환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

3차원 배양 오르가노이드는 생체 내 아키텍처, 세포 기능 및 그들의 원래 조직의 유전적 서명을 되풀이할 수 있는 잠재력에 대해 관심을 끌고 있다^1,2,3,4,5. 가장 중요한 것은, 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델에서 설립 된 3D organoids는 종양 발생시 세포 신호의 메커니즘을 이해하고 각 세포^{집단6, 7,8,9,10,11,12,13에}대한 약물 치료의 효과를 결정하는 귀중한 기회를 제공한다. Drost 등 5 는 비뇨기과 분야에서 널리 채택된 인간 및 마우스 전립선 오르가노이드의 확립을위한 표준 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 3D 오르가노이드의 추가 특성화및 종양발생 및 전이의 상세한 기전을 이해하기 위해상당한 노력이 전념되어 왔다^4,12,14,15. 3D 오르가노이드 배양에 대한 이전에 확립되고 널리 인정된 프로토콜 외에도 최적화된 배양 조건에서 세 가지 다른 도밍 방법을 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

이 원고에서, 3D 오르가노이드는 뼈 전이성 전립선암 (BMPC)의 ex vivo 모형으로 설치되었습니다. 이러한 배양에 사용되는 세포는 전립선암 샌디에이고(PCSD) 계열로부터 유래되었으며 환자 전립선암 뼈 전이성 종양 조직(PCSD18 및 PCSD22) 또는 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 모델(PCSD1, PCSD13 및 PCSD17)으로부터 직접 유래하였다. 전립선암 세포의 자발적인 골 전이는 유전자 조작 마우스^{모델(16)에서}드물기 때문에, 우리는 인간 종양 세포를 남성^{Rag2-/-γc-/-} 마우스로 직접 대퇴내 주사하여 뼈 전이성 전립선암의 PDX 모델을^{확립하였다 17.}

일단 3D 오르가노이드가 이질적인 환자 종양 세포 또는 환자 유래 이종이식에서 확립되면, 전립선 종양 세포로서의 그들의 정체성을 확인하고 3D 오르가노이드 배양에서 그들의 표현형을 결정하는 것이 필수적이다. 면역형광 화학(IFC)은 각 세포에서 의 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하며, 종종 특정 세포 집단에 대한 잠재적인 기능을 나타내는^2,4. 일반적으로 조직 및 세포를 포함한 대부분의 시료에 대한 IFC 프로토콜은 간단하고 완전히 최적화되어 있습니다. 그러나, 세포 밀도 및 오르가노이드의 수는 종래의 배양보다 현저히 낮을 수 있다. 따라서, 오르가노이드에 대한 IFC 프로토콜은 샘플의 모든 오르가노이드에 대해 파라핀에 적절한 처리 및 포함을 보장하기 위한 추가 단계가 필요합니다. 우리는 특히 오르가노이드의 샘플이 원하는 것보다 낮은 세포 밀도가있을 때 오르가노이드에 IFC의 성공률을 증가 슬라이드에 단면 오르가노이드의 위치를 표시하는 아가로스 사전 포함 과정에 대한 추가 단계를 설명하고.

이 연구는 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 기관 검토 위원회 (IRB)에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었다. IRB #090401 승인은 UCSD 기관 검토 위원회 (IRB)에서 연구 목적을 위해 환자에게서 외과 견본을 집합하기 위하여 수신되었습니다. 각 환자로부터 동의를 얻어 외과용 뼈 전립선암 전이 시편은 대퇴골의 병리학적 골절의 정형외과적 수리로부터 얻어졌다. 동물 프로토콜은 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 동물 복지 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 된 프로토콜 #S10298 하에 수행되었습니다. 기계적 및 효소적 해리된 환자 종양 조직으로부터의 세포는 앞서^설명한바와 같이 6 내지 8주 령 의 남성^Rag2-/-및 γ ^c-/- 마우스로 내-대퇴로 주입되었다. 이종이식 종양 부피는 생체 내 생물 발광 이미징 시스템 및 캘리퍼스 측정을 사용하여 결정되었다. 종양 성장 시 최대 2.0 cm (IACUC에 의해 승인 된 최대 허용 크기), 종양은 3D 오르가노이드 확립을 위해 수확되었다.

