인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.
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이 논문에서
요약
초록
성인 줄기 세포 연구에 있는 어드밴스에도 불구하고, 조직 견본에서 줄기 세포의 확인 그리고 격리는 중요한 도전남아 있습니다. 상주 줄기 세포는 성인 조직에 틈새 구속으로 상대적으로 정지하는 동안, 그들은 앵커없는 3 차원 (3D) 배양에서 세포 주기를 입력하고 대칭 및 비대칭 세포 분열을 모두 겪으며 줄기와 전구 모두를 초래합니다. 셀. 후자는 급속하게 증식하고 이질적인 스페로이드를 형성하는 계보 헌신의 각종 단계에서 중요한 세포 인구입니다. 일차 정상 인간 전립선 상피 세포(HPrEC)를 사용하여, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석법으로 단일 세포 분해능에서 스페로이드 를 발동하는 줄기 세포의 식별 및 기능적 분리를 허용하는 것으로 개발되었다.
HPrEC 또는 세포주들은 2차원(2D) BrdU와 함께 10일 동안 배양되어 자가 갱신 줄기 세포를 포함한 모든 분할 세포의 DNA에 혼입하는 것을 허용한다. 5 일 동안 3D 배양으로 옮겨지면 씻어 내고, 그 동안 줄기 세포는 비대칭 분열을 통해 스스로 갱신하고 스페로이드 형성을 시작합니다. 상대적으로 정지딸 줄기세포가 BrdU 표지된 부모 DNA를 유지하는 동안, 딸 선조는 BrdU 라벨을 잃고 급속하게 증식합니다. BrdU는 FACS에 의한 살아있는 줄기 세포 격리를 허용하는 CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 대체될 수 있습니다. 줄기 세포 특성은 생체 외 스페로이드 형성, 생체 내 조직 재생 분석 및 대칭 / 비대칭 세포 분열을 문서화하여 확인됩니다. 단리된 라벨-유지 줄기 세포는 RNA-seq, ChIP-seq, 단세포 포획, 대사 활성, 프로테오메 프로파일링, 면역 세포 화학, 오르가노이드 형성 및 생체 내 조직 재생을 포함한 다운스트림 분자 및 생물학적 연구에 의해 엄격하게 심문될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 마커 자유로운 기능적인 줄기 세포 격리 접근은 다중 기관에서 신선한 암 견본 및 암 세포줄에서 줄기 같이 세포를, 넓은 적용성을 건의합니다. 암 줄기 와 같은 세포 바이오마커를 식별하고, 암 줄기와 같은 세포를 표적으로 하는 의약품을 선별하고, 암에서 새로운 치료 표적을 발견하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
인간 전립선은 분비 기능과 특이한 신경 내분비 세포 성분과 함께 기본 기저 세포를 가진 발광 상피를 포함합니다. 상피 세포는, 이 경우에, 생체 내에서 상대적으로 정지하고 일생 내내 선 항상성을 유지하기 위하여 복구 시스템으로 작용하는 전립선 줄기 세포의 희소한 인구에서 생성됩니다1. 많은 발전에도 불구하고, 전립선 줄기 세포의 식별 및 기능적 격리는 분야에서 중요한 과제로 남아 있습니다. 세포 표면 마커 기반 방법론을 포함하는 줄기 세포 바이오마커는 유세포 분석과 결합되어 줄기세포 연구2,3,4에일반적으로 사용된다. 그러나, 농축 및 격리에 대한 결과는 마커 조합 및 항체 특이성의 함수로서 광범위하게변화하며,6,단리된 세포의 정체성에 대한 의문을 제기한다. 줄기형 세포 농축을 위한 또 다른 널리 사용되는 접근법은 3차원(3D) 스페로이드배양2,3,
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프로토콜
모든 세포 처리 및 매질 제제는 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 무균 기술로 수행되어야한다.
1. 2D에서 HPrEC 세포의 배양 및 유지 보수
- 2.5 μg/cm2 fibronectin 용액2 mL로 100mm 배양 접시를 실온 (RT)에서 밤새 코팅하십시오. 용액을 흡인하고 배양접시를 BSC에서 45분 동안 건조시키게 하였다.
- 전립선 상피 세포 성장 배지(예를 들어, PrEGM)의 9 mL를 섬유넥틴 코팅 된 100mm 배양 접시에 넣고 37 °C에서CO2 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게 유지하십시오.
- 37°C 수조에서 냉동 HPrEC 세포(2 x 10 5/mL)의 한 바이알을 해동하고 따뜻한 배지의 10 mL에서 세포를 다시 중단시냅니다.
- RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상급을 폐기하십시오.
