Method Article

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

DOI:

10.3791/60346

⸱

October 24th, 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 프로토콜은 전립선 상피 오르가노이드에서 약력학, 줄기 세포 전위 및 암 분화를 연구하는 프로토콜이다. 전립선 오르가노이드는 안드로겐 반응형 3차원(3D) 배양체로 전립선 피상과 유사한 정의된 배지에서 성장합니다. 전립선 오르가노이드는 야생 형 및 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선 암에서 확립 될 수 있습니다. 중요한 것은, 환자 유래 오르가노이드는 유전학과 생체 내 종양 생물학에 있는 종양을 밀접하게 닮습니다. 또한, 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA 시스템을 사용하여 유전자 조작이 가능합니다. 이 통제된 유전학은 약리학적인 반응에 유전형 그리고 돌연변이 단면도의 효력을 급속하게 시험하기 위한 단장으로 오르가노이드 문화를 매력적으로 만듭니다. 그러나, 실험 프로토콜은 재현 가능한 결과를 얻기 위하여 오르가노이드 문화의 3D 본질에 구체적으로 적응되어야 합니다. 여기서 설명된 것은 오르가노이드 형성 능력을 결정하기 위한 시딩 분석을 수행하기 위한 상세한 프로토콜이다. 그 후, 이 보고는 생존력 측정, 단백질 격리 및 RNA 격리를 통해 약물 치료를 수행하고 약리학적 반응을 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 프로토콜은 피하 이식을 사용하여 이종이식 및 후속 생체 내 성장 분석에 대한 오르가노이드를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 데이터를 생성하며 3D 문화 시스템에 널리 적용됩니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

약물 내성은 암 치료의 주요 임상 문제 중 하나입니다. 전이성 전립선암 (PCa) 치료는 주로 안드로겐 신호 전달 축을 지향한다. 차세대 항안드로겐 치료법(예: 엔잘루타미드 및 아비라테론)은 임상적으로 큰 성공을 보였지만, 사실상 모든 PCa는 결국 안드로겐 독립 국가 또는 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다.

CRPC의 최근 게놈 및 전사체 프로파일링은 전립선암에 내성의 세 가지 일반적인 메커니즘이 밝혀: 1) 안드로겐 수용체 (AR) 신호의 복원의 결과로 돌연변이를 활성화1; 2) 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 활성화가 AR 신호전달의 손실을 보상할 수 있는 차세대 항안드로겐 치료 저항에 대한 전임상 모델에서 예시된 바와 같이 바이패스 신호전달의활성화2; 및 3) 종양 세포가 약물 표적에 의존하는 세포 유형에서 이에 의존하지 않는 다른 세포 유형으로 혈통을 전환하여 내성을 획득하는 계보 가소성의 최근 확인된 과정 (PCa에서 AR 음성으로 표현됩니다). 및/또는 신경 내분비 질환 [NEPC])3,4. 그러나 약물 내성을 유발하는 분자 메....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 기술된 모든 작업은 이전에 확립된 뮤린 오르가노이드 및 환자 유래 오르가노이드로 수행되었습니다. 모든 동물 작업은 기념 슬로안 케터링 암 센터의 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 수행되었다 (IACUC: 06-07-012). 모든 환자 유래 조직은 기념 슬로안 케터링 암 센터 (IRB: 12001)의 규칙 및 규정을 준수하여 수집되었습니다.

1. 중간 및 버퍼 준비

  1. 실험을 시작하기 전에 밤새 4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)를 해동한다. 사용 중에 얼음에 보관하십시오.
  2. 실험 전에 배양 판을 37°C에서 24시간 동안 놓습니다. 이것은 중합하기 위해 지하 멤브레인 매트릭스 돔 (이하 매트릭스 돔이라고함)을 도울 것입니다. 도금 오르가노이드는 단계 2.1.2에 기재되어 있다.
  3. 확립된 프로토콜5에따라 오르가노이드 배지를 준비한다.
  4. 표피 성장 인자를 첨가하지 않고 오르가노이드 배지를 준비합니다(EGF; 성분에 대한 재료 표 참조). EGF는 AR 전사 출력을 억제하고 항 안드로겐저항성 5를부여한다.
  5. 10% 태....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시딩 효율
유기체 형성 능력은 표현형 및 유전자형에 의해 결정됩니다. 야생형(WT) 전립선 기저세포는 우수한 오르가노이드 형성 능력(30%-40%)을 보였다. 발광 세포 (3%)에 비해 (그림1A). 오르가노이드 설립 후, 형성 능력이 급격히 증가했습니다. 전형적으로, WT 오르가노이드로부터 유래된 세포의 25%-30%는 새로운 오르가노이드를 형성할 수있다(도 1B). CRISPR/Cas9 매개 Pten (PtenΔ/Δ)또는 p53 (p53Δ/Δ)의손실은 오르가노이드 형성 능력의 경미한 증가를 초래했다. p53 및 Pten의 손실은 더 증가된 형성 용량을 증가시킵니다(도1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

