NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

Summary

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

Abstract

NEMO는 키나아제 IKKα 및 IKKβ와 함께 IKK 복합체를 조립함으로써 NF-θB 통로에서 필수적인 역할을 하는 스캐폴딩 단백질이다. 활성화시, IKK 복합체는 NF-θB 핵 전좌 및 표적 유전자의 활성화로 이어지는 IθB 분자를 인산화한다. NEMO/IKK 상호 작용의 억제는 NF-θB 통로 활동의 변조를 위한 매력적인 치료 패러다임, 억제제 설계 및 발견을 위한 NEMO를 표적으로 만들기. NEMO 억제제의 발견 및 최적화 과정을 용이하게 하기 위해, 우리는 작은 분자량 억제제에 결합하는 동안 아포 형태로 단백질의 구조 측정을 허용하는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 구성을 설계했습니다. 여기서는 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 설계, 표현 및 구조적 특성화에 활용되는 전략을 제시합니다. 단백질은 대장균 세포에서 발현되고, 변성 조건 하에서 용해되고 3개의 크로마토그래피 단계를 통해 정제된다. 구조 측정을 위한 결정 얻기 위한 프로토콜에 대해 논의하고 데이터 수집 및 분석 전략을 설명합니다. 프로토콜은 NEMO 및 소분자 억제제의 복합체의 구조 결정에 넓은 적용성을 찾을 수 있습니다.

Introduction

NF-θB 통로는 사이토카인, 미생물 생성물 및 스트레스를 포함하는 다양한 자극에 반응하여 활성화되어, 염증 및 면역 반응, 세포 사멸 또는 생존 및 증식을 담당하는 표적 유전자의 발현을 조절한다^1. 염증성 및 자가면역질환 및^암을포함하는 병리학2,^3,4,5는 NF-θB 활성의 변조를 새로운 치료법의 개발을 위한 주요 표적으로 삼고 있는 경로의 과활성화와 상관되어 있다^6,7.

정식 NF-θB 통로는 특히 비정형 경로로부터 구별되며, 림프형성 및 B 세포 활성화를 담당하며, 비계 단백질 NEMO(NF-θB 필수 변조기^8)에대한 전의 의존성으로 인해 IKK 복합체의 키나세 IKK및 IKKk와 의 조립된다. IKK 복합체는 분해를 대상으로 하는 IθBα(θB의 억제제)의 인산화를 담당하며, NF-θB 이dim제가 유전자 전사^1을 위해 핵으로 전이되도록 해방시키고, 따라서 NF-θB 활성을 조절하는 억제제의 개발을 위한 매력적인 표적이된다.

우리의 연구는 NEMO와 IKKβ 사이의 단백질-단백질 상호 작용의 특성화에 초점을 맞추고, IKK 복합체 형성의 소분자 억제제개발을 위해 NEMO를 표적으로 합니다. IKKβ를 결합하는 데 필요한 NEMO의 최소 결합 도메인은 잔기 44-111을 포함하며, 그 구조는 IKKβ 서열 701-745^9에대응하는 펩티드와 함께 복합적으로 결정되었다. NEMO 및 IKKβ는 NEMO 디머가 연장된 상호 작용 인터페이스를 가진 길쭉한 열린 홈에서 IKKβ(701-745)의 두 가지 나선을 수용하는 4-나선 번들을 형성합니다. IKKβ (734-742), 또한 NEMO 바인딩 도메인으로 알려진 (NBD), 바인딩에 대 한 가장 중요 한 핫스팟을 정의, 어디 두 개의 필수 트립토판스 (739,741) NEMO 주머니 내에서 깊이 묻혀. 복잡한 구조의 세부 사항은 NEMO를 표적으로 하는 작은 분자 억제제의 구조 기지를 둔 디자인 그리고 최적화에서 원조할 수 있습니다. 동시에, 결정에서 관찰된 바와 같이, 결정에서 관찰된 바와 같이, 소분자 또는 펩티드의 결합이 NEMO에서 완전한 형태 변화(즉, NEMO 코일 코일-코일 디머의 광범위한 개구부)를 재구성하는 것은 어렵다, 및 작은 분자 억제제에 결합된 UNBOUND NEMO 또는 NEMO의 구조는 더 나은 표적 을 위한 표적 을 나타낼 수 있다.

