이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 유도 물질 변형을 정량화하면 세포가 미세 환경의 물리적 특성을 감지하고 반응하는 방법에 관한 유용한 정보를 제공합니다. 세포 유도 물질 변형을 측정하기 위한 많은 접근법이 존재하지만, 여기서는 참조가 없는 방식으로 서브 미론 분해능으로 균주를 모니터링하는 방법을 제공합니다. 2 광자 활성화 포토리소그래피 패터닝 공정을 사용하여 형광 피공 마커의 내장 된 배열을 포함하는 기계적 및 생체 능동 적으로 조정 가능한 합성 기판을 생성하여 3 차원을 쉽게 측정하는 방법을 보여줍니다. 3D) 표면 견인에 대한 응답으로 재료 변형 프로파일. 이러한 기판을 사용하여, 세포 장력 프로파일은 관심 셀의 단일 3D 이미지 스택을 사용하여 매핑될 수 있다. 이 방법론을 가진 우리의 목표는 견인력 현미경 검사법을 세포 mechanotransduction 프로세스를 공부하는 연구원을 위한 공구를, 특히 필드에 이민자를 위한 공구를 실행하기 위하여 더 접근하고 쉽게 만드는 것입니다.
서론
견인력 현미경 검사법(TFM)은 부착 및 수축 세포에 의해 생성된 신탁 마커의 보간된 변위 필드를 사용하여 셀룰러 견인을 근사화하는 과정입니다. TFM을 사용하여 증식, 분화 및 이동과 같은 중요한 세포 과정에 대한 세포 외 환경에서의 기계적 단서의 영향을1,2,3,4로 조사할 수 있습니다. 5,6,7,8,9,10,11,12. 안타깝게도 많은 기존 접근 방식은 고도로 전문화된 분석 및 계산 도구에 익숙해지기 어렵거나 경험이 없는 연구자가 TFM을 사용하기 어렵게 만들 수 ....
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프로토콜
1. PEGDA 베이스 하이드로겔 광중합
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시약 수집
- 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포산산(LAP), 3.4 kDa 폴리(에틸렌) 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), n-비닐 피롤리 도네 (NVP), 알렉사플루어 488 라벨 PEGDA (PEG-488), 알렉사플루어 633 표기 PEGDA (PEG-633), 및 PEGylated RGDS 펩티드 ( PEG-RGDS)를 각각 냉동고에서 실온으로 가져온다.
- 별도의 호박 색 미세 원심 분리 튜브에서 LAP 3 mg, PEGDA 10 mg, PEG-488 5 mg, PEG-633 20 mg 및 RGDS 펩타이드 6 mg을 측정하십시오.
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프리 폴리머 용액의 제조
- LAP를 인산완충 식염수 1 mL(PBS, pH 7.4)에 용해시켰다. 용해된 LAP 용액의 200 μL을 사용하여 PEGDA를 용해시다. 이어서, PEGDA 용액의 200 μL을 사용하여 PEG-RGDS를 용해시다.
참고: 세포 형상의 조절이 필요한 경우, 기본 하이드로겔 전중합액에서 PEG-RGDS를 용해하는 것은 프로토콜의 후반부2광자, 레이저 스캐닝 리소그래피를 통해 첨가될 것이기 때문에 생략한다.
- LAP를 인산완충 식염수 1 mL(PBS, pH 7.4)에 용해시켰다. 용해된 LAP 용액의 200 μL을 사용하여 PEGDA를 용해시다. 이어서, PEGDA 용액의 200 μL을 사용하여 PEG-RGDS를 용해시다.
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결과
프로토콜 전체에 걸쳐 패터닝 프로시저의 품질을 평가하기 위한 피드백을 제공하는 여러 체크포인트가 있습니다. 이러한 각 검사점의 진행 상황을 평가하는 방법에 대한 몇 가지 통찰력을 제공하기 위해 실제 실험의 대표적인 결과를 제공합니다. 결과는 인간 배꼽 내피 세포(HUVECs)의 TFM 분석을 위해 제조된 포토패턴 하이드로겔상에서 수행된 이 프로토콜의 적용을 강조한다. 결과는 원시 이미지 데이터뿐만 아니라 각 중요한 단계에서 처리 된 데이터 출력을 포함한다.
첫 번째 체크포인트는 하이드로겔에서 피덕실 마커 어레이가 포토패턴화되면 4단계에서 발생합니다. 이미지 스택을 수집할 때 결과 이미지는 이미지 스택 내의 z 위치 함수로 강도로 진동하는 패턴피처(그림1A-C)의일반 배열을 표시해야 합니다. 패턴 표면이 완벽하게 평평하지 않은 경우 각 이미지 조각의 다른 영역이 이러한 진동과 관련하여 서로 위상을 .......
