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이 연구는 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 기관 검토 위원회 (IRB)에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었다. IRB #090401 승인은 UCSD 기관 검토 위원회 (IRB)에서 연구 목적을 위해 환자에게서 외과 견본을 집합하기 위하여 수신되었습니다. 각 환자로부터 동의를 얻어 외과용 뼈 전립선암 전이 시편은 대퇴골의 병리학적 골절의 정형외과적 수리로부터 얻어졌다. 동물 프로토콜은 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 동물 복지 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 된 프로토콜 #S10298 하에 수행되었습니다. 기계적 및 효소적 해리된 환자 종양 조직으로부터의 세포는 앞서설명한바와 같이 6 내지 8주 령 의 남성Rag2-/-및 γ c-/- 마우스로 내-대퇴로 주입되었다. 이종이식 종양 부피는 생체 내 생물 발광 이미징 시스템 및 캘리퍼스 측정을 사용하여 결정되었다. 종양 성장 시 최대 2.0 cm (IACUC에 의해 승인 된 최대 허용 크기), 종양은 3D 오르가노이드 확립을 위해 수확되었다.
참고: 그림 1은 실험 절차의 각 단계에 대한 3D 오가노이드 및 프로토콜 번호를 설정하기 위한 워크플로우를 보여 주며, 이에 대한 워크플로우를 보여 주다.
1. 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 조직의 처리
참고: 이것은 이종이식 마우스 모델에서 파생된 종양에 대한 오르가노이드 확립을 위한 초기 단계이다. 이 프로토콜은 Drost et al.5에 의해 이전 간행물에서 적응하 고 우리는 organoid 매체에 혈 청 보충을 포함 하도록 미디어 조건을 수정 했습니다.
- 아래에 기재된 바와 같이 종양 시편을 처리한다.
- 종양 샘플을 1-3 mm3 크기의 조각으로 다진 후 실온에서 45 분 동안 10 mL의 세포 해리 액으로 샘플을 소화합니다.
- 소화를 종료하려면 샘플에 20 mL의 DMEM 완전 미디어를 추가합니다.
- 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸. 멸균 플런저 플랜지를 사용하여 남은 조직을 70 μm 세포 스트레이너 의 상단에 밀어 넣습니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기.
- 신선한 adDMEM 완전 매체로 세포 펠릿을 세 번 세척하십시오. 세척 및 재서스펜션용 용지의 볼륨을 표 3에제시된 용지 의 양과 일치시다. 예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건의 경우, 세척용 부피는 500 μL이어야 한다.
참고: 표 3에나타낸 바와 같이 프로토콜은 다른 문화 조건에 적용할 수 있다.
- Trypan 파란색 염료와 혈세포계를 사용하여 최종 셀 수를 결정합니다.
- 세포 수를 얻은 후, 2 x 106 종양 세포 당 PBS에서 2% FBS의 80 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다.
- 2 x 106 종양 세포 당 마우스 세포 고갈 칵테일 20 μL을 추가하십시오. 잘 섞고 2-8 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 2 x 106 종양 세포 당 PBS 완충액에서 2 % FBS로 500 μL로 볼륨을 조정하십시오.
참고: 2.5 mL의 세포 현탁액에서 최대 1 x 107 종양 세포를 하나의 LS 컬럼에서 처리할 수 있습니다.
- LS 컬럼을 마그네틱 컬럼 분리기위에 로드하고 15mL 원엽 튜브를 랙 아래에 배치하여 흐름을 수집합니다.
- PBS 버퍼에서 3 mL의 2% FBS로 각 컬럼을 헹구고 있습니다. 세척 흐름으로 원엽 튜브를 버리고 새로운 멸균 된 15mL 원엽 튜브로 교체하십시오.
- 세포 현탁액 (1 x 107 종양 세포의 최대 2.5 mL)을 컬럼에 추가합니다. 인간 종양 세포로 농축될 흐름을 수집한다.
- PBS 버퍼에서 2% FBS의 1 mL로 컬럼을 두 번 세척합니다.
참고: 열이 비어 있는 즉시 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 또한 기포가 형성되지 않도록하십시오.
- 원하는 배양 설정에 대한 1.5 mL 튜브에 적절한 양의 세포 현탁액을 Aliquot(표3).
- 1.5 mL 튜브를 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
- 조심스럽게 제거하고 상급을 폐기.
