립을 함유하는 각 웰에 폴리머 용액의 약 400 μL을 추가합니다. 멸균 집게를 사용하여 커버슬립을 아래로 밀어 폴리머 용액으로 완전히 덮은 다음 웰 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다.
  3. 폴리머 용액이 있는 웰 플레이트를 놓고/또는 50 cmHg, 40°C로 설정된 진공 오븐에 립을 넣습니다. 뚜껑을 제거하고 다른 이물질이 우물에 떨어지는 것을 방지하기 위해 단일 플리 와이프로 덮으하십시오. 적어도 48 시간 동안 배양하십시오.
    1. 효과적인 코팅을 보장하기 위해 goniometer로 fPTFE 코팅 커버슬립의 물 접촉 각을 측정합니다.
      참고: 물 접촉각 측정에는 가장 높은 순도(예: 유리 삼중 증류)의 물만 사용해야 합니다.
  4. 700 μL의 70 % 에탄올 (절대 에탄올및 내독소가없는 물로 만든)을 RT에서 1 시간 동안 배양하고 에탄올을 제거하고 각 우물에 300 μL의 내독소가없는 물을 추가하고 1 시간 (3 회), 12 시간 동안 배양하여 내독소가없는 물 세정을 수행합니다. , 24 시간 전에 남은 용매를 제거한다.
    1. 1 시간 동안 각 판의 3 개의 우물에서 200 μL의 내독소가없는 물을 인큐베이션하여 끝점 염색체 내독소 분석 (단계 2.5.1-2.5.6 단계)을 사용하여 물 추출물의 내독소 농도를 측정합니다.
  5. UV는 세포 배양 실험 전에 30 분 동안 웰 플레이트를 살균한다.

5. 3T3 세포에서 리세이트 만들기

  1. 다중 T150 플라스크에서 3T3 세포를 70% 합류로 성장시다. 세포를 분리하기 위해, 흡인물, PBS의 5 mL로 표면을 세척하고, PBS를 흡인한다. 동물성 무첨가 재조합 세포 해리효소(재료 표)를5 mL 첨가하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
  2. 플라스크를 앞뒤로 부드럽게 기울여 세포를 분리합니다. 세포 해리에 사용되는 재조합 효소를 중화하기 위해 PBS 5 mL을 추가하십시오. 플라스크에서 분리된 세포를 원심분리관으로 옮기고 파이펫팅을 통해 혼합합니다. 혈세포계 및 세포 생존성 염료를 사용하여 라이브 셀 카운트를 수행합니다.
    참고: PBS에서 희석을 통해 중화될 수 있는 세포 해리 효소는 용해 제제에서 혈청 계 단백질의 도입을 피하기 위해 선택되었다. 트립신은 세포를 해리하는 데 사용되는 경우, 그것은 혈청 함유 용액으로 중화되어야하며, 추가 PBS 세척은 용해 준비로 이월 혈청 단백질의 양을 줄이기 위해 수행되어야한다.
  3. 세포를 200 x g에서 5분 동안 흡인하고, PBS의 원래 부피(즉, 10 mL x 플라스크 수)로 세포를 재중단하여 남은 모든 매체를 씻어낸다. 반복.
  4. 세포를 200 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리하고 상월체를 흡인합니다. 1 x 106 세포 /mL의 최종 세포 농도를 달성하는 데 필요한 PBS의 부피를 추가합니다. 시료가 완전히 동결될 때까지 세포 용액을 -80°C 냉동실에 넣습니다(적어도 2시간).
  5. 37°C 수조에서 세포 용액을 해동합니다. 완전히 해동되면 용액을 완전히 동결될 때까지 -80°C 냉동실에 다시 넣습니다. 총 3회 동결 해동 주기에 대해 반복합니다.
  6. 단백질 농도를 결정하기 위해 다양한 희석물(예를 들어, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000)에서 세포 용해물 상에 마이크로 비신코닌산(BCA) 분석법을 수행한다. 세포를 468.75 μg/mL의 단백질 농도로 희석시키고, 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관한다.
    참고: 48 웰 플레이트의 최종 단백질 농도는 125 μg/cm2입니다(1웰의 표면적에 따라, 0.75cm2).
  7. 용해액 (예를 들어, 열 충격 단백질 60 [HSP60], 높은 이동성 그룹 상자 1 [HMGB1])에 1.5 mm 두께10% 폴리아크릴아미드 젤에 로딩 버퍼에 용해 단백질의 40-60 μg를 적재하고 표준 웨스턴 블로트에 담백의 존재를 평가하기 위해 서쪽 얼룩을 수행 절차.

6. 대식세포의 NF-θB 활동에 흡착된 단백질 층 및 통행료 유사 수용체의 효과 평가

참고: 실험 워크플로우 및 플레이트 레이아웃의 회로도는 각각 그림 1A 및 보충 그림 1을참조하십시오.

