조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

요약

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

초록

인간 배아 줄기 세포는 배아 발생 시 1차 생식층 형성에 대응하는 세포 운명 사양의 자가 조직화 패턴에 의해 시험관내 모르포겐에 반응하는 독특한 능력을 입증한다. 따라서, 이 세포는 초기 인간 발달을 이끄는 기계장치를 검토하는 강력한 공구를 나타냅니다. 우리는 물리적 인 매개 변수를 재현하기 위해 식민지의 기하학과 기계적 환경 모두를 제어 할 수있는 준수 기질에 제한된 식민지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 배아 발생의 기초. 이 방법의 주요 특징은 세포 부착을 촉진하기 위해 표면에 세포 외 매트릭스 리간드의 정의 된 패턴과 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 생성하는 능력이다. 이것은 원하는 기하학적 패턴으로 스텐실을 제작하고, 이러한 스텐실을 사용하여 유리 커버슬립에 세포외 매트릭스 리간드패턴을 생성하고, 중합 중에 이러한 패턴을 폴리아크릴아미드 하이드로겔로 옮기는 것으로 달성됩니다. 이 방법은 또한 견인력 현미경 검사법과 호환되므로 사용자는 제한된 식민지 내에서 세포 생성 힘의 분포를 측정하고 매핑할 수 있습니다. 표준 생화학 분석과 함께, 이러한 측정은 초기 인간 개발 동안 운명 사양 및 형태 발생에서 기계적 단서가 재생역할을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학 및 조직 공학 응용 분야에서 사용하기위한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 이 세포의 다능성 성질은 그(것)들에게 어떤 성숙한 세포 모형으로 분화하는 기능을 줍니다. 특정 세포 유형에 hESCs의 운명을 지시에 큰 진전이 이루어진 동안, 그것은 전체 조직 또는 장기 de novo^1,2,3,4를생성하는 것은 매우 어려운 남아있다 ⁵. 이것은, 상당 부분에서, 인간 발달 도중 이 조직의 대형을 몰기 하는 기계장치의 한정된 이해 때문이. 지식의 이 격차를 메우기 위하여는, 배아줄기^{세포6,7,8,9를 가진 발달의 초기 태아 그리고 후속 단계를 모델링하는 방법의 수는 최근에 나타났습니다 ,10,11,12,13}.

제1 hESC^{라인(14)의}유도 직후, hESCs로부터 형성된 배아체가 3차 생식층^6의세포를 자발적으로 생성할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 배아 체의 크기와 형태에 대한 통제의 본질적인 부족으로 인해, 배아 층의 조직은 크게 변화하고 초기 배아의 조직과 일치하지 못했다. 최근에는 Warmflash 등은 미세 패터닝을 통해 유리 기판에 hES의 식민지를 제한하는 방법을 개발하여 식민지의 크기와 기하학에 대한 제어 및 일관성을 제공합니다^8. 초기 개발에서 중요한 모르포겐인 BMP4의 존재에서, 이러한 제한된 식민지는 1 차적인 세균 층을 나타내는 운명에 명세의 재현 가능한 패턴을 스스로 조직할 수 있었습니다. 이는 1차 생식층이 확립되는 기전을 연구하기 위한 유용한 모델을 제공했지만, 운명 명세의 패턴은 배아 발생 시 관찰된 조직 및 형태 형성과 정확하게 일치하지 않았다^15. 초기 배아 발달의 보다 충실한 재수집은 matrigel^11의3차원 세포 외 매트릭스(ECM)에 hESCs를 포함시킴으로써 달성되었으며, hESCs가 스스로 구성하고 모델링할 수 있는 능력에 대한 가장 강력한 증거를 제공합니다. 배아 발생 의 초기 단계 ex 생체. 그러나, 이 방법은 일관되지 않은 결과를 산출하고 따라서 자기 조직과 운명 명세의 근본적인 기계장치를 드러내기 위하여 이용될 수 있는 다수의 수의 검사와 호환되지 않습니다.

이러한 기존 방법과 각각의 한계를 감안할 때, 우리는 초기 배아의 세포 외 환경을 모델링하는 조건에서 정의 된 기하학의 hESC 콜로니를 재현 가능하게 배양하는 방법을 개발하고자했습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 기판의 기계적 특성을 제어하기 위해 조정 탄성의 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔을 사용했다. 위분화 단계 닭 배아에 원자력 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 epiblast의 탄성이 몇 킬로파스칼에 파스칼의 수백에서 구역 수색한다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 hESC 식민지를 위한 기판역할을 하기 위하여 이 범위에서 탄성을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔생성에 집중했습니다. 우리는 콜로니의 기하학에 대한 강력한 제어를 제공하기 위해 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔^7,9에 hCS를 배양하기위한 우리의 이전 방법을 수정했습니다. 우리는 이전에 보고 된^바와같이, 마이크로 패브릭 스텐실을 통해 유리 커버 슬립에 ECM 리간드, 즉 matrigel을 먼저 패터닝하여 이를 달성했습니다. 그런 다음 중합 중에 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 패턴 리간드를 전달하는 새로운 기술을 설계했습니다. 여기서 설명하는 방법은 포토리소그래피를 사용하여 원하는 기하학적 패턴으로 실리콘 웨이퍼를 제작하고, 다디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 기하학적 특징의 스탬프를 만들고, 이러한 스탬프를 사용하여 스텐실을 생성하는 것을 포함합니다. 궁극적으로 유리 커버립의 표면에 리간드의 패터닝을 허용립과 폴리 아크릴 아미드로 전송.

