방법 논문

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

DOI:

10.3791/60367

⸱

2020년 2월 3일

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1Department of Urology, University of California, San Diego, 2Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 3Department of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Radiation Oncology, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopedic Surgery, University of California, San Diego

이 논문에서

요약

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환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

초록

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인간 환자의 종양 표본과 환자 유래 이종이식(PDX) 전립선암 모델에서 오가노이드의 3차원(3D) 배양, 환자 유래 오르가노이드(PDO)로 지칭되는, 종양 발생 과 전립선 암의 전이. 그들의 주요 장점은 기존의 세포주와 비교하여 본래 조직의 독특한 게놈 및 기능적 이질성을 유지한다는 것이다. 더욱이, PDO의 3D 배양은 개별 적인 환자에 대한 약물 치료의 효력을 예측하기 위하여 이용될 수 있고 개인화한 약을 향한 단계입니다. 이러한 장점에도 불구하고, 몇몇 단은 다른 참을성 있는 견본을 위해 요구될 수 있는 PDO 문화 조건의 광대한 최적화 때문에 부분적으로 이 방법을 일상적으로 이용합니다. 우리는 이전에 우리의 전립선암 뼈 전이 PDX 모델, PCSD1, 항 안드로겐 치료에 기증자 환자의 뼈 전이의 저항을 재입증했다. 우리는 항 안드로겐 저항의 메커니즘을 더 특성화하기 위해 PCSD1 3D 오르가노이드를 사용했습니다. PDX 및 PDO 모델에 대한 현재 발표된 연구에 대한 개요에 따라 최적화된 배양 조건에서 돔형 또는 부동 지하 멤브레인(예: Matrigel) 구를 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 스티치 이미징 및 세포 가입은 세포학에 대해서도 설명되어 있다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯, 공동 배양 등을 포함한 다른 응용 분야에 더욱 최적화될 수 있으며 약물 내성, 종양발생, 전이 및 치료법과 관련된 3D 배양 PDO의 특성을 탐구하는데 사용될 수 있다.

서론

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3차원 배양 오르가노이드는 생체 내 아키텍처, 세포 기능 및 그들의 원래 조직의 유전적 서명을 되풀이할 수 있는 잠재력에 대해 관심을 끌고 있다1,2,3,4,5. 가장 중요한 것은, 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델에서 설립 된 3D organoids는 종양 발생시 세포 신호의 메커니즘을 이해하고 각 세포집단6, 7,8,9,10,11,12,13에대한 약물 치료의 효과를 결정하는 귀중한 기회를 제공한다. Dro....

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프로토콜

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이 연구는 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 기관 검토 위원회 (IRB)에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었다. IRB #090401 승인은 UCSD 기관 검토 위원회 (IRB)에서 연구 목적을 위해 환자에게서 외과 견본을 집합하기 위하여 수신되었습니다. 각 환자로부터 동의를 얻어 외과용 뼈 전립선암 전이 시편은 대퇴골의 병리학적 골절의 정형외과적 수리로부터 얻어졌다. 동물 프로토콜은 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 동물 복지 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 된 프로토콜 #S10298 하에 수행되었습니다. 기계적 및 효소적 해리된 환자 종양 조직으로부터의 세포는 앞서설명한바와 같이 6 내지 8주 령 의 남성Rag2-/-및 γ c-/- 마우스로 내-대퇴로 주입되었다. 이종이식 종양 부피는 생체 내 생물 발광 이미징 시스템 및 캘리퍼스 측정을 사용하여 결정되었다. 종양 성장 시 최대 2.0 cm (IACUC에 의해 승인 된 최대 허용 크기), 종양은 3D 오르가노이드 확립을 위해 수확되었다.

참고:

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결과

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3D 오르가노이드는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델인 골전이성 전립선암(BMPC)뿐만 아니라 환자 골전이성 전립선암 조직으로부터 직접 적으로 확립되었다(그림4). 간단히, BMPC의 우리의 PDX 모델은 남성 Rag2-/- c-/- 마우스로 종양 세포의 대퇴 내 (IF) 주입에 의해 설립된 다음 PDX 종양을 수확하고 이 원고에 기술된 대로 처리하였다. 그림 4에도시된 바와 같이, PCSD 시리즈의 PDX 종양 조직은 이 프로토콜을 사용하여 형성된 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르가노이드로서 나타나는 차동 표현형을 가진 3D 오르가노이드를 초래했다.

25 개의 고해상도 10 x 배율 이미지에서 스티치 이미지는 지하 막과 오르가노이드의 전체 돔을 보여 주었다(그림 5). 이.......