IKK 결합 도메인을 포괄하는 전체 길이 NEMO 및 더 작은 잘림 구조는 X선 결정학 및 핵 자기 공명(NMR) 방법^10을통해 언바운드 형태로 구조 측정을 위해 난치성으로 입증되었으며, 이는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 버전을 설계하도록 유도했습니다. 실제로, 언바운드 형태의 NEMO (44-111)는 부분적으로 접혀 있고 형태 교환을 거치므로 IKKβ에 대한 결합 친화도를 유지하면서 그 다이머지 구조, 코일 코일 접기 및 안정성을 안정화하도록 설정합니다. 단백질의 N-및 C-termini에서 이상적인 디메릭 코일 코일 코일 서열^11의 3개의 heptads를, 그리고 4점 돌연변이의 시리즈를 결합하여, 우리는 NEMO-EEAA, 완전 증분 및 코일 코일에 접힌 구성을 생성하여, 전체 길이 NEMO^1에대해 관찰된 바와 같이 나노몰 범위에 IKK 결합 친화도를 구출하였다. 추가적인 이점으로, 우리는 코일 코일 어댑터(GCN4 서열에 기반)가 결정화를 용이하게 하고 결국 분자 교체를 통한 X선 구조 결정에 도움이 되기를 희망했습니다. 코일 코일 어댑터는 유사하게 안정성을 높이고, 용액 거동을 개선하며, 트리머 코일 코일 및 항체^{단편(13,14)에}대한 결정화를 용이하게 하기 위해 유사하게 이용되고 있다. NEMO-EEAA는 대장균 세포에서 쉽게 발현되고 정제되며, 용해성이며, 안정된 디메릭 코일 코일 코일에 접혀 1.9 Å로 회절하여 쉽게 결정화됩니다. GCN4의 주문된 코일 코일 영역의 존재는 GCN4^15의공지된 구조를 사용하여 분자 대체에 의해 NEMO-EEAA의 결정으로부터 데이터를 스테이징하는 데 추가로 도움이 될 수 있다.

apo-NEMO-EEAA로 얻은 결과를 감안할 때, 우리는 여기에 기술된 프로토콜이 NEMO 억제제(NBD 펩티드 와 같은) 또는 소분자 억제제의 존재 시 NEMO-EEAA의 결정화에도 적용될 수 있다고 믿으며, 이는 초기 억제제의 NEMO 억제 및 구조 기반 최적화에 대한 요구 사항을 이해하는 것을 목표로 합니다. 많은 코일 코일 도메인^(16)의가소성과 동적 특성을 감안할 때, 코일 코일 어댑터의 사용은 구조적 결정에 도움이 더 일반적인 적용성을 찾을 수 있습니다.

Protocol

1. 결정학을 위한 구조물의 디자인

1. N-말단 헥사-히스티딘 태그 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 T7 프로모터를 사용하여 대장균에서 발현을 위한 벡터에서 이전 간행물^12에서와 같이 NEMO-EEAA의 서열을 복제한다.
   참고: 본 프로토콜에서는 N-말단 헥사-히스티딘 태그 및 담배 식각 바이러스(TEV) 절단^{부위(10)를}포함하도록 수정된 벡터를 사용하였다. 이 벡터는 단백질 결정화를 위한 그의 태그의 절단을 용이하게 하고 원하는 단백질 서열의 개시 전에 GSW 잔기의 짧은 연장만남긴다. 이 벡터가 파생된 벡터와 대체 벡터는 재료 표에나열됩니다. 본 프로토콜에서, 본래 의 NEMO(44-111) 서열에 대한 후속 변형은 앞서^10일설명한 바와 같이, 측면 지시 돌연변이 발생을 사용하여 단계적으로 도입되었다. 우리는 처음에 N-단말 또는 C 단말 말단 또는 둘 다에 이상적인 코일 코일 어댑터(적어도 3개의 햅타 길이)를 더하여 NEMO 코일 코일 이광을 안정화시키려고 시도했습니다. 이중 코일 코일은 이전 결정화 시험으로부터 가장 유망한 것이었고, 이전에^12일설명한 바와 같이 결정화를 개선하기 위해 돌연변이를 도입하여 이후에 변형되었다.