2. 환자 원발성 종양 조직의 처리
참고 : 이것은 오르가노이드 설립을위한 초기 단계입니다.
- 환자 1 차적인 종양 조직의 처리를 위해 필요하지 않은 마우스 세포 고갈 과정을 제외하고 1단계의 전부를 따르십시오.
3. 플레이트에 부착 된 둥근 돔 형성
참고: 이 원고는 그림 1 및 그림 2에 나타낸 바와 같이 세포 펠릿과 지하 막(예를 들어, 마트리겔)의 혼합물로부터 돔을 만드는 세 가지 방법을 설명합니다. 단계 2-4에서, 세포와 지하 막은 지하 막의 응고를 방지하기 위해 얼음에 보관되어야한다.
- 24웰 플레이트셋에 대해 적절한 부피의 지하막(예를 들어, 40 μL)으로 세포 펠릿을 재중단한다(표3).
- 피펫을 위아래로 부드럽게 하여 세포가 지하 막에 잘 다시 매달려 있는지 확인합니다.
- 세포-지하 막 혼합물의 적절한 부피(표3)를피펫(및 adDMEM 완전 배지의 선택적 10 μL)을 예열된 조직 배양 판의 중심으로 한다.
- 플레이트를 반전시키고 즉시 플레이트를CO2 세포 배양 인큐베이터에 거꾸로 놓고 5%CO2,37°C에서 15분 동안 설정하였다. 이것은 지하실 막이 고형화하는 것을 허용하면서 세포가 침전되고 플레이트 바닥에 고수하는 것을 방지합니다.
- 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 온난화배지의 적정 부피(표3)를각 웰내로 피펫한다.
- 플레이트를CO2 세포 배양 인큐베이터 내부에 오른쪽으로 놓습니다(5%CO2,37°C).
- 3-4일마다 미디어를 변경합니다. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.
4. 플레이트에 부착 된 둥근 돔에서 부동 돔 형성
- 3.7단계 후, 셀 스크레이퍼를 사용하여 돔을 분리한다.
5. 부동 구슬 형성
참고 : 이 프로토콜은 지하 막, 미디어 및 오르가노이드의 혼합물이 구슬처럼 보이기 때문에 부동 구슬로 명명됩니다.
- 파라핀 필름 의 2 인치 x 4 인치 조각을 잘라.
- 1000 μL 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 빈 팁 홀딩 랙의 디봇 상단에 파라핀 필름을 놓습니다.
- 부드럽게 장갑 검지 손가락을 사용하여 디봇을 추적하기 위해 파라핀 필름을 아래로 누릅니다하지만 파라핀 필름을 뚫지 않고.
- 파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드에 UV 램프를 켜서 제조된 파라핀 필름을 30분 이상 살균하였다.
- 세포와 20 μL의 지하 막을 혼합하여 준비합니다. 파종 밀도는 돔당 50,000 - 250,000 셀일 수 있습니다.
- 피펫은 제조된 파라핀 막에서 형성된 디봇의 몰드 내로 1단계 또는 2단계, 및 20 μL의 지하막으로부터 처리된 세포의 혼합물이다.
- 지하 막에 세포 펠렛을 다시 중단하고 제조된 파라핀 촬영 디봇에서 세포 현탁액을 피펫한다.
- 고형 비즈와 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣습니다. 6 웰 플레이트에 하나의 우물은 5 구슬까지 들어갈 수 있습니다.
- 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 가열된 배지의 피펫 3-5 mL을 각 우물에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦아냅니다.
참고: 최소 볼륨으로 3mL를 권장합니다. 웰당 최대 비드 수(N=5)의 경우 중간 크기 5mL를 권장합니다.
- 플레이트를CO2 인큐베이터(5%CO2,37°C) 내부에 놓습니다.
- 3-4 일마다 오르가노이드 매체를 변경하십시오. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.
6. 현미경을 사용하여 생체 내 오르가노이드 이미지 스티치8
참고 : 특정 현미경은 세포 판 (가장자리 벽)의 외부 둘레에 도달 할 수 없습니다; 따라서 이미지 스티칭 할 때 셀 플레이트의 둘레에 가까운 웰을 사용하는 것이 좋습니다.
- 키ence 현미경의 플레이트 홀더에 세포 배양 판을 위쪽으로 놓습니다.