참고: 그림 1은 실험 절차의 각 단계에 대한 3D 오가노이드 및 프로토콜 번호를 설정하기 위한 워크플로우를 보여 주며, 이에 대한 워크플로우를 보여 주다.

1. 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 조직의 처리

참고: 이것은 이종이식 마우스 모델에서 파생된 종양에 대한 오르가노이드 확립을 위한 초기 단계이다. 이 프로토콜은 Drost et al.^5에 의해 이전 간행물에서 적응하 고 우리는 organoid 매체에 혈 청 보충을 포함 하도록 미디어 조건을 수정 했습니다.

1. 아래에 기재된 바와 같이 종양 시편을 처리한다.
   1. 종양 샘플을 1-3 mm³ 크기의 조각으로 다진 후 실온에서 45 분 동안 10 mL의 세포 해리 액으로 샘플을 소화합니다.
   2. 소화를 종료하려면 샘플에 20 mL의 DMEM 완전 미디어를 추가합니다.
   3. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸. 멸균 플런저 플랜지를 사용하여 남은 조직을 70 μm 세포 스트레이너 의 상단에 밀어 넣습니다.
   4. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기.
   5. 신선한 adDMEM 완전 매체로 세포 펠릿을 세 번 세척하십시오. 세척 및 재서스펜션용 용지의 볼륨을 표 3에제시된 용지 의 양과 일치시다. 예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건의 경우, 세척용 부피는 500 μL이어야 한다.
      참고: 표 3에나타낸 바와 같이 프로토콜은 다른 문화 조건에 적용할 수 있다.
   6. Trypan 파란색 염료와 혈세포계를 사용하여 최종 셀 수를 결정합니다.
   7. 세포 수를 얻은 후, 2 x 10⁶ 종양 세포 당 PBS에서 2% FBS의 80 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다.
   8. 2 x 10⁶ 종양 세포 당 마우스 세포 고갈 칵테일 20 μL을 추가하십시오. 잘 섞고 2-8 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
   9. 2 x 10⁶ 종양 세포 당 PBS 완충액에서 2 % FBS로 500 μL로 볼륨을 조정하십시오.
      참고: 2.5 mL의 세포 현탁액에서 최대 1 x 10⁷ 종양 세포를 하나의 LS 컬럼에서 처리할 수 있습니다.
   10. LS 컬럼을 마그네틱 컬럼 분리기위에 로드하고 15mL 원엽 튜브를 랙 아래에 배치하여 흐름을 수집합니다.
   11. PBS 버퍼에서 3 mL의 2% FBS로 각 컬럼을 헹구고 있습니다. 세척 흐름으로 원엽 튜브를 버리고 새로운 멸균 된 15mL 원엽 튜브로 교체하십시오.
   12. 세포 현탁액 (1 x 10⁷ 종양 세포의 최대 2.5 mL)을 컬럼에 추가합니다. 인간 종양 세포로 농축될 흐름을 수집한다.
   13. PBS 버퍼에서 2% FBS의 1 mL로 컬럼을 두 번 세척합니다.
       참고: 열이 비어 있는 즉시 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 또한 기포가 형성되지 않도록하십시오.
2. 원하는 배양 설정에 대한 1.5 mL 튜브에 적절한 양의 세포 현탁액을 Aliquot(표3).
3. 1.5 mL 튜브를 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
4. 조심스럽게 제거하고 상급을 폐기.

2. 환자 원발성 종양 조직의 처리

참고 : 이것은 오르가노이드 설립을위한 초기 단계입니다.