2. 그의₆ 태그 NEMO-EEAA의 대규모 표현

1. 구사를 BL21(DE3) 유능한 세포로 변환합니다. 세포 글리세롤 스톡으로 -80°C에 보관하십시오.
2. 1일차 – 세포 스타터 배양을 준비합니다. 125 mL Erlenmeyer 플라스크에 20 mL의 훌륭한 국물 용액과 Ampicillin의 100 mg/mL 스톡20 μL을 추가하십시오. 세포 글리세롤 스톡의 몇 마이크로리터를 추가합니다(벡터로 형질전환된 BL21(DE3)의 유능한 세포의 -80°C 저장으로부터).
3. 37°C, 220 rpm(약 15시간)에서 밤새 10 mL 스타터 배양액을 흔들어 줍니다.
4. 일 2 – 스타터에서, OD에 희석₆₀₀ = 0.1 에 250 훌륭한 국물의 mL. 100 μg/mL의 최종 농도에 암피실린을 추가합니다. OD₆₀₀ = 0.8-1.0으로 증가합니다.
   1. 이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드(IPTG)를 500 μM에 넣고 37°C에서 4시간 동안 자랍니다.
   2. 4 시간 후 유도 배양의 OD_600을 측정 배양은 OD₆₀₀ = 6-10에 도달해야 한다.

3. 그의₆ 태그 NEMO-EEAA의 정화

1. 4°C에서 20분 동안 3,800 x g에서 세포 배양을 스핀다운합니다.
2. 세포 펠릿을 저장하고 매체를 폐기하십시오.
   참고 : 세포 펠렛은 나중에 정제를 위해이 시점에서 -20 °C에서 저장및 보관 할 수 있습니다.
3. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl_2,0.5 mM 페닐메틸설포닐 불소, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), 및 벤조나아제 핵아제의 3 μL을 포함하는 용해 완충액의 40 mL에서 세포를 다시 중단.
   참고 : 니켈 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 컬럼활용 2mM DTT와 호환됩니다. 대안적으로, 0.2 mM 트리스(2-카박스체틸)인 포스핀(TCEP)을 활용할 수 있다.
4. 다시 일시 중단된 세포를 두 개의 20-25 mL aliquots로 분할합니다.
5. 프렌치 프레스 (대략 압력 25,000 psi)를 사용하여 세포를 리액화하고 각 aliquot (냉장실에서)에 대해 2-3 회 반복합니다.
   참고 : 또는, 세포는 초음파 처리에 의해 lysed 될 수있다 (이 프로토콜에서 테스트되지 않음).
6. 세포 용해액에 우레아를 8 M의 최종 농도로 추가하고, 최소 2 시간 또는 최대 하룻밤 동안 흔들리는 플랫폼에서 배양 할 수 있습니다. 투석을 제외한 모든 다음 정제 단계는 실온에서 수행 될 수 있습니다.
7. 일 3 – 울트라 원심 분리 튜브와 균형 무게에 매액을 전송, 적어도 로 튜브를 채우기 를 보장 3/4 전체. 용해액을 125,000 x g에서 25°C에서 45분 동안 돌이꿉습니다. 열에 로드하기 위한 100 mL 비커에 상급을 데칸트합니다.
   참고: 4°C에서 원심분리하면 우레아가 충돌합니다.
8. 빠른 액체 크로마토그래피 시스템에서 IMAC 5 mL 컬럼에서 에탄올을 제거하여 25 mL의 초순수 H₂O를 5 mL/min에서 제거합니다. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, 다음 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, 8 mure8를 포함하는 용출 완충제의 25 mL.
9. 우레아를 IMAC 컬럼에 3 mL/min에서 상수로 배양하여 흐름을 수집합니다. 3 mL /min에서 바인딩 버퍼로 10 개의 열 볼륨에 대해 열을 세척합니다.
10. 20 mMM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0을 포함하는 3 mL / min에서 20 개의 열 볼륨에 대한 재 접기 버퍼로 열을 세척하여 열에 NEMO-EEAA 구문 재접지.
11. 12열 부피 그라데이션에서 10~500mM MM Imidazole에서 NEMO-EEAA의 그라데이션 용출을 수행하고 분획 수집 플레이트(1 mL 분수)에서 모든 용루를 수집합니다.
12. 두 개의 열 볼륨에 대해 500 mM imidazole에서 용출을 계속하고 수집을 계속합니다.
13. 도데실 황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)을 실행하여 용출 분획에서 NEMO-EEAA 존재를 결정한다.
    참고 : 우리는 10 % 아크릴 아미드, MES 버퍼를 사용했다.
14. 순수 표적 단백질을 함유하는 풀 분획체.
15. 브래드포드^분석17에의한 단백질 농도 측정.
    참고: 태그 절단에 대한 프로테아제의 양을 추정하는 데 필요합니다.