  1. 기자 대식세포는 적당한 크기의 플라스크에서 70%의 합류율로 성장시다. 흡인 매체, PBS로 표면을 세척하고 PBS를 흡인합니다. 재조합 세포 해리 효소를 첨가하고 37°C에서 8분 동안 배양한다.
  2. 플라스크의 측면을 단단히 눌러 세포를 분리합니다. 동일한 부피의 성장 매체를 첨가하여 재조합 세포 해리 효소를 비활성화 (포함 10% FBS). 혈세포계 및 세포 생존성 염료를 사용하여 라이브 셀 카운트를 수행합니다.
    참고: 세포 해리 효소에서 8분 배양후 리포터 대식세포에 대한 예상 생존가능성은 90%이다.
  3. 원심분리기 세포는 200 x g에서 5 분 동안. 흡기 상류및 세포를 세척하기 위해 PBS의 원래 부피에서 다시 중단. 다시 원심분리기 및 분석 매체에서 7.3 x 105 세포/mL에서 세포를 재중단(열 불활성화 FBS 함유).
  4. 3개의 다른 관으로 세포 현탁액을 분리합니다: TLR4 억제제, 반대로 TLR2, 및 처리되지 않은. RT에서 60분 동안 또는 RT에서 30분 동안 50 μg/mL 항 TLR2로 1 μg/mL TLR4 억제제로 세포를 배양합니다.
  5. 용해물 200 μL, 10% FBS, 10% 상업용 마우스플라즈마(재료 표)또는 단백질 용액을 혼합물로 48웰 플레이트(또는 이에 상응하는 것)에 넣고 단백질을 원하는 시간(즉, 30분, 60분 또는 24시간)에 대해 37°C에서 흡착하도록 허용합니다. 웰에서 단백질 용액을 흡인하고, 각 단백질 용액에 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하고, 5 분 동안 PBS 의 250 μL로 표면을 세척합니다. 총 3번의 세면에 대해 반복합니다.
    참고: 이 단계는 원하는 흡착 시간에 따라 프로토콜의 초기에 시작해야 할 수 있습니다. 그에 따라 프로토콜을 조정합니다.
  6. TLR4 억제제 또는 항-TLR2를 사용하여 잠복기 후, 피펫 세포를 재중단한다. 각 우물에 200 μL의 셀 용액을 추가하십시오.
  7. TLR2 양성 조절 상태의 경우 Pam3CSK4를 최종 농도 150ng/mL에 추가합니다. TLR4 양성 조절 상태의 경우, 리포폴리사카라이드(LPS)를 최종 농도 1.5 μg/mL에 추가합니다. 20 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양하십시오.
  8. 각 우물에서 상류의 20 μL을 샘플링하고 96 웰 플레이트에 복제 판. 배경 대조군으로서 20 μL 분석 매체의 3개의 웰을 포함한다. 각 우물에 SEAP 리포터 분석 시약 200 μL을 추가합니다. 접착제 씰로 플레이트를 덮고 37 °C에서 2.5 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 배양 시간은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으며, 양성 및 음성 대조군 웰 사이의 흡수도의 강한 차이에 대해 최적화되어야 한다.
    1. 상급체의 나머지 부분을 1.5 mL 튜브 (우물 당)로 옮니다. 1,000 x g의 원심분리기를 10분 동안 사용하여 파편을 펠렛합니다. 상급체를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관하십시오. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 전염증성 사이토카인(예를 들어, TNF-α, 인터류킨 6)의 존재에 대한 상월성을 분석한다.
  9. 접착제 플레이트 씰을 제거합니다. 635 nm에서 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 흡광도를 판독합니다. 액체를 흡인하고 플레이트를 폐기하십시오.

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결과

폴리머 코팅 표면에 대한 세정 방법은 코팅의 중단이 없는지 확인하기 위해 시험되었으며, 이는 코팅되지 않은 유리 커버슬립에 대한 물 접촉각의 변화로 볼 수있다(도 2). PMMA 코팅 된 현미경 슬라이드를 1 시간 동안 70 % 에탄올에 담그면 PMMA 코팅(그림 2, 왼쪽 패널)을 제거하는 것으로 나타났으며, 80 wt % 에탄올13에서PMMA의 용해도로 인해 가능성이 높았으며, 따라서 PMMA 코팅 표면은 30 분의 UV 살균을 사용하여 세척되었습니다. 코팅용 PMMA의 농도는 이전에5. 1 시간 70 % 에탄올 흡수는 PDMS를 청소하는 데 사용되었으며, UV 광은 사슬 가위를 유발하고 PDMS14의표면 습윤 특성에 영향을 줄 수 있기 때문에 UV 살균을 무시했습니다. 둘 다 70% 에탄올 ...