1. 환자 1 차적인 종양 조직의 처리를 위해 필요하지 않은 마우스 세포 고갈 과정을 제외하고 1단계의 전부를 따르십시오.

3. 플레이트에 부착 된 둥근 돔 형성

참고: 이 원고는 그림 1 및 그림 2에 나타낸 바와 같이 세포 펠릿과 지하 막(예를 들어, 마트리겔)의 혼합물로부터 돔을 만드는 세 가지 방법을 설명합니다. 단계 2-4에서, 세포와 지하 막은 지하 막의 응고를 방지하기 위해 얼음에 보관되어야한다.

1. 24웰 플레이트셋에 대해 적절한 부피의 지하막(예를 들어, 40 μL)으로 세포 펠릿을 재중단한다(표3).
2. 피펫을 위아래로 부드럽게 하여 세포가 지하 막에 잘 다시 매달려 있는지 확인합니다.
3. 세포-지하 막 혼합물의 적절한 부피(표3)를피펫(및 adDMEM 완전 배지의 선택적 10 μL)을 예열된 조직 배양 판의 중심으로 한다.
4. 플레이트를 반전시키고 즉시 플레이트를_CO2 세포 배양 인큐베이터에 거꾸로 놓고 5%_CO2,37°C에서 15분 동안 설정하였다. 이것은 지하실 막이 고형화하는 것을 허용하면서 세포가 침전되고 플레이트 바닥에 고수하는 것을 방지합니다.
5. 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 온난화배지의 적정 부피(표3)를각 웰내로 피펫한다.
6. 플레이트를_CO2 세포 배양 인큐베이터 내부에 오른쪽으로 놓습니다(5%_CO2,37°C).
7. 3-4일마다 미디어를 변경합니다. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.

4. 플레이트에 부착 된 둥근 돔에서 부동 돔 형성

1. 3.7단계 후, 셀 스크레이퍼를 사용하여 돔을 분리한다.

5. 부동 구슬 형성

참고 : 이 프로토콜은 지하 막, 미디어 및 오르가노이드의 혼합물이 구슬처럼 보이기 때문에 부동 구슬로 명명됩니다.

1. 파라핀 필름 의 2 인치 x 4 인치 조각을 잘라.
2. 1000 μL 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 빈 팁 홀딩 랙의 디봇 상단에 파라핀 필름을 놓습니다.
3. 부드럽게 장갑 검지 손가락을 사용하여 디봇을 추적하기 위해 파라핀 필름을 아래로 누릅니다하지만 파라핀 필름을 뚫지 않고.
4. 파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드에 UV 램프를 켜서 제조된 파라핀 필름을 30분 이상 살균하였다.
5. 세포와 20 μL의 지하 막을 혼합하여 준비합니다. 파종 밀도는 돔당 50,000 - 250,000 셀일 수 있습니다.
6. 피펫은 제조된 파라핀 막에서 형성된 디봇의 몰드 내로 1단계 또는 2단계, 및 20 μL의 지하막으로부터 처리된 세포의 혼합물이다.
7. 지하 막에 세포 펠렛을 다시 중단하고 제조된 파라핀 촬영 디봇에서 세포 현탁액을 피펫한다.
8. 고형 비즈와 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣습니다. 6 웰 플레이트에 하나의 우물은 5 구슬까지 들어갈 수 있습니다.
9. 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 가열된 배지의 피펫 3-5 mL을 각 우물에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦아냅니다.
   참고: 최소 볼륨으로 3mL를 권장합니다. 웰당 최대 비드 수(N=5)의 경우 중간 크기 5mL를 권장합니다.
10. 플레이트를_CO2 인큐베이터(5%_CO2,37°C) 내부에 놓습니다.
11. 3-4 일마다 오르가노이드 매체를 변경하십시오. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.