4. 그의₆ 태그 분열과 정화

1. TEV의 1:10 중량 비에 TEV를 추가: NEMO-EEAA 단백질은 그의₆ 태그를 갈라. TEV 프로테아제는 집에서 정제되었습니다.
   참고: 완전한 절단에 필요한 TEV의 양, 시간 및 온도를 별도로 최적화합니다.
   1. Express TEV 프로테아제, S219V 돌연변이체^18에서 BL21(DE3)-RIL 세포및 앞서 설명한 바와 같이^{정제한다.} 2단계에서 설명한 바와 같이 세포를 간략하게 성장시키고, 프랑스 언론에 의해 라이즈하고 IMAC 컬럼을 사용하여 정제한다. 최종 단백질을 25 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v 글리세롤에 저장합니다.
2. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0의 4 L에서 밤새 샘플을 투석하여 분열을 허용하고 후속 정제를 위해 샘플로부터 과잉 이미다졸을 제거하였다.
3. 일 4 – 투석에서 샘플을 제거합니다. TEV 절단에서 샘플의 SDS-PAGE 젤을 실행하여 절단이 완료되었는지 확인합니다.
4. 빠른 액체 크로마토그래피 시스템에서 5 mL/min에서 25 mL의 초순수 H₂O로 IMAC 5 mL 컬럼에서 에탄올을 제거하십시오. 이어서 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0을 포함하는 용출 완충제 25 mL, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2mMDTT, pH 8.0을 포함하는 결합 버퍼가 뒤따랐다.
5. TEV-크리브 NEMO-EEAA로 컬럼을 1mL/min으로 로드합니다. 절단된 NEMO-EEAA는 유동을 통해 용해됩니다: 96웰 분획 플레이트(1 mL 분획)에서 수집한다. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole의 5 개의 컬럼 볼륨에 대해 1mL / min에서 열을 세척하고 분수 수집 플레이트에서 계속 수집하십시오.
6. Elute TEV와 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, 50 mL 플라스크에서 용출을 수집하는 세 개의 열 볼륨으로 그의₆-NEMO-EEAA를 삼촌.
7. C리브 한 NEMO-EEAA의 존재를 결정하기 위해 흐름 분획의 SDS-PAGE 겔을 실행합니다.
8. 풀-스루 분획은 갈라진 NEMO-EEAA 구획을 함유하고, 교반셀 농축기를 사용하여 5 mL까지 농축한다. 멤브레인 분자량 차단 (MWCO) = 3 kDa.
9. 3 kDa MWCO 멤브레인을 사용하여, 투석 농축 시료를 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0 대 2 시간. 투석 완충액을 4 °C에서 밤새 투석 (약 15 시간)에 대한 2 L의 신선한 투석 완충액으로 변경하십시오.
10. 일 5 – 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 16 mm x 60cm 컬럼 (34 μm 평균 입자 크기)에 투석 샘플의 5 mL을 2 mM Tris에서 1 mL / min, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0. 샘플 볼륨에 따라 추가 열을 사용하여 반복합니다.
11. 디메릭 NEMO-EEAA에 해당하는 분수를 풀합니다.
    참고 : NEMO-EEAA는 60-65 mL 사이에서 용해, 더 큰 분자량 단백질에 해당, 때문에 디메릭 코일 코일의 길쭉한 특성.
12. 교반세포 농축기 및 MWCO=3 kDa 멤브레인을 사용하여 113 μM(1.65 mg/mL)의 최종 농도를 사용한다.
13. 단백질을 알리쿼트하고 4°C(1개월 이상 안정)에 보관한다.

5. 희소 매트릭스 스크리닝

참고: 이 프로토콜은 시판되는 스크린을 사용하여 결정화 시험을 수행하고 결정화 로봇을 사용하여 착석 낙하 실험을 설정합니다. 크리스탈 이미지는 이미저에 의해 자동으로 수집됩니다.