초기 배아의 기계적 환경을 재요약하는 것 외에도, 폴리아크릴아미드에 hESC 콜로니를 제한하면 이전 방법^9에보고된 바와 같이 견인력 현미경(TFM)으로 세포 생성 힘을 측정할 수 있습니다. 간단히 말해서, 형광 비드는 폴리아크릴아미드에 내장되어 수화물 마커로 사용될 수 있다. 세포 생성 힘은 패턴화된 기판 상에 hESCs를 시드한 후 이러한 비드의 변위를 이미징하여 계산됩니다. 또한, 생성된 견인력 맵은 면역 염색과 같은 전통적인 분석과 결합되어 제한된 hESC 콜로니에서 세포 생성 힘의 분포가 다운스트림 신호를 조절하거나 조절하는 방법을 조사할 수 있습니다. 우리는 이 방법들이 기계적 힘이 현재 간과되는 초기 배아 발달 도중 세포 운명 명세의 패터닝에 중요한 역할을 한다는 것을 밝힐 것으로 기대합니다.

프로토콜

hESCs의 사용에 관련된 여기에서 기술된 모든 방법은 캘리포니아 샌프란시스코 대학에 인간 Gamete, 태아 및 줄기 세포 연구 (GESCR) 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 기하학적 특징을 가진 실리콘 웨이퍼의 준비

1. 원하는 기하학적 피쳐로 포토마스크를 작성합니다. 컴퓨터 지원 제도 소프트웨어를 사용하여 피처를 디자인합니다. 음수 포토레지스트와 함께 사용하십시오.
   참고: 18mm 직경의 커버슬립에 패터닝을 할 때, 각 실험 조건에 대한 피처를 10 x 10mm 영역으로 그룹화하여 3단계에서 생성된 스텐실이 커버슬립에 맞도록 합니다.
2. 100mm 실리콘 웨이퍼에 네거티브 포토레지스트를 스핀 코트. 포토레지스트 데이터 시트를 사용하여 스핀 의 속도와 길이를 결정하여 100-250 μm의 필름 두께를 생성합니다.
   참고: 필름 두께는 패턴폭과 스텐실 높이의 가로 세로 비율이 가능한 1:1에 가까워지도록 조정해야 합니다. 그러나, 아무것도 덜 쉽게 찢어 섬세한 스텐실을 생산으로, 100 μm의 최소 두께를 권장합니다.
3. 제품 데이터 시트에 따라 포토레지스트를 처리합니다. 이것은 일반적으로 마스크 정렬기에서 포토 마스크와 부드러운 베이킹, UV 노출, 포스트 노출 베이킹, 개발 및 하드 베이크를 포함한다. 일례로, 이 프로토콜에 사용된 웨이퍼를 처리하는 데 사용되는 절차는 표 1에설명되어 있다.
   참고: 실리콘 웨이퍼가 깨지기 쉽기 때문에 취급할 때는 주의해야 합니다. 일단 생성되면 웨이퍼가 손상되지 않는 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