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토론

우리 실험실의 주요 초점은 고체 생체 재료 연조직 임플란트에 대한 숙주 반응이며, 특히 이식 절차 중에 발생한 세포 손상이 숙주 반응에 미치는 영향입니다. 여기에 제시된 일은 생체 재료에 대한 대식세포 반응에 대한 세포 손상(즉, 임플란트 수술)중에 방출된 분자의 영향을 조사하기 위해 리포터 대식세포 주및 시험관내 생성 된 DAMP 함유 세포 용해제를 이용한 예비 실험을 설명합니다. 섬유아세포 용해액은 생체물질 배치로 인한 DAMPs의 세포 손상 및 방출을 모델링하는데 사용되었다. 섬유아세포는 섬유넥틴18을포함한 다양한 세포외 기질(ECM) 단백질을 분비하는 능력뿐만 아니라 연조직에서 섬유아세포의 유병률뿐만 아니라 용해력을 생성하도록 선택되었다. 동결 해동 사이클링은 임플란트 환경에 존재하는 것과 유사한 세포 내 및 ECM 유래 DAMPs를 모두 생성하는 용해 의 방법으로 선택되었습니다. 프로테아제 억제제는 이 용해를 만들기 위하여 이용되지 않았습니다. 동결 해동 사이클링과 같은 통제되...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 감사하게도 건강 연구 프로젝트의 캐나다 연구소에서 운영 자금을 인정 (PTJ 162251), 혁신 존 에반의 리더십 기금에 대한 캐나다 재단의 여왕의 대학 상원 자문 연구위원회 및 인프라 지원 (프로젝트 34137) 및 연구 및 혁신 온타리오 연구 기금의 교육부 (프로젝트 34137). L.A.M.은 퀸즈 대학교 R. 새뮤얼 맥러플린 펠로우십, 캐나다 캐나다 대학원 장학금 석사 상 및 온타리오 대학원 장학금의 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 지원을 받았습니다. 저자는 NF-θB/AP-1 리포터 대식세포 주현의 그의 관대 한 선물에 대한 박사 마이런 Szewczuk 감사하고 박사 마이클 블레너 하셋과 산드라 루렌센 은 젤 이미징 시스템과 플레이트 리더의 사용에 대한.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포 배양 시약
anti-mouse/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US originInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml마우스 플라즈마
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS)Fisher Scientific14190250칼슘 없음, 마그네슘
없음 소 태아 혈청(FBS), 연구 등급Wisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPS대장균 K12의 지질다당류
NIH/3T3 섬유아세포,ATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pms,합성 트리아실화 리포펩타이드 - TLR1/2 리간드
, 페니실린/스트렙토마이신,시그마 알드리치P4333-100ML,
플라즈모신InvivogenANT-MPP,마이코플라즈마 제거 시약
, RAW-Blue cellsInvivogenRaw-spNF-&카파; B/AP-1 리포터 대식세포 세포주
트리판 블루 솔루션, 0.4%Fisher Scientific15250061
TrypLE 발현 효소 (1X)Fisher Scientific12604021동물 유래 무함유 재조합 세포 해리 효소
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
키트 및 분석
ELISA 사전 코팅 플레이트, 마우스 IL-6BiolegendB213022
ELISA 사전 코팅 플레이트, 마우스 TNF-&알파;BiolegendB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - 제어 표준 endotoxin (CSE)Cape Cope Inc.의 AssociatesE0005-5발색 내독소 분석의 표준 곡선에 대한 내독
LAL 물, 100mLCape Cope Inc.의WP1001발색 내독소 분석과 함께 사용
Micro BCA 단백질 분석Fisher ScientificPI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kitAssociates of Cape Cope, Inc.C1500-5발색 내독소 분석 시약
QUANTI-Blue 알칼리 인산가수분해효소 검출 매체Invivogenrep-qb2알칼리성 인산가수분해효소 분석으로 NF-&kappa를 간접적으로 측정합니다. B/AP-1 활성
고분자 코팅 시약
클로로포름, 무수Sigma Aldrich288306-1L
에틸 알코올 무수상업용 알코올P006EAANSigma: 시약 알코올, 무수, 676829-1L
스트레이트 테이퍼 파인 팁 집게Fisher Scientific16-100-113
Fluorinert FC-40 용매Sigma AldrichF9755-100ML용 불소화 용매
(내독소 없음)Fisher ScientificSH30529LS
폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 엘라스토머 키트Fisher Scientific50822180
테플론-AF(fPTFE)Sigma Aldrich469610-1G폴리[4,5-디플루오로-2,2-비스(트리플루오로메틸)-1,3-디옥솔-코-테트라플루오로에틸렌]
소모품
접착 플레이트 씰Fisher ScientificAB-0580
Axygen 마이크로튜브, 1.5mLFisher Scientific14-222-155
붕규산 유리 섬광 바이알, 흰색 폴리프로필렌 캡 포함Fisher Scientific03-337-4
투명 PS 48웰 플레이트Fisher Scientific08-772-52
투명 TCPS 96웰 플레이트Fisher Scientific08-772-2C
투명 TCPS 48웰 플레이트Fisher Scientific08-772-1C
커버 안경, 서클Fisher Scientific12-545-81
Falcon 조직 배양 처리 플라스크, T25Fisher Scientific10-126-10
끈적끈적한 슬라이드 8 WellIbidi80828
Superfrost 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
조직 배양 처리 플라스크, T150Fisher Scientific08-772-48
, , , , , , , , , 소 동료 fPTFE 세포 배양 등급 물

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