- 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포를 철저히 재중단시다. 종자 세포는 프리웜 배지의 9 mL을 함유하는 섬유넥틴 코팅 100 mm 배양 접시에 직접 세포 현탁액의 1 mL을 파이펫팅하여 (배지 및 세포의 총 부피는 10 mL이다).....
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결과
일차 정상 인간 전립선 상피 세포는 섬유넥틴 코팅 배양 접시에 배치되고 세포 성장은 2D 배양물에서 유지된다(도1a). 지하 막 매트릭스를 가진 3D 문화로 옮겨질 때, 분화한 상피 세포는 천천히 죽습니다. 전립선 줄기 세포만이 5일 이내에 앵커 프리 배양 및 포름 스페로이드에서 생존할 수있다(도 1b).
2D 배양에서 전립선 상피 세포의 이중 표지는 3D 배양에서 구형 형성에 이어 동일한 라벨 유지 세포에서 BrdU, CFSE 및 파 레드의 공동 국소화를나타낸다(도 2a-i).
라벨 유지 세포는 5일째 스페로이드에서 줄기 세포 특성을 보여줍니다. 이중 면역 염색은 라벨 유지 세포가.......
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토론
다중 줄기세포 표면 마커를 이용한 유세포측정법은 특이성과 선택성 모두 결여에도 불구하고 줄기세포 연구를 위해 일반적으로 사용되는접근법1,5,6. 3D 배양 시스템에서 스페로이드 형성은 HPrEC를 포함하는 1 차 상피 세포로부터 희귀 줄기 세포 집단을 풍부하게 하는 또 다른 유용한 방법이지만, 생성된 스페로이드는 여전히 줄기 세포와 전구 세포의 이질적인혼합물인 2,3,4이다. prostaspheres에서, 급속하게 증식하는 전구 세포에 비해, 줄기 세포의 상대적으로 정지문자는 그(것)들을 장기 적인 레이블 보유 분석결과로 확인될 수 있게 합니다.
이.......
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공개 사항
저자는 공개 할 재정적 인 관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 암 연구소 R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 시카고 일리노이 대학의 유동 세포 측정 코어에 세포 선별에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1mL 투베르쿨린 주사기 | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균 | |||
| 100mm 배양 접시 | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12웰 배양 플레이트 | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15mL 원심분리기 튜브 | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22mm 커버 슬립, sq | Corning | 284522 | MatTek 35mm 배양 접시 |
| 24 x 50mm 커버 슬립 | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5인치 피하 주사 바늘 | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35mm 배양 접시(커버 유리 바닥 | 포함) MatTek Corp | P35G-0-10-C | 유리 바닥 번호 0, 코팅되지 않은,  조사 |
| 40 &마이크로; m 기공 나일론 세포 여과기 | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 배양 인큐베이터, 37 ° C | Forma | ||
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브(스트레이너 스냅 캡 포함 | Corning | 352235 | 35 µ m 나일론 메쉬 |
| 6웰 배양 플레이트 | Corning | 353046 | |
| 8웰 챔버 슬라이드 | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Vector Laboratories | H-1200 | A 핵 형광 염료 | 포함하는 수성 장착 매체 |
| 안전 캐비닛, 레벨 2 인증 | |||
| BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM 담액 DMSO |
| 원심분리기 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브용 | Eppendorf | ||
| Centrifuge 15 mL 튜브용 원심분리기 | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE(카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM DMSO |
| cytochalasin D | 담액 Thermo Fisher Scientific | ||
| PHZ1063 Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | 100mm 배양 접시 코팅용 |
| 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경 | Carl Zeiss | Axioskop 20 형광 현미경; 컬러 디지털 Axiocamera | |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (1차 정상 인간 전립선 상피 세포) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | 3명의 젊은(19-21세 OD) 질병이 없는 장기 기증자로부터 모았습니다. 1 x 105 세포/mL; 액체 질소 |
| 얼음 양동이와 얼음 | |||
| 에 보관 디지털 카메라가 | |||
| 솝 Matrigel, 낮은 성장 인자, 페놀-레드 프리 | 코닝 | 356239 | |
| 메탄올 | 코닝 | A452-4 | |
| 마우스 안티-BrdU 항체 | 세포 신호 | 5292S | |
| 마우스 IgG 항체( negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| 프로피듐 요오드화물 (PI) | R & D 시스템 | 5135/10 | 10 μ 4°C에 저장된 PBS의 g/mL PI; 어둠 속의 C |
| 혈청학적 피펫, 다양한 크기 | |||
| 구 계산 및 크기 측정을 | |||
| 소프트웨어: 자유형 드로잉 기능을 | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| 수조, 37 ° | |||
| 을 사용한 C z-stack 이미지 |
참고문헌
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells
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