2. 커버립준비

1. 산 세척 "상단"커버의 준비
   1. 직경 18mm#1 두께의 커버를 유리 페트리 접시에 넣습니다. 커버의 적절한 수는 접시의 크기에 따라 달라집니다. 100mm 접시의 경우 한 번에 50-100 개의 커버슬립을 준비하십시오. 이 섹션의 나머지 부분을 통해 주어진 부피 량은 100mm 접시에 해당합니다.
   2. 페트리 접시에 1M HCl 20 mL를 넣고 접시를 부드럽게 흔들어 커버슬립을 분산시냅니다. 모든 커버슬립이 침수되었는지 확인하고 커버슬립 사이에서 기포를 방출합니다. 부드러운 흔들림으로 실온에서 밤새 배양하십시오.
      주의: HCl은 산성 및 부식성입니다. HCl로 작업하는 동안 주의해서 적절한 PPE를 착용하십시오.
   3. 접시에서 데산트 HCl. 20 mL의 초순수를 넣고 10 분 동안 부드럽게 흔들어 서 씻으십시오.
   4. 최종 세척을 폐기한 후 접시에 100% 에탄올 20 mL를 추가합니다. 집게를 사용하여 덮개를 개별적으로 제거하고 두 개의 필터 용지 사이에 정렬하여 건조시십시오.
   5. 말린 커버슬립을 밀봉된 용기에 보관하십시오. 산 세척 커버슬립은 사전에 준비하고 먼지가없는 조건에서 한 달 이상 보관 할 수 있습니다.
2. 글루타랄데히드 활성화 "바닥"커버립의 준비
   참고 : 추가 세부 사항은 이전 방법을 참조하십시오^7,9.
   1. 직경 18mm#1 두께의 커버를 페트리 접시에 넣습니다.
   2. 페트리 접시에 0.2 M HCl 의 20 mL를 추가하고 부드럽게 커버 립을 분산하기 위해 접시를 흔들어. 모든 커버슬립이 침수되었는지 확인하고 커버슬립 사이에서 기포를 방출합니다. 부드러운 흔들림으로 실온에서 밤새 배양하십시오.
   3. 접시에서 데산트 HCl. 20 mL의 초순수를 넣고 10 분 동안 부드럽게 흔들어 서 씻으십시오.
   4. 마지막 세척을 폐기한 후, 0.1 M NaOH 의 20 mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 커버립을 분산시키고 잠급기십시오. 실온에서 1 시간 동안 부드럽게 흔들어 서 배양하십시오.
   5. 요리에서 Decant NaOH. 20 mL의 초순수를 넣고 10 분 동안 부드럽게 흔들어 서 씻으십시오.
   6. 마지막 세척을 폐기한 후, 1:200 의 희석된 3-아미노프로필트리메톡시실란을 초순수에 넣고 부드럽게 흔들어 커버슬립을 분산시키고 잠급탈합니다. 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 서 배양하십시오.
      주의: 3-아미노프로필트리메톡실란이 가연성이며 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 조심스럽게 다루고, 적절한 PPE를 착용하고, 현지 처리 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오.
   7. 접시에서 희석 된 3-아미노 프로필 트리메톡실란 용액을 데Ant. 20 mL의 초순수를 넣고 10 분 동안 부드럽게 흔들어 서 씻으십시오. 진행하기 전에 모든 3-아미노 프로필트리메톡시실란을 제거하는 것이 중요합니다.
   8. 최종 세척을 폐기한 후, 인산완충 식염수(PBS)에 70% 글루타랄데히드의 1:140 희석액 20 mL를 넣고 부드럽게 흔들어 커버슬립을 분산시키고 침수시합니다. 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 서 배양하십시오.
      주의: 글루타랄데히드 70%는 독성이 있으며 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 조심스럽게 다루고, 적절한 PPE를 착용하고, 현지 처리 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오.
   9. 접시에서 희석 된 글루타랄데히드 용액을 데ant. 20 mL의 초순수를 넣고 10 분 동안 부드럽게 흔들어 서 씻으십시오.
   10. 최종 세척을 폐기한 후 100% 에탄올 20 mL를 추가합니다. 집게를 사용하여 덮개를 개별적으로 제거하고 두 개의 필터 용지 사이에 정렬하여 건조시십시오.
   11. 말린 커버슬립을 밀봉된 용기에 보관하십시오. 글루타랄데히드 활성 커버슬립은 사전에 준비하고 최대 6 개월 동안 보관 할 수 있습니다.