1. 시판되는 스파스 매트릭스 스크린(재료 표참조), 스파르스 매트릭스 용액의 피펫 60 μL을 착석 용액을 착석용 2개의 드롭 챔버 결정화 플레이트의 96개의 웰(reservoir solution)으로 각각 에 넣습니다.
2. 로봇 드롭 세터를 사용하여 1.65 mg/mL의 단백질 용액을 1:1 비율로 분배하고, 최종 부피에 대해 1:1의 저장소 용액을 드롭 1로 분배합니다. 그 후 66 nL의 단백질 용액을 134 nL의 저장소 용액으로 드롭 2(1:2 비율)에서 200 nL의 최종 부피에 대해.
3. 디스펜싱 직후 3인치 너비의 밀봉 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
   참고: 2-3분 이상 대기에 노출되면 방울이 마르게 됩니다.
4. 결정화 이미저 저장에 트레이를 20 °C에서 보관하고 2 일 후에 시작하여 자동으로 수집 된 이미지를 확인하십시오.
   참고: 결정화 스크리닝은 구사 최적화와 병행하여 진행되었습니다. 다음 조건(재료 표에기재된 상업용 스크린)으로 형성된 초기 결정:a) 0.1 M 트리스, pH 8.0, 30% v/v 폴리에틸렌 글리콜(PEG) MME 550, 5% 폴리γ-글루탐산, 200-400 kDa 저분자 중합체(PGA-LM); b) 0.1 M 트리스, pH 7.8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0.1 M 트리스, pH 7.8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. 희소 매트릭스 스크린 결정은 가난한 격자 균일성을 가질 것이다; 그러므로, 그(것)들은 교차 편광한 화상 진찰을 사용하여 나쁘게 보일 것입니다. 결정에 단백질이 포함되어 있는지 확인하기 위해 UV 이미징을 사용합니다. 최종 회절 품질 결정을 얻기 위해서는 다음 종자 스톡 생성 단계가 필요하다.

6. 종자 주식 생성

참고 : 우리는 재현 0.1 M 트리스 pH 8.0, 5 % PGA-LM, 3.6 % w / v PEG 20k에서 종자 생성을위한 결정을 얻을 수 있습니다. 그러나 결정은 높은 모세성을 나타내며 이 단계에서 데이터 수집에 적합하지 않습니다.

1. 종자 생성을 위한 키트를 사용하여, 제공된 바이알에 50 μL의 결정화 상태 용액을 넣고, 전체 방울을 존재하는 파이펫팅하여 종자 스톡을 준비한다.
2. 3 분 동안 종자 스톡을 소용돌이치며 20 초와 10 초 를 펄스합니다.
3. 1:10 단위로 종자 주식을 1:10,000까지 연속적으로 희석합니다. 모든 희석을 4°C에서 보관하여 추가로 사용하십시오.

7. 미세 한 화면

1. 트리스, PGA-LM 및 PEG의 조건을 다양하게 설계할 수 있습니다. 개별 트레이의 PEG 길이를 변경합니다.
   참고 : NEMO-EEAA의 구조 결정에 사용되는 결정을 제조 한 미세 스크린은 다음과 같은 조건을 채택했다 : 0.1 M Tris pH 8; PGA-LM은 1-12열에서 8~0%로 다양했습니다. 행 A-H는 다음과 같이 열 1-12에서 다양한 농도로 다른 PEG를 선별했습니다. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F : PEG 6k (0-30 % w / v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H : 못 20k (0-20 % w / v). 크리스탈은 잘 H4에 나타났다 (5.45% w / v PEG 20k, 5.8% w / v PGA-LM). 이 프로토콜에서, 단백질 결정학 스크린 빌더 액체 처리기를 사용하여 스크린을 구축하였습니다.
2. 1:1,000 종자 희석의 1:25 부피 비율로 단백질 스톡을 시드한다.
   참고: NEMO-EEAA의 농도는 약간 떨어지지만, 결정은 여전히 형성됩니다.
3. 1:10,000 종자 희석, 동일한 1:25 부피 비율을 사용하여 2단계를 반복합니다.
4. 드롭 세터를 사용하여 1.65 mg/mL에서 100 nL의 단백질 용액을 분배하고, 종자 스톡을 1:1 비율로 희석하고, 최종 부피에 대해 1:1 비율로 저수지 용액을 1:1 비율로 분배합니다. 드롭 2에 대해 반복하지만 1 :10,000의 종자 주식이 희석되어 있습니다.
5. 디스펜싱 직후 3인치 너비의 밀봉 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
   참고: 2-3분 이상 대기에 노출되면 방울이 마르게 됩니다.
6. 트레이를 20°C의 이미저 보관함에 보관하고 2일 후에 수집된 이미지를 확인하여 크리스탈이 있는지 확인합니다.
7. 격자 균일성을 위해 크로스 폴라라이저 이미저와 함께 결정을 확인하고 다음 트레이를 설정하는 단일 조건을 선택하십시오.