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토론

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환자 뼈 전이 전립선 암 세포에서 파생 된 3D 오르가노이드는 여전히 상대적으로 드뭅니다. 여기서는 BMPC의 직렬 3D 환자 유래 오르가노이드(PSO)를 성공적으로 확립하기 위한 전략과 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 IFC 및 IHC 분석을 위해 더 낮은 세포 밀도를 가진 샘플에서 오르가노이드를 고정하기 위해 설명된다. 낭종, 스페로이드 및 더 복잡한 오르가노이드의 형태로 차동 표현형은이 프로토콜이 환자에서 이종 종양 세포 집단이 세포 표현형 과 구조를 유지할 수있는 배양 조건을 제공한다는 것을 나타냅니다. 따라서, 여기에 기술된 배양 조건은, Drost et al.5로부터 FBS 혈청 보충으로 변형된, 환자 BMPC 유래 세포의 배양에 최적인 것으로 나타났으며, 이들이 그들의 주제 내 및 주제 간 이질성을 유지하도록 하였다(제조중인 원고).

당사의 최적화된 프로토콜은 3D 오르가노이드 배양을 설정하기 위해 1차 또.......

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공개 사항

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이상희와 크리스티나 A.M. 제이미슨은 조브 메소드 컬렉션의 게스트 편집자입니다.

감사의 글

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이 연구는 레오와 앤 앨버트 자선 재단과 JM 재단에 의해 지원되었다. 우리는 캘리포니아 샌디에고 무어암 센터 회원, Jing Yang 박사 및 케이 T. Yeung 박사가 기술 전문 지식에 대한 수술학과의 마이크로토메와 랜달 프랑스어의 사용을 허용해 주신 것에 대해 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL PipettmanGilsonF123602
1mL 주사기BD 주사기329654
1.5mL 튜브스펙트럼 실험실 제품941-11326-ATP083
25G 바늘BD PrecisionGlide 바늘305122
4% 파라포름알데히드(PFA)Alfa AesarJ61899
70% 에탄올(EtOH)VWRBDH1164-4LP
A83-01Tocris Bioscience2939
Accumax혁신적인 세포 기술, Inc.AM105
adDMEMLife Technologies12634010
AgaroseLonza50000
항체 -Cytokeratin 5Biolegend905901
Cytokeratin 8Biolegend904801
B27Life Technologies17504044
Bioluminescence 이미징 시스템, IVIS 200Perkin Elmer IncIVIS 200
세포 배양 플레이트 - 24웰Costar3524
세포 배양 플레이트 - 48Costar3548
세포 배양 플레이트 - 6Costar3516
세포 해리 솔루션, AccumaxInnovative Cell Technologies, Inc.AM105
세포 회수 솔루션Corning354253
세포 스크레이퍼Sarstedt83.180
세포 여과기Falcon (Corning)352350
CO2 인큐베이터Fisher Scientific3546
DAPI벡터 벡타실드H-1200
DHT시그마-알드리치D-073-1ML
dPBSCorning/Cellgro21-031-CV
EGFPeproTechAF-100-15
FBSGemini Bio-Products100-106
FGF10PeproTech100-26
FGF2PeproTech100-18B
포셉스Denville ScientificS728696
GlutamaxGibco35050-061
HEPESGibco15630-080
LS 컬럼Miltenyi130-0420401
자기 컬럼 분리기 : QuadroMACS 분리기Miltenyi130-090-976
마커VWR52877-355
Matrigel (성장 인자 감소)Mediatech Inc. (코닝)
Matrigel (High Concentration)BD (Fisher Scientific)CB354248
현미경 이미징 소프트웨어, KeyenceBZ-X800 (최신 소프트웨어) BZ-X700 (구형 소프트웨어)
현미경, KeyenceBZ-X700 (모델 2016-2017) / BZ-X710 (모델 2018-2019)
마우스 세포 고갈 키트Miltenyi130-104-694
N-아세틸시스테인시그마-알드리치A9165-5G
니코틴아미드시그마-알드리치N0636-100G
노긴PeproTech120-10C
OCT 복합티슈-텍4583
파라필름아메리칸 내셔널 캔N/A
Pen-StrepMediatech Inc. (코닝)30-002-CI-1
1 mL용 피펫 팁(파란색 팁)Fisherbrand Redi-Tip21-197-85
플런저(3 mL 주사기에서)BD 주사기309657
프로스타글란딘 E2Tocris Bioscience2296
R-Spondin 1Trevigen3710-001-01
SB2021190Sigma-AldrichS7076-25MG
소형 테이블 상판 원심분리기ThermoFisher Scientific75002426
수조Fisher Sci2320
Y-27632 DihydrochlorideAbmole BioscienceM1817
웰 웰 356231

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  2. Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epi....

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