3. ECM 리간드 패터닝을 위한 스텐실 생성

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 중간 우표 생성
   1. PDMS 염기와 PDMS 경화제를 10:1 비율로 혼합합니다. 철저히 섞으세요.
      참고 : PDMS의 초기 적용을 위해, 100mm 접시를 채우기 위해 PDMS의 약 100g을 준비합니다. 후속 용도의 경우 실리콘 웨이퍼 기능이 있는 접시 중앙에서만 PDMS를 제거하고 20-30g의 새로운 PDMS를 준비합니다.
   2. PDMS 혼합물을 건조기에서 30-60 분 동안 또는 모든 기포가 제거 될 때까지 탈기하십시오.
   3. 1단계에서 수정된 실리콘 웨이퍼를 플라스틱 100mm 접시에 넣습니다. PDMS 혼합물을 웨이퍼 표면에 천천히 고르게 붓습니다. 작업 표면의 접시를 탭하여 웨이퍼 표면에서 기포를 방출합니다.
   4. 모든 기포가 제거되거나 PDMS 의 표면에 올 때까지 10 분 동안 또는 웨이퍼 위에 부어 PDMS 혼합물을 탈기.
   5. PDMS를 70°C에서 2시간 동안 구우십시오.
   6. 메스 또는 박스 커터를 사용하여 기하학적 특징이 포함된 접시 중앙에서 PDMS 섹션을 잘라냅니다.
   7. PDMS를 단일 실험 조건에 대한 특징을 포함하는 약 10 x 10mm 정사각형으로 자른다. 이러한 프로토콜의 후속 단계에서 "스탬프"라고 합니다.
2. PDMS의 플랫 슬래브 생성
   1. PDMS 염기와 PDMS 경화제를 8:1 비율로 혼합합니다. 사용할 각 100mm 접시에 대해 약 20g을 준비합니다. 철저히 섞으세요.
   2. PDMS 혼합물을 건조기에서 30-60 분 동안 또는 모든 기포가 제거 될 때까지 탈기하십시오.
   3. PDMS를 깨끗한 100mm 접시에 천천히 고르게 붓습니다. 작업 표면에 접시를 탭하여 기포를 방출합니다.
   4. PDMS를 70°C에서 2시간 동안 구우십시오.
   5. 접시에서 PDMS를 제거합니다. 접시의 바닥과 접촉하던 PDMS의 표면이 위를 향하여 반전합니다.
   6. 3.1단계에서 생성된 각 스탬프에 대해 PDMS의 15 x 15mm 정사각형을 잘라냅니다. 이를 프로토콜의 후속 단계에서 "플랫 슬래브"라고 합니다.
3. 스텐실 생성
   1. 150mm 접시 의 뚜껑또는 다른 평평한 표면의 뚜껑에 PDMS의 평평한 슬래브를 배치하여 취급이 용이합니다. 슬래브 사이에 충분한 간격을 두도록 합니다(예: 150mm 접시의 경우 간격이 균일한 9개의 플랫 슬래브를 배치합니다).
   2. 3.1단계에서 생성된 각 스탬프를 PDMS의 평평한 슬래브로 반전하여 스탬프의 특징이 PDMS의 플랫 슬래브와 접촉하도록 합니다. 스탬프 상단을 집게로 가볍게 눌러 균일한 접촉을 보장합니다.
   3. PDMS 스탬프/슬래브를 들고 있는 뚜껑을 접시 바닥에 조심스럽게 올려 놓아 뚜껑이 비스듬히 놓여 있도록 합니다. 이것은 다음 단계에서 UV 경화 성 폴리머의 위킹을 돕습니다.
   4. 각 스탬프/슬래브 쌍의 상단 인터페이스에 UV 경화 폴리머를 작은 방울로 놓습니다. 중합체는 중력에 의해 지원되는 표면 장력에 의해 둘 사이에 사악해질 것입니다.
      참고: 많은 다른 UV 경화 성 폴리머는이 프로토콜에서 작동 할 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 속성에 대한 Norland 광학 접착제 74를 선택 : i) UV 빛에 노출시 빠른 경화, ii) 경화시 PDMS 스탬프에서 쉽게 제거, iii) 수동 압력유리 커버 슬립에 강력한 접착.
   5. 폴리머가 완전히 통과되면, 작업 표면에 스탬프 / 슬래브 쌍으로 뚜껑을 놓습니다. 각 스탬프/슬래브 인터페이스의 나머지 세 면 각각에 UV 경화 성 폴리머를 작은 방울로 놓습니다.
   6. 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 스탬프/슬래브 인터페이스의 가장자리 주위에 폴리머 방울을 연결합니다. 이렇게 하면 4단계에서 리간드 솔루션을 보유할 테두리가 만들어집니다.
      참고: 스탬프 가장자리 주변에서 폴리머를 작업할 때는 주의하십시오. 스탬프/슬래브 인터페이스가 중단되면 폴리머가 피처 아래에 심지 않고 스텐실이 제대로 형성되지 않습니다.
   7. 스탬프/슬래브 쌍을 UV 멸균 상자에 조심스럽게 놓습니다. 멸균 "Str" 전원 설정을 사용하여 10분 동안 노출하십시오.
   8. UV 멸균 상자에서 스탬프/슬래브 쌍을 제거합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 UV 경화 성 폴리머에서 형성 된 평평한 슬래브와 스텐실을 잡고 있는 동안 PDMS 스탬프를 부드럽게 제거하십시오.
   9. 집게를 사용하여 스텐실을 조심스럽게 제거하고 PDMS의 평평한 슬래브와 접촉한 표면이 위를 향하도록 반전시다.
      참고 : 스텐실은 섬세합니다. 특히 PDMS에서 처음 제거하는 동안 찢어지지 않도록 건네면서주의하십시오.
   10. 뒤집힌 스텐실을 다시 UV 멸균 상자에 넣습니다. 멸균 "Str" 전원 설정을 사용하여 3분 동안 노출합니다.

