Method Article

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

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우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

Abstract

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바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.

Introduction

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유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한....

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Protocol

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여기에 설명된 모든 방법은 다나 파버 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다(프로토콜 번호 16-024).

1. 실험에 필요한 솔루션 준비

  1. 멸균수로 10x HBSS를 희석하여 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 1회 준비합니다. 용액을 얼음에 미리 식힙니다. 각 샘플에 대해 최소 25mL의 용액이 필요합니다.
  2. 10x 멸균 HBSS 1:10을 밀도 그라데이션 매미(즉, Percoll)와 혼합하여 동위 원소 퍼콜 용액(IPS)을 준비합니다. 얼음에 미리 식히세요.
    참고: IPS는 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 유세포분석(FACS) 차단(BL) 용액(1% 소 혈청 알부민[BSA], 5% 태아 소 혈청 [FBS]를 인산완충식염수[PBS])에 준비한다. 얼음에 미리 식히세요.

2. 심장 내 관류 및 조직 해부에 의한 동물 안락사

참고: 8주 된 C57BL/6J 마우스, 어느 성별, 실험에 사용 되었다. PBS 용액을 가진 관류는 조직 소화로 진행하기 전에 장기에서 혈액 오염을 제거하기 위해 수행됩니다.

  1. ....

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Results

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우리는 마우스 뇌와 척수에 적용된 두 가지 균질화 방법(DH 대 PD)을 비교하여 다운스트림 애플리케이션에 적합한 다양한 생존 세포 유형을 검색하는 효율성을 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 마이크로글리아, 림프구, 뉴런, 성상 세포, 올리고덴드로시테 및 내피를 포함한 다른 CNS 세포 유형을 특성화하도록 설계된 9 색 유동 세포 분석 패널을 이용했습니다.

뇌 및 척수 조직은 상이한 마우스로부터 회수되었고(n ≥ 6), 세로로 두 개의 반으로 분할, 계량 및 Dounce 균질화(DH 방법)를 사용하여 기계적 중단을 적용하여 병렬로 처리되거나, 파파인(PD 방법)에 기초한 상용 NTDK를 사용하여 효소적으로 부드럽게 다듬고 소화하였다(그림1A). 파편 제거 후, 뇌 또는 척수로부터의 세포를 각각 1/10 또는 1/2-1/5로 희석하여, 트리판 블루에서 Neubauer 챔버로 세포 수율 및 생존가능.......

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Discussion

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본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 적용되었다14. 그러나 조직학은 처리성이 결여되어 있으며 동시에 분석할 수 있는 마커의 수가 제한되어 있기 때문에 동일한 조직학적 샘플에서 여러 특징을 포괄적으로 검사할 수 없습니다. 우리의 접근 방식은 전통적인 장기학적 분석에 보완될 수 있으며, 개별 샘플에서 얻을 수 있는 정보의 컴파일을 확장하기 위해 여러 다운스트림 애플리케이션(분류, 1차 문화, 생화학 적 또는 차세대 시퀀싱 분석)과 결합될 수 있습니다.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS(칼슘, 염화마그네슘 및 황산마그네슘)Gibco14185-052
70mm 세포 여과기Corning431751
ACSA/ACSA2 항마우스 항체Miltenyi Biotec130-117-535APC 접합
소 혈청 알부민시그마 AldrichA9647-1KG
CD11b 쥐 항마우스 항체Invitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 복합
CD31 쥐 항 마우스 항체BD Bioscience562939BV421 결합
CD45 쥐 항 마우스 항체Biolegend103138Brilliant Violet 510 결합
CD90.1/Thy1.1 쥐 항 마우스 항체Biolegend202518PE/Cy7 결합
CD90.2/Thy1.2 쥐 항 마우스 항체Biolegend1005325PE/Cy7 활용
원뿔형 튜브(15mL)CellTreat229411
원뿔형 튜브(50mL)CellTreat229422
Dounce 조직 분쇄기 세트(모르타르와 유봉 A 및 B 포함)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc(CD16/CD32) 블록 랫트 안티 마우스 항체BD Pharmingen553142
Fetal Bovine SerumBenchmark100-106
신경 조직 해리 키트 (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 안티 마우스/랫트/인간 항체Miltenyi Biotec130-095-895비오틴 접합
PercollGE 헬스케어10266569비멸균 시약으로 판매
PercollSigma65455529멸균 시약(멸균이 필요한 응용 분야에 사용)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01미량의 내독소를 함유
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 conjugated
한 시약

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

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