8. 데이터 수집을 위한 결정 생성

1. 교차 편광 이미지로 분석된 균일한 결정과 가능한 가장 큰 결정을 생성한 트리스, PGA-LM 및 PEG 조건 주위의 단일 조건 스크린을 설계합니다.
   참고 : 이러한 조건에서 결정은 모양이 불규칙, 주로 직사각형 얇은 시트입니다. 크리스탈의 가장자리가 잘 정의되고 가능한 가장 큰 두께를 가진 조건을 선택하는 것이 중요합니다.
2. 손으로 결정화 조건 20 mL을 만드십시오.
3. 다중 채널 파이프터를 사용하여, 2 개의 드롭 챔버, 착석 드롭 증기 확산을위한 96 웰 결정화 플레이트에서 웰 당 60 μL을 분배합니다.
4. 6.2단계에서 설명한 대로 종자 육수를 준비한다.
5. 6.3단계에서 설명한 대로 단백질을 분배한다.
6. 디스펜싱 직후 3인치 너비의 밀봉 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
   참고: 2-3분 이상 대기에 노출되면 방울이 마르게 됩니다.
7. 트레이를 20°C의 이미저에 보관하고 매일 이미지에 크리스탈이 있는지 확인합니다.
8. 격자 균일성에 대한 결정의 교차 편광 이미지를 확인하고 데이터 수집을 위한 결정을 선택합니다.

9. 냉동 보호제의 결정

1. 저온 보호제를 테스트하려면 결정화 조건에 해당하지만 각 구성 요소의 30%, 20%, 10%, 5% 더 높은 농도를 포함하는 스톡 솔루션을 만듭니다. 저온 보호체 부피를 첨가하면 결정화 조건과 동일한 구성 요소의 최종 농도가 생성됩니다.
   참고: 0.1 M Tris 결정화 조건에 대해 30% 농도의 농도로 저온 보호제를 테스트할 때, 냉동 보호제를 추가하기 전에 0.143 M Tris의 재고 용액으로 시작하십시오.
2. 저온 시약 키트에서 결정화 조건 스톡 솔루션의 70%에 30%의 극저온 조건을 혼합하여 냉동 보호 테스트를 위한 시료 10 μL을 생성하여 원래 결정화 조건에서 30% 냉동 보호제의 최종 농도를 만듭니다. 철저히 섞으세요.
   1. 10 μL 파이펫을 사용하여 5 μL의 저온 보호 용액을 사용하고 파이펫 팁을 액체 질소로 플런지합니다. 얼음이 관찰되면 폐기하십시오.
   2. 모든 냉동 보호제를 30%로 테스트합니다. 성공적인 솔루션을 위해 20 %에서 프로세스를 반복한 다음 10 %와 5 %의 저온 보호제를 반복하십시오.
   3. 가장 적은 비율의 저온 보호제로 성공적인 저온 보호 솔루션을 활용하여 0.5 μL의 용액을 결정이 있는 테스트 드롭에 추가합니다. 현미경으로 관찰, 결정이 조건에서 지속 얼마나 오래 타이밍, 무기한하지 않을 경우.
      참고: 이 결정은 테스트용으로만 사용할 수 있으며 폐기됩니다. NEMO-EEAA의 경우, 12% 1,2-프로판디올은 최적의 저온 보호 솔루션입니다. 12%는 약 100 nL의 결정 강하에 첨가할 때 극저온 보호용액이 경험하게 될 희석을 차지하며, 10%의 대략적인 최종 농도인 1,2-프로판네디올을 차지한다.

10. 크리스탈 루핑

1. 싱크로트론에 선적 하기 전에 루프 결정 1 - 2 일.
   참고 : 결정은 직경이 약 60-100 μm일 것입니다 : 0.05 - 0.10 mm 루프는 루핑에 이상적입니다.
2. 우물 의 상단에서 테이프를 잘라.
3. 12% 1,2-프로판디올 저온 보호제를 함유하는 결정화 용액0.5 μL을 웰에 직접 첨가합니다.
   참고: 1,2-프로판디올의 최종 농도는 현재 약 10%로, 100 nL의 낙하 용액(증기 확산으로 인한 초기 200 nL의 대략적인 투하 량 감소)으로 인해 약 10%입니다.
4. 우물에서 크리스탈을 루프.
   참고 : 결정은 종종 우물의 바닥에 성장하지만 루프에서 부드러운 이동으로 빠질 것입니다. 일단 빠지면 루프가 됩니다.
5. 액체 N_2에침지 된 퍽에 저온 루프가 함유 된 결정을 저장합니다.
6. 이 퍽은 싱크로트론에서 X선 회절을 위해 출하할 준비가 될 때까지 Dewar 플라스크의 액체 N_2에 보관하십시오.