4. 커버립에 ECM 리간드 를 패터닝

1. 산 세척 커버슬립에 스텐실을 누르기
   1. 각 스텐실에 대해 산으로 세척된 커버슬립 하나를 깨끗한 실험실 필름 위에 놓습니다.
   2. 집게를 사용하여 각 스텐실을 평평하게 평평하게 산세척 커버슬립에 조심스럽게 놓습니다. 피처가 커버슬립 중앙에 배치합니다.
   3. 각 스텐실 위에 작은 실험실 필름을 놓습니다. 스텐실을 단단히 고르게 눌러 스텐실과 커버슬립 사이에 강한 접촉을 만듭니다.
      참고 : 이것은 중요한 단계입니다! 스텐실의 전체 표면을 단단히 누릅니다. 충분한 접촉이 생성되지 않으면, 리간드 용액은 스텐실과 커버슬립 사이에 누출되고 패터닝이 실패합니다. 선택 사항: 스텐실과 커버슬립 사이의 충분한 접촉을 확인하기 위해, 피펫 100 μL의 초순수 멸균수를 각 스텐실의 표면에 및 실온에서 배양한다. 1 시간 후 누출 여부를 확인하십시오. 성공적으로 접착 된 스텐실에서 물을 흡인하고 진행합니다.
2. 플라즈마 는 친수성을 증가스텐실 커버립의 표면을 청소
   1. 스텐실이 있는 커버슬립을 플라즈마 클리너에 넣습니다. 30s에 대한 고출력 플라즈마를 적용합니다.
3. ECM 리간드 용액의 제조
   참고: 모든 후속 단계는 가능하면 멸균 조건에서 완료되어야 합니다.
   1. 멸균 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 용액을 얼음 위에 놓습니다. 얼음이 차가워지면 마트리겔과 콜라겐을 첨가하여 각각 225 μg/mL 및 25 μg/mL의 농도를 달성합니다. 선택 사항: 문제 해결 또는 리간드 시각화를 위해 리간드 솔루션에 형광 태그가 지정된 리간드를 포함하십시오.
      1. 참고: 이 방법과 함께 다른 ECM 리간드를 사용할 수 있습니다. 상이한 리간드의 경우 이상적인 농도, 배양 시간 및 인큐베이션 온도를 결정하기 위해 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
   2. 각 스텐실의 표면에 리간드 용액을 피펫. 10 x 10mm 정사각형 스탬프로 만든 스텐실의 경우 스텐실당 100 μL을 적용합니다.
   3. 스텐실 피처의 기포를 확인합니다. 필요한 경우 미세 팁 집게 또는 2 μL 파이펫 팁을 사용하여 피처에서 기포를 제거합니다.
      참고 : 이것은 중요한 단계입니다! 기포가 커버슬립 표면에 갇혀 있으면 리간드는 표면에 흡착되지 않으며 결과 패턴은 불완전합니다.
   4. 스텐실 드 커버립을 리간드로 접시에 넣고 실험실 필름으로 감싸고 밤새 4 °C에서 배양합니다.