6. 현미경을 사용하여 생체 내 오르가노이드 이미지 스티치⁸

참고 : 특정 현미경은 세포 판 (가장자리 벽)의 외부 둘레에 도달 할 수 없습니다; 따라서 이미지 스티칭 할 때 셀 플레이트의 둘레에 가까운 웰을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 키ence 현미경의 플레이트 홀더에 세포 배양 판을 위쪽으로 놓습니다.
2. 렌즈를 대상 돔의 중앙에 놓습니다.
3. 프레임 수를 선택하여 자동 스티칭 프로세스를 설정합니다. 예를 들어 3 x 3 또는 5 x 5를 선택하여 총 9개의 이미지 또는 25개의 이미지를 생성할 수 있습니다.
4. 캡처 버튼을 눌러 이미징 프로세스를 시작합니다.
5. 이미지 뷰어 소프트웨어를 열고 4단계로 촬영한 이미지 그룹을 로드합니다.
6. 이미지 스티칭을 클릭하여 고해상도 스티치 이미지를 만듭니다.
   참고: 직렬 9 또는 25개의 이미지 캡처는 셀에 초점을 맞추도록 수동 또는 자동 설정으로 수행할 수 있습니다.

7. 조직학을위한 오르가노이드 처리 : 아가로스 스핀 다운 방법

참고 :이 프로토콜은 블라코기아니스 외^7에의해 이전 출판물에서 적응된다 . 우리는 성공적으로 오르가노이드의 모든 인구를 포함하기 위해 아가로즈 포함과 관련된 단계를 추가했습니다.

1. 웰에서 기존 미디어를 제거합니다. 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하십시오.
2. 동일한(1단계에서 제거된 용지의 부피와 동일)을 추가하고 4°C에서 60분 동안 배양합니다.
3. 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 분쇄합니다. 1.5 mL 튜브에서 해리 된 돔 및 세포 회수 용액을 수집합니다.
4. 300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
5. 상급 (세포 복구 용액)을 제거하십시오. 최종 펠릿 단계에서 오르가노이드의 존재가 확인될 때까지 모든 상수체를 별도의 튜브에 저장합니다.
6. 차가운 PBS의 원하는 부피(표3)를추가하고 기계적으로 펠릿을 방해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫합니다.
7. 300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
8. 상급체(PBS)를 제거합니다.
9. 펠렛을 상온에서 60분 동안 4% PFA의 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3으로부터1개의 펠렛에 대해 일치하는 부피(예를 들어, 500 μL)로 고정한다.
10. 고정 후, 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를.
11. 상급체(PFA)를 제거합니다.
12. 일치하는 부피(예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3)에서1개의 펠릿에 대해 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척한다.
13. 따뜻한 아가로즈 (PBS에서 2 % 아가로즈)를 준비하십시오.
    참고: 여기서, 동결된 단면도에 대한 세포 펠릿은 프로토콜 7에서 추가단계 없이 OCT 화합물의 200 μL에서 직접 재부유될 수 있다.
14. 아가로스의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (PBS에서 2 %).
    1. 아가로스를 첨가한 직후, 1mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1.5 mL 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 부드럽게 분리합니다. 도 3에도시된 바와 같이, 세포 펠릿이 1.5 mL 튜브의 벽으로부터 물리적으로 분리되지 않은 경우, 아가로스 임베딩 공정 동안 세포 펠릿의 전부 또는 일부를 잃을 위험이 있다.
15. PBS에서 2 % 아가로즈가 완전히 응고 될 때까지 기다립니다.
16. 1.5 mL 튜브로부터 고형화된 아가로즈 블록을 1 mL 주사기에 부착된 25 G 바늘을 사용하여 분리한다.
17. 세포 펠릿을 함유하는 분리된 아가로즈 블록을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달한다.
18. 튜브를 70% EtOH로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 삽입을 위한 종래의 프로토콜을 사용하여 추가로 진행한다.