항 안드로겐 저항의 근본적인 분자 기계장치를 이해하고 잠재적인 치료 취약성을 발견하려면 전립선암을 모방한 모델 시스템에서 약리학적 반응을 테스트해야 합니다. 여기서 설명된 상세한 프로토콜은 환자 유래 및 유전자 조작 전립선 오르가노이드및 다운스트림 애플리케이션을 위한 이러한 오르가노이드 샘플의 제조에서 약리학적 반응의 신뢰할 수 있는 분석을 위한 상세한 프로토콜이다.

이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 오르가노이드의 종자 효율 및 성장 속도를 결정하는 것입니다. 오르가노이드 성장 속도는 크게 다릅니다. 이것은 인간 유래 오르가노이드보다는 약 2 배 빨리 성장하기 때문에, 종에 의존합니다. 종을 제외하고 성장 속도는 유전자형과 표현형에 달려 있습니다. 그러나, 시딩 효율 및 성장 속도가 결정되면, 이 프로토콜은 모든 전립선 오르가노이드 유형에 적응될 수 있다.

두 번째 중요한 단계는 후속 다운스트림 애플리케.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.L.S는 노바티스 의 이사회에서 활동하고 있습니다. ORIC 제약의 공동 창립자이며 엔잘루타미드와 아팔루타미드의 공동 발명가입니다. Agios, 베이진, 블루프린트, 컬럼 그룹, 포그혼, 하우스 제약, 넥스트에치, KSQ, 페트라 및 PMV에 대한 과학 고문입니다. 2014년 제넨텍/로슈가 인수한 세라곤의 공동 창업자입니다. W.R.K.는 오르가노이드 기술의 공동 발명가이자 특허 보유자입니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.P.는 NIH 1F32CA236126-01에 의해 지원됩니다. C.L.S.는 HHMI에 의해 지원됩니다. CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; 스타 암 컨소시엄. W.R.K.는 네덜란드 암 재단 / KWF Buit 2015-7545 및 전립선 암 재단 PCF 17YOUN10에 의해 지원됩니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939오가노이드 배지 성분: 최종 농도 200nM
ADMEM/F12Gibco/Life technologies12634028오가노이드 배지 성분
B27Gibco/Life technologies17504-044오가노이드 배지 성분
세포 배양 플레이트Fisher657185
Cell Titer GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073오가노이드 배지 성분: 최종 농도 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09오가노이드 배지 성분: 최종 농도 마우스의 경우 50ng/ml, 인간의 경우 5ng/nl
FGF10Peprotech100-26인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18B인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 5ng/ml
GlutamaxGibco/Life technologies35050079오가노이드 배지 성분
HEPESmade in-housen/a오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10mM
Matrigel (Growth factor reduced & Phenol Red free)CorningCB-40230C오가노이드 배지 성분
N-아세틸시스테인시그마-알드리치A9165오가노이드 배지 성분: 최종 농도 1.25mM
니코틴아미드시그마-알드리치N0636인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10mM
NOGGINPeprotech 또는 Noggin 구조체로 안정적인 형질 주입된 293t 세포(Karthaus et al. 2014)120-10C오가노이드 배지 성분 : 최종 농도 10 % 조절 배지 또는 100 ng / ml
페니실린 / 스트렙타비딘제미니 바이오 제품400-109오가노이드 배지
성분 포스 파타제 억제제Merck Millipore524629
프로스타글란딘 E2Tocris3632464
프로테아제 억제제Merck Millipore539131
R-SPONDINPeprotech 또는 R-Spondin1 구조체를 사용한 안정적인 형질 주입 293t 세포(Karthaus et al. 2014)120-38오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10% 조건 배지 또는 500ng/ml
RIPA 완충액Merck20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049오가노이드 매체 성분: 최종 농도 10 μ 미디엄

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prostate OrganoidOrganoid CulturePharmacological ResponseGenotype AnalysisDrug TreatmentViability AssayProtein IsolationRNA IsolationXenografting AssayCRISPR Cas9

Related Articles