5. 리간드를 폴리아크릴아미드 젤로 이전

1. 각 커버슬립에서 리간드 용액 및 스텐실 제거
   1. 스텐실 표면에서 리간드 용액을 흡인합니다. 리간드 용액은 4°C에서 수집 및 저장하고 최대 1개월 동안 재사용할 수 있다.
   2. 집게를 사용하여, 스텐실로 커버 슬립을 잠깐 물에 담그고 멸균 된 PBS가 들어있는 접시에 씻으소서.
   3. 스텐실로 커버슬립을 잠깐 담그고 세척할 멸균 PBS의 두 번째 접시에 담급전시다.
   4. 커버슬립 표면에서 스텐실을 제거합니다. 커버슬립이 파손되지 않도록 주의하십시오.
   5. 커버슬립을 초순수 멸균수가 들어 있는 접시에 잠기고 PBS 세척에서 소금을 제거합니다. 커버슬립의 가장자리를 터치하여 섬세한 작업 용 닦아 여분의 물을 심지.
   6. 질소와 같은 불활성 가스 하에서 커버슬립을 건조시고 말립니다. 커버슬립 의 아래쪽을 표시하여 이 지점에서 앞으로 방향을 추적합니다. 패턴이 있는 면이 위를 향하도록 주의하십시오.
   7. 스텐실 커버슬립마다 5.1.1~5.1.6단계를 반복합니다.
2. 패턴 커버슬립폴리아크릴아미드 하이드로겔 만들기
   참고 : 추가 세부 사항^7,9 밤새 10 % 표백제로 세척하여 폴리 아크릴 아미드 젤을 만드는 데 사용되는 모든 캡 홀더, 튜브 및 스페이서를 살균, 표백제를 제거하기 위해 적어도 5 번 물로 헹구고, 70% 에탄올로 간략하게 세척하십시오. 모든 조각을 멸균 된 생체 안전 성 캐비닛에 섬세한 작업 와이프에 놓고 사용하기 전에 건조시십시오.
   1. 원하는 하이드로겔 탄성을 얻기 위해 폴리아크릴아미드 용액을 준비한다(표2). 형광 미소구와 황산 칼륨 (PPS)을 제외한 모든 구성 요소를 함께 섞습니다.
      참고: 매번 신선한 1% 황산 칼륨 용액을 준비하십시오.
   2. 폴리아크릴아미드 용액, 마이크로스피어 및 PPS를 진공 하에서 별도의 튜브로 30분 동안 탈기합니다.
   3. 각 패턴 커버 슬립에 대해, 위에 배치 스페이서 (18mm 외부 직경, 14mm 내경)와 글루타랄데히드 활성화 "바닥"커버 슬립을 준비합니다.
   4. 탈기 후, 잠시 마이크로 스피어를 초음파 처리하고 폴리 아크릴 아미드 용액에 적절한 볼륨을 추가합니다. 기포를 도입하지 않도록 주의하여 위아래로 파이펫팅하여 섞어 주세요. 간략하게 초음파 처리합니다.
   5. 폴리아크릴아미드 용액에 적절한 PPS 부피를 추가합니다. 기포를 도입하지 않도록 주의하면서 용액을 혼합하기 위해 위아래로 파이펫을 하십시오.
      참고 : PPS를 추가 한 후 폴리 아크릴아미드가 중합되기 전에 5.2.6 ~ 5.2.11 단계를 완료하기 위해 신속하게 작업하십시오.
   6. 피펫 75-150 μL (스페이서의 두께에 따라 다름)은 각 글루타랄데히드 활성화 커버 슬립의 중심에.
   7. 집게를 사용하여, 폴리아크릴아미드와 스페이서와 각 글루타랄데히드 활성화 커버 슬립에 패턴 커버 슬립을 배치, 패턴 리간드는 폴리 아크릴아미드 용액을 직면하도록. 충분한 폴리아크릴아미드 용액이 첨가되면 표면 장력은 두 개의 커버립 사이에 폴리아크릴아미드를 심지며 기포가 존재하지 않습니다.
   8. 각 폴리 아크릴 아미드 "샌드위치"를 선택하고 조심스럽게 여분의 폴리 아크릴 아미드 용액을 심지 섬세한 작업 닦아 측면에 터치합니다.
   9. 각 폴리아크릴라미드 "샌드위치"를 15mL 원추형 튜브와 호환되는 실이 있는 캡 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 방향은 글루타랄데히드 커버슬립의 바닥이 캡 홀더의 바닥과 접촉하고 패턴 커버슬립이 맨 위에 있도록 해야 합니다.
   10. 각 캡 홀더에 15mL 원추형 하단 튜브를 나사로 조여 폴리아크릴아미드 "샌드위치"를 제자리에 고정시십시오. 튜브는 누출을 방지하기 위해 단단해야하지만, 과도하게 조이고 커버 립을 균열하지 않도록주의해야합니다.
   11. 실온에서 10 분 동안 200 x g의 스윙 버킷튜브에 폴리 아크릴 아미드 "샌드위치"를 원심 분리합니다. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 튜브 랙에 배치하여 배향을 50분 더 유지하여 완전한 중합을 보장합니다. 형광 소구의 표백을 방지하기 위해 호일로 덮여 유지.
       참고: 이 방법을 사용하여 TFM을 수행할 때는 원심분리가 매우 중요합니다. 원심력은 모든 마이크로스피어를 단일 평면으로 이동하여 궁극적으로 하이드로겔의 표면 바로 아래에 있게 됩니다. 이는 세포에서 생성된 견인 응력을 계산하는 데 사용되는 이미징 마이크로스피어 변위에 이상적입니다. TFM을 수행하지 않을 경우, 마이크로스피어는 폴리아크릴아미드 용액에서 빠져나올 수 있으며 원심분리 없이 벤치탑에서 중합이 발생할 수 있다.
   12. 튜브에서 중합 폴리아크릴아미드 "샌드위치"를 제거하고 100mm 접시에 PBS에 잠급니다. 실험실 필름으로 감싸고 실온에서 3 시간 동안 또는 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
3. 파종 세포를위한 패턴 젤의 준비
   1. 메스와 집게를 사용하여 PBS에 잠긴 채로 폴리아크릴아미드 "샌드위치"에서 패턴 커버슬립과 스페이서를 조심스럽게 제거합니다. 패턴 리간드는 중합 동안 폴리아크릴아미드로 옮겨지고 커버슬립을 제거한 후에도 유지됩니다. 폴리아크릴아미드 겔은 글루타랄데히드 활성화 커버슬립에 부착된 상태로 유지됩니다.
      참고 : 이것은 중요한 단계입니다! 폴리아크릴아미드는 커버슬립을 제거하거나 리간드 패턴이 파괴되는 동안 PBS에 잠겨 있어야 합니다.
   2. 패턴 폴리아크릴아미드가 있는 각 커버슬립을 캡 홀더에 넣습니다. 커버슬립 상단과 스페이서가 위치한 폴리아크릴아미드 주변에 개스킷(외경 18mm, 내경 14mm)을 놓습니다. 톱질된 15mm 원추형 하단 튜브를 캡 홀더에 끼우는 모양의 폴리아크릴아미드를 하단에 잘 형성합니다. 이 어셈블리는 표준 12웰 플레이트의 웰에 맞아 취급이 용이합니다.
   3. 웰 어셈블리에 PBS 500 μL을 추가하여 각 젤을 세척합니다. 부드러운 흔들림으로 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. PBS를 제거하고 총 3번의 세차서를 두 번 반복합니다.
   4. 최종 PBS 세척 후, 500 μL의 녹아웃-DMEM 매체를 겔에 넣고 밤새 37°C에서 배양합니다. 겔은 세포 를 파종하기 전에 최대 5 일 동안 매체와 함께 37 °C에서 보관될 수 있다.
   5. 파종 세포 전날, 완전한 KSR 매체를 위해 녹아웃-DMEM을 대체하고 밤새 37°C에서 배양한다.