11. 데이터 수집

1. X선 회절 데이터를 수집합니다. 이 프로토콜에서는 AMX 빔라인(ID: 17-ID-1), 내셔널 싱크로트론 광원 II를 사용합니다.
   참고: 데이터는 현장에서 수집되었지만 원격으로 수집할 수 있습니다. 편광 이미지에서 격자 균일성을 보인 결정 영역에서 데이터를 수집합니다. 결정이 고니오미터에서 회전하는 동안 데이터 수집이 결정의 "불량" 영역을 포함하지 않도록 루프에 결정을 배치합니다. 최상의 해상도를 제공하는 데이터는 약 5 x 5 μm 크기의 크리스탈 확장의 가장자리에 있는 수집에서 비롯되었습니다. 래스터링을 사용하여 크리스탈에서 가장 좋은 영역을 식별하여^20을수집합니다.

12. 엑스레이 데이터 처리

1. XDS IDXREF 프로그램을 사용하여 데이터 세트를 수집된 최고 분해능(1.8 Å)으로 처리하여 공간 그룹, 단위 셀 및 용매 함량을 결정합니다.
2. XDS 통합 프로그램을 사용하여 데이터를 통합합니다.
3. 데이터의 회절 한계 표면에 대해 I/σI 컷오프 평균 1.2를 사용하여 STARANISO 서버를 사용하여 XDS XSCALE 프로그램의 강도를 조정한 공정.
   참고: 데이터는 실제 타원으로 절단되지 않습니다. 모든 데이터는 1.2 컷오프의 I/σI 위에 유지합니다. 구형 완전성에 대해 계산된 데이터에 대한 통계는 구형이 아닌 잘림으로 인해 불량합니다. 타원형 완성도는 88%로 가장 높은 해상도로 a*, b* 및 c축을 따라 각각 1.88 Å, 2.10 Å 및 2.55 Å입니다.

13. 구조 솔루션

1. PHENIX^22에서MRage^21을 사용하여 분자 교체를 위한 검색 모델로 GCN4(PDB: 4DMD)^15의 X선 구조를 활용합니다. 4DMD 구조는 MRage에서 "앙상블"로 정의되었으며, MRage 솔루션은 NEMO-EEAA의 N-말단 코일 코일 어댑터에 대응하는 구조 부를 성공적으로 구축하여 검색 모델에 상동, 이량의 두 체인에 대해.
   참고: PHASER에서 이방성 보정을 끄거나 데이터가 다시 축소됩니다.
2. PHENIX 및 수동 건물에서 자동 빌드^23의 연속 라운드를 활용 (2F_o-Fc와 F_{o-Fc지도를} 사용하여, 쿠트^24에서)구조의 나머지 부분을 구축 할 수 있습니다.
3. Coot^24를사용하여 2F_o-Fc 및 F_o-Fc 맵을 기반으로 모델에 누락된 잔류물을 수동으로 수동으로 빌드합니다.
   참고: 마지막 단계는 각 단량체에 대해 4개의 N 단말 잔기와 4개의 C-단말 잔류물을 구축하는 것입니다. 사이드체인 배치도 필요에 따라 수동으로 조정되었습니다.
4. PHENIX와 구조의 10% 누락을 사용하여 복합 생략 맵을 계산합니다.

14. 구조 세련

1. PHENIX Refine으로 구조를 구체화합니다. 벌크 용매 및 입체 화학 가중치에 대한 초기 미세 조정을 실행하여 RMSbond 및 RMSangle 제약 조건을 각각 0.01 및 1.0으로 완화합니다. 개별 B 계수, TLS 매개 변수 및 점유에 대한 구체화를 계속합니다.

Results

NEMO의 IKK 결합 도메인의 복제, 발현 및 정제.
이 연구에서 이어진 프로토콜은 회절 품질 결정을 생성하는 NEMO-EEAA(그림1A)의최종 서열을 얻기 위해, N-및 C-종점, 돌연변이 C76A, C95S 및 돌연변이 E56A, E56A에서 코일 코일 어댑터의 추가를 포함하여 모든 중간 구조자의 발현 및 특성화를 수반하였다. 도 1B는 도1C의계획에 설명된 바와 같이 정제 절차 전반에 걸쳐 수집된 샘플의 SDS-PAGE 겔을 표시한다. 단백질은 대장균에서 과발현되고 SDS-PAGE 겔상에 있는 14 kDa MW 중량 마커에서 대략 밴드로서 나타난다(레인 3, 수확시 수집된 세포 및 8M 우레아에 의해 보충된 Laemmli ...