- 렌즈를 대상 돔의 중앙에 놓습니다.
- 프레임 수를 선택하여 자동 스티칭 프로세스를 설정합니다. 예를 들어 3 x 3 또는 5 x 5를 선택하여 총 9개의 이미지 또는 25개의 이미지를 생성할 수 있습니다.
- 캡처 버튼을 눌러 이미징 프로세스를 시작합니다.
- 이미지 뷰어 소프트웨어를 열고 4단계로 촬영한 이미지 그룹을 로드합니다.
- 이미지 스티칭을 클릭하여 고해상도 스티치 이미지를 만듭니다.
참고: 직렬 9 또는 25개의 이미지 캡처는 셀에 초점을 맞추도록 수동 또는 자동 설정으로 수행할 수 있습니다.
7. 조직학을위한 오르가노이드 처리 : 아가로스 스핀 다운 방법
참고 :이 프로토콜은 블라코기아니스 외7에의해 이전 출판물에서 적응된다 . 우리는 성공적으로 오르가노이드의 모든 인구를 포함하기 위해 아가로즈 포함과 관련된 단계를 추가했습니다.
- 웰에서 기존 미디어를 제거합니다. 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하십시오.
- 동일한(1단계에서 제거된 용지의 부피와 동일)을 추가하고 4°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 분쇄합니다. 1.5 mL 튜브에서 해리 된 돔 및 세포 회수 용액을 수집합니다.
- 300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급 (세포 복구 용액)을 제거하십시오. 최종 펠릿 단계에서 오르가노이드의 존재가 확인될 때까지 모든 상수체를 별도의 튜브에 저장합니다.
- 차가운 PBS의 원하는 부피(표3)를추가하고 기계적으로 펠릿을 방해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫합니다.
- 300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급체(PBS)를 제거합니다.
- 펠렛을 상온에서 60분 동안 4% PFA의 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3으로부터1개의 펠렛에 대해 일치하는 부피(예를 들어, 500 μL)로 고정한다.
- 고정 후, 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를.
- 상급체(PFA)를 제거합니다.
- 일치하는 부피(예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3)에서1개의 펠릿에 대해 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척한다.
- 따뜻한 아가로즈 (PBS에서 2 % 아가로즈)를 준비하십시오.
참고: 여기서, 동결된 단면도에 대한 세포 펠릿은 프로토콜 7에서 추가단계 없이 OCT 화합물의 200 μL에서 직접 재부유될 수 있다.
- 아가로스의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (PBS에서 2 %).
- 아가로스를 첨가한 직후, 1mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1.5 mL 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 부드럽게 분리합니다. 도 3에도시된 바와 같이, 세포 펠릿이 1.5 mL 튜브의 벽으로부터 물리적으로 분리되지 않은 경우, 아가로스 임베딩 공정 동안 세포 펠릿의 전부 또는 일부를 잃을 위험이 있다.
- PBS에서 2 % 아가로즈가 완전히 응고 될 때까지 기다립니다.
- 1.5 mL 튜브로부터 고형화된 아가로즈 블록을 1 mL 주사기에 부착된 25 G 바늘을 사용하여 분리한다.
- 세포 펠릿을 함유하는 분리된 아가로즈 블록을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달한다.
- 튜브를 70% EtOH로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 삽입을 위한 종래의 프로토콜을 사용하여 추가로 진행한다.
8. 오르가노이드의 조직학 및 면역형광 세포화학(IFC)
- 역학 또는 IFC에 대한 슬라이드를 선택합니다.
- 염색 과정을 시작하기 전에 슬라이드에 있는 셀의 위치를 알아내고 마커를 사용하여 슬라이드의 셀 주위에 원을 그립니다.
- 슬라이드의 가장자리 또는 보더 주위와 실험실 노트북의 슬라이드에 원이 있는 위치를 그려 위치를 기록합니다.
- 원하는 염색을 수행합니다.
참고 : 이 과정에서 일반 제조업체가 화학 물질에 내성이 없기 때문에 표시된 원이 사라집니다. 심지어 일부 반학 영구 마커는 염색 과정에서 지워질 수 있습니다.
- 염색 과정을 마친 후 실험실 노트북의 도면 위에 슬라이드를 놓아 슬라이드의 셀 위치를 찾습니다.