6. 패턴 젤에 hESCs 배합

참고 : TFM 후 면역 염색을위한 샘플을 수정할 계획이라면 세포를 파종하기 전에 스트레스가없는 미소 구 위치의 이미지를 가져 가라. 이 경우, 형광 태그 리간드는 세포의 최종 위치가 파종 및 마이크로 스피어가 그 지역에서 이미지 화 될 수 있도록 단계 4.3.1에서 사용되어야한다.

1. 앞서 설명한 바와 같이 패턴 폴리아크릴아미드 겔에 파종하기 전에 컨디셔닝된 KSR 배지에서 마트리겔 코팅 플레이트상에 제조된 스톡 hESC 배양및 이차 피더 프리^{배양액을 유지한다 9.}
   참고: 4 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 보충된 KSR 매체에서 조사된 마우스 배아 섬유아세포를 배양하여 컨디셔닝된 KSR 매체를 생성합니다. 24시간마다 미디어를 수집하고 교체합니다.
2. hESCs에서 미디어를 흡인합니다. 녹아웃-DMEM 미디어로 간단히 씻으시다. 0.05% 트립신-EDTA를 10 μM Y27632(로키나제 억제제)로 보충하고 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
3. 트립신을 억제하기 위해 세럼과 미디어를 추가합니다. 접시 위에 매체와 파이펫을 부드럽게 흡인하여 세포를 제거합니다. 모든 세포를 제거하고 단일 셀에 세포 클러스터를 해리하기 위해 부드럽게 파이펫팅을 계속합니다.
4. 세포 현탁액과 원심분리기를 200 x g에서 3분 동안 모읍시다.
5. 상판을 흡인하고 세척할 KSR 매체의 동등한 부피에 펠렛을 다시 일시 중단한다. 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리기.
6. 상판을 흡인하고 10 ng/mL bFGF 및 10 μM Y27632로 보충된 컨디셔닝된 KSR 매체에서 펠릿을 재중단시켰다.
7. 혈세포계로 세포를 계산하고 세포 현탁액을 mL당 300,000 세포의 농도로 조정합니다. 각 패턴 겔 상에 세포 현탁액의 피펫 500 μL(겔당 150,000세포).
8. 3 시간 시딩 후, 파이펫을 사용하여 각 젤에서 조심스럽게 매질을 흡인하고 10 ng/mL bFGF 및 10 μM Y27632로 보충된 신선한 컨디셔닝된 KSR 매체로 교체합니다. 이것은 폴리아크릴아미드의 패턴화 된 영역에 부착하지 않은 과잉 세포를 제거합니다.
   참고 : 이것은 중요한 단계입니다! 이 단계에서 세포는 패턴 리간드에 느슨하게 부착될 것이다. 세포를 분리하지 않도록 미디어를 교환 할 때 매우 주의하십시오. 후속 단계에서 각 미디어 스왑에 대해 동등한 주의를 기울여야 합니다.
9. 24 시간 시딩 후, 파이펫을 사용하여 조심스럽게 매체를 흡인하고 10 ng/mL bFGF 및 5 μM Y27632로 보충된 컨디셔닝된 KSR 매체를 교환한다.
10. 48 시간 시딩 후, 파이펫을 사용하여 조심스럽게 매체를 흡인하고 10 ng/mL bFGF로 보충된 컨디셔닝된 KSR 매체를 교환한다. 이를 제거한 로키나제 억제제는 매체로부터 제거하고 시딩 후 72시간 다음날 실험을 시작할 수 있다.

7. TFM 수행

1. 원하는 경우, 원하는 실험 조건하에서 앞서 설명한^{대로 TFM을} 9로 수행하십시오.
2. 스트레스를 받지 않은 마이크로스피어 위치가 시딩 세포 전에 이미지화된 경우, 스트레스가 있는 마이크로스피어 위치를 취한 후 세포를 수정하고 면역 염색을 수행하여 높은 견인력과 낮은 견인력의 영역에 비해 관심 있는 단백질의 국소화를 결정합니다.