8. 오르가노이드의 조직학 및 면역형광 세포화학(IFC)

1. 역학 또는 IFC에 대한 슬라이드를 선택합니다.
2. 염색 과정을 시작하기 전에 슬라이드에 있는 셀의 위치를 알아내고 마커를 사용하여 슬라이드의 셀 주위에 원을 그립니다.
3. 슬라이드의 가장자리 또는 보더 주위와 실험실 노트북의 슬라이드에 원이 있는 위치를 그려 위치를 기록합니다.
4. 원하는 염색을 수행합니다.
   참고 : 이 과정에서 일반 제조업체가 화학 물질에 내성이 없기 때문에 표시된 원이 사라집니다. 심지어 일부 반학 영구 마커는 염색 과정에서 지워질 수 있습니다.
5. 염색 과정을 마친 후 실험실 노트북의 도면 위에 슬라이드를 놓아 슬라이드의 셀 위치를 찾습니다.

3D 오르가노이드는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델인 골전이성 전립선암(BMPC)뿐만 아니라 환자 골전이성 전립선암 조직으로부터 직접 적으로 확립되었다(그림4). 간단히, BMPC의 우리의 PDX 모델은 남성 Rag2-/- c-/- 마우스로 종양 세포의 대퇴 내 (IF) 주입에 의해 설립된 다음 PDX 종양을 수확하고 이 원고에 기술된 대로 처리하였다. 그림 4에도시된 바와 같이, PCSD 시리즈의 PDX 종양 조직은 이 프로토콜을 사용하여 형성된 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르가노이드로서 나타나는 차동 표현형을 가진 3D 오르가노이드를 초래했다.

25 개의 고해상도 10 x 배율 이미지에서 스티치 이미지는 지하 막과 오르가노이드의 전체 돔을 보여 주었다(그림 5). 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 특정 크기보다 큰 세포 또는 세포 클러스터를 정렬하거나 수동으로 스페로이드 또는 낭종을 선택할 수있는 옵션이 있습니다.

슬라이드에 단면 된 오르가노이드의 위치를 표시하는 오르가노이드 배양 및 팁의 아가로스 포함을위한 단계는 오르가노이드의 샘플이 원하는 것보다 낮은 세포 밀도를 가질 때 특히 오르가노이드에 IFC를 수행하는 성공을 증가시다. 도 6은 시토케라틴 5(CK5, 기저 상피 세포 마커), 시토케라틴 8(CK8, 발광 상피 세포 마커) 및 DAPI를 표적화하는 오르가노이드의 5 μm 두께의 파라핀 절편에서 IFC의 예를 나타낸다.

그림 1: 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 조직에서 유래한 3D 배양 오르가노이드에 대한 확립 및 특성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 세포 펠릿과 지하 막의 혼합물을 형성하는 방법론. 부속 돔(a),부동 돔(b)및 부동 구슬(c). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 성공적인 아가로즈 임베딩을 위한 핵심 단계입니다. 1.5 mL 튜브의 벽에서 세포 펠렛을 분리하는 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 단일 세포, 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르가노이드를 포함하는 일련의 PCSD PDX 종양에서 오가노이드의 차동 표현형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 총 25개의 고해상도 이미지로부터원시 스티치된 이미지의 예와 셀 수를 계산하거나 셀/셀 클러스터의 면적을 측정하기 위한 후속 분석을 위한 응용 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: CK5 및 CK8 IFC 염색PCSD1 오르가노이드를 보여주는 이미지(파라핀 섹션의 두께 5 μm 두께). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: adDMEM/F12 +/+++ 준비. 이 표는 이전에 Drost et al.5에의해 출판되었습니다.

표 2: C/S 휴먼 미디어용 구성 요소 + 10% FBS. 이 표는 이전에 Drost et al.5에의해 출판되었습니다.

표 3: 하나의 돔에 필요한 시딩 밀도, 지하 멤브레인 부피 및 중간 부피. 이 표는 Drost et al.5에의해 이전 간행물에서 수정되었습니다.

이상희와 크리스티나 A.M. 제이미슨은 조브 메소드 컬렉션의 게스트 편집자입니다.