Discussion

UNBOUND 형태로 NEMO의 결정화 시도는 IKK 결합 도메인을 포괄하는 전신 단백질 및 여러 잘림 구수를 사용하는 시도를 포함하여 실패했다. 우리의 생체물리학적 특성은 NEMO의 IKK 결합 도메인(잔류물 44-111)에 의한 원형 이색증, NMR 분광법 및 형광 이방성으로, IKKβ를 결합할 수 있지만,결정화에 적합하지 않은 형태교환 상태로 존재한다는 것을^{나타냈다.} 우리의 접근 방식은 보다 안정적이고 접힌 네이티브 와 같은 구성을 채택한 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 구성을 엔지니어링하여 결정화를 방지하는 유연성을 제거하는 것을 포함했습니다. NEMO(44-111) 서열의 N-및 C-테르미니에 융합된 이상적인 코일 코일 도메인 어댑터는 네이티브 NEMO의 디메릭 코일 코일 폴드를 안정화시키고^{결정화(14)를}용이하게 하는 이점을 제공한다. 일련의 단백질 구성물의 거동은 앞서<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM)	분자 치수	MD2-100-150	NEMO-EEAA의 미세 스크린 결정화용
3.5 kDa MWCO 투석 멤브레인	스펙트럼/Por	132724	이미다졸 투석 제거용
Amicon Stirred Cell	Millipose Sigma	UFSC 05001	단백질 농도용
염화암모늄	Millipore Sigma	G8270	최소 배지 라벨링 용
Benzonase Nuclease	Millipore Sigma	9025-65-4	핵산
BL21-CodonPlus (DE3) -RIL Competent Cells	Agilent Technologies	모델 : 230245	TEV 발현
CryoPro	Hampton Research	HR2-073	극저온 보호제 키트
D-Glucose (Dextrose)	Millipore Sigma	A9434	최소한의 미디어 라벨링
Difco 훌륭한 육수	ThermoFisher	DF043817	배양 성장을 위한
Dithiothreitol > 99%	Goldbio	DTT25	의 환원을 위해
: Rosetta 2 (DE3)	Novagen	71400-3	라벨링되지 않은 NEMO-EEAA
FORMULATOR	Formulatrix		액체 핸들러/ 스크린 빌더
HCl & 은대쉬; 1.0 M 솔루션	Hampton Research	HR2-581	NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg	GE Healthcare	28989333	배제 정제
HisTrap HP 5 mL 컬럼	GE Healthcare	17524802	His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS	분자 치수	MD1-59	NEMO-EEAA의 희소 매트릭스 스크리닝용
HT 96 Morpheous	Molecular Dimensions	MD1-46	NEMO-EEAA
Imidazole	ThermoFisher	288-32-4	His-trap 컬럼
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside	Goldbio	I2481C5
	Hampton Research	HR3-083	결정화 플레이트
NT8 - 드롭 세터	Formulatrix		결정화
pET-16b	Millipore Sigma	69662	NEMO-EEAA
pET-45b	Millipore Sigma	71327	복제용 NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride	ThermoFisher	36978	프로테아제 억제용
초원심분리기 로터 Type 45에 사용하기 위한 폴리카보네이트 병 Ti	Beckmann Coulter	339160	초원심분리기 병
폴리에틸렌 글리콜 20,000	Hampton Research	HR2-609	NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)	Addgene	Plasmid 8827	TEV 생산용
QuikChange XL II	Agilent Technologies	200522	현장 지시 돌연변이 유발
필요 캡 어셈블리:	Beckmann Coulter	355623	Ultracenttrifuge 병뚜껑
ROCK IMAGER	Formulatrix		Crystallization Imager
Seed Bead Kit	Hampton Research	HR2-320	Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99%	Millipore Sigma	S9888	정제 용액
TCEP(Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)	Goldbio	TCEP1	환원제
The Berkeley Screen	Rigaku	MD15-Berekely	NEMO-EEAA의 희소 매트릭스 스크리닝
용 PGA 스크린	분자 치수	MD1-50	NEMO-EEAA Tris의 미세 스크린 결정화
; 1.0 M 솔루션	Hampton Research	HR2-589	NEMO-EEAA
초순수 트리스 버퍼의 미세 스크린 결정화용 (분말 형식)	Thermofisher	15504020	정제 용액의 완충용
Urea	ThermoFisher	29700	NEMO-EEAA의 변성용