결과

규정을 준수하는 기판상에서 제어된 기하학의 콜로니에서 hES를 배양하려고 시도할 때 극복해야 할 주요 과제는 기판의 표면에 ECM-리간드의 균질한 패턴을 생성하는 것이다. 이 방법에 제시된 전략은 먼저 유리 커버슬립의 표면에 원하는 패턴을 생성한 다음 겔의 중합 동안 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 그 패턴을 전달하는 것을포함한다(그림 1) A).따라서, 하이드로겔의 중합 및 패턴의 전달을 진행하기 전에 유리 커버슬립의 표면에 원하는 패턴이 성공적으로 생성되도록 하는 것이중요하다(도 1B). 폴리아크릴아미드로 전달된 형광 리간드 패턴의 이미징에 기초하여, 리간드는 폴리아크릴아미드의 표면에서 단일 평면에만 존재하는 것으로 보이지만, 우리는 이 층의 두께를 정확하게 특성화하지는 않았다. 유리 커버 슬립에...

토론

길고 상세한 프로토콜을 단순화하기 위해, 이 방법은 세 가지 중요한 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 유리 커버립에 ECM 리간드의 생성 패턴, 2) 겔의 중합 동안 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔로 패턴을 전송, 3) 에 시종 hESCs 패턴 하이드로겔. 이 세 단계 각각에서 고려해야 할 중요한 단계가 있습니다. 유리 커버립에 고충실도 패턴을 생성하기 위해 스텐실은 리간드 용액의 누출을 방지하기 위해 커버 슬립에 단단히 눌러야하며 스텐실 표면에 리간드 용액을 추가 한 후 모든 기포를 제거해야합니다 . 그림 1C). 리간드 용액이 커버슬립과의 불량한 접촉으로 인해 스텐실을 통해 누출되는 경우, 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 전체 표면으로 이송될 것이며, hESCs는 원하는 콜로니 형상에 국한되지 않을것이다(도 4C). 폴리아크릴아미드에 패턴 리간드를 전송하는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신	Gibco	25300054
100mm 유리 페트리 접시	Fisher Scientific	08-747B
100mm 플라스틱 페트리 접시	Fisher Scientific	FB0875712
15mL 원추형 바닥 튜브	Corning	352095
150mm 플라스틱 페트리 접시	Fisher Scientific	FB0875714
18mm 직경 #1 커버슬립	Thermo Scientific	18CIR-1
2% 비사아크릴아미드	Bio-Rad	161-0142
3-아미노프로필트리메톡시실란	ACROS Organics	313251000
40% 아크릴아미드	Bio-Rad	161-0140
알루미늄 호일	Fisher Scientific	01-213-100
염기성 섬유아세포 성장 인자	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
원심분리기(스윙 버킷 포함)	Eppendorf	22623508	모델: 5804 R
콜라겐	코닝	354236
데시케이터	Fisher Scientific	08-642-7
에탄올	Fisher Scientific	AC615095000
태아 소 혈청	Gibco	16000044
형광 마이크로스피어	Thermo Scientific	F8821
집게 (커버슬립용)	Fisher Scientific	16-100-122
집게 (웨이퍼용)	Fisher Scientific	17-467-328
겔 홀더	N/A	N/A	겔 홀더는 맞춤형 3D 프린팅 가능, 요청 시 CAD 도면 제공
글루타르알데히드	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
핫 플레이트	Fisher Scientific	HP88854100
염산	Fisher Scientific	A144S-500
이소프로필 알코올	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes(섬세한 작업용 물티슈)	Kimberly-Clark Professional	34120
녹아웃 세럼 교체용	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
마스크 얼라이너(포토리소그래피용)	Karl Suss America, Inc.	Karl Suss MJB3 Mask Aligner
Matrigel	Corning	354277
견인력용 현미경	Nikon	N/A	모델: Eclipse TE200 U
전동 포지셔닝 스테이지	Prior Scientific	N/A	모델: HLD117
질소 가스	Airgas	NI 250
Norland 광학 접착제 74 (UV 경화형 폴리머)	Norland 제품	NOA 74
오븐	Thermo Scientific	PR305225G
파라필름(실험실 필름)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS(Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	포토마스크는 맞춤 제작됩니다. 요청 시 설계에 대한 CAD 도면 제공
플라즈마 클리너	Fisher Scientific	NC9332171
개스킷용 플라스틱	Marian Chicago	HT6135
스페이서용 플라스틱	TAP 플라스틱	N/A	폴리카보네이트 시트, .01인치 두께
염화칼륨(PBS 제조용)	Fisher Scientific	P217-500
인산칼륨 일염기성 (PBS 제조용)	Fisher Scientific	P285-500
과황산포타슘	ACROS Organics	424185000
Scalpel	Fisher Scientific	14-840-00
실리콘 웨이퍼	전자 현미경 과학	71893-06	Type P, 3 inch, 실리콘 웨이퍼
염화나트륨 (PBS 제조용)	Fisher Scientific	S271-1
수산화나트륨	Fisher Scientific	S318-100
인산나트륨 이염기성 이수화물(PBS 제조용)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050 포토레지스트	MicroChem	SU8-3000
SU8-Developer	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
UV 살균 상자	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS Gene Linker UV 챔버
Y27632 (Rho kinase inhibitor)	StemCell Technologies	72304