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토론
이 프로토콜의 목표는 TFM 데이터의 생성 및 분석과 관련된 많은 어려움을 완화하는 워크플로우를 제공하는 것입니다. 일단 준비되면, photopatterned 하이드로겔은 표준 조직 배양 사례 및 형광 현미경 검사법의 지식만 요구하는 사용이 간단합니다. 참조가 없는 측면은 셀 라덴 하이드로겔에서 평온한 탐색을 가능하게 하며 참조 및 변형된 이미지 간의 이미지 등록과 같은 번거로운 이미지 처리 단계를 제거합니다. 결과 분석은 거의 완전히 자동화되어 있으며 개별 COI의 데이터를 처음부터 끝까지 10분 이내에 분석할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 과제는 포토패턴 하이드로겔의 제조에서 비롯됩니다. 프로토콜에 사용된 시약의 대부분은 사내에서 합성되기 때문에 합성 하이드로겔 물질을 사용한 경험이 거의 없는 사용자가 이 프로토콜을 시도하는 것을 다소 억제할 수 있을 것으로 예상됩니다. 즉, 이 프로토콜에 사용된 모든 PEGylated 구성 요소는 한 냄비 반응을 사용하여 거의 동일한 프.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
O. A. 반다 NSF IGERT SBE2 펠로우십 (1144726), 델라웨어 대학에서 제공하는 스타트업 기금, 국립 보건 원 /국립 암 연구소 IMAT 프로그램 (R21CA214299)의 자금 지원으로 지원되었습니다. JHS는 국립 보건원/국립 암 연구소 IMAT 프로그램(R21CA214299)과 국립 과학 재단 경력 상 프로그램(1751797)의 자금 지원을 받고 있습니다. 현미경 접근은 NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) 및 델라웨어 주에서 보조금에 의해 지원되었습니다. 구조화 된 조명 현미경은 델라웨어 주 연방 연구 개발 보조금 프로그램 (16A00471)의 자금으로 인수되었습니다. 2광자 레이저 스캐닝 리소그래피에 사용되는 LSM880 공초점 현미경은 공유 계측 보조금(S10 OD016361)으로 획득하였다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Acrodisc 주사기 필터, 0.2 μ m Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | 염기 겔 합성 및 후속 리소그래피 단계 전에 거량체 용액을 여과할 수 있습니다. |
| 아크릴레이트-실란 기능성 #1.5 커버슬립< | em>in-house | in-house | 아크릴레이트는 염기 하이드로겔을 유리 표면에 결합하여 하이드로겔을 고정시킬 수 있습니다. 참조 참조: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module은 TFM용 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. | |
| 카멜레온 비전 II | 코히런트 Inc. | 다광자 리소그래피에 사용되는 레이저 스캐닝 현미경이 장착되어 있습니다. | |
| 양면 코팅 테이프, 9500PC, 6.0 mil | 3M | 은 아크릴레이트 실란 기능성 커버 슬립을 페트리 접시에 결합합니다. | |
| Flexmark90 PFW 라이너 | FLEXcon | FLX000620 | 양면 코팅 테이프를 라이닝할 수 있어 플로터에 테이프를 공급할 수 있습니다. |
| 다광자 리소그래피에 사용되는 | LSM-880 | Zeiss | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | : 현미경 및 TFM 데이터 분석을 위한 리소그래피 명령을 생성하기 위해 사용자 지정 스크립트를 실행합니다. |
| 모델 SC 플로터 | USCutter | SC631E | 양면 코팅 테이프를 링으로 잘라 커버 슬립을 페트리 접시에 바인딩합니다. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | 광시야 현미경과 레이저 스캐닝 현미경이 모두 장착되어 리소그래피와 TFM에 모두 사용됩니다. | |
| PEG-AF633 | in-house< | em>in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant. 참조 참조: 21 |
| PEG-DA | em>in-house | in-house | Base material for hydrogels. 참조 문헌 참조: 세포 접착 촉진을 위한 21 |
| PEG-RGDS | in-house | > | RGDS 펩타이드 표지 모노아크릴레이트 PEG 변형체. 참조 참조: 21 |
| 페트리 접시 | CELLTREAT | 229638 | 8mm 구멍은 베이스 하이드로겔에 맞게 코어링 비트를 사용하여 각 접시의 중앙에 절단됩니다. |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning | 3097358-1004 | 염기 하이드로겔 두께(PDMS라고도 함)를 제어하기 위한 스페이서를 만드는 데 사용됩니다. |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | 염기 겔 합성 및 후속 리소그래피 단계 전에 단량체 용액을 필터링할 수 있습니다. |
| UV 램프 | UVP | Blak-Ray® B-100AP | 염기 하이드로겔을 중합합니다. |
| 1-비닐-2-피롤리디논(NVP) | 시그마-알드리치 | V3409-5G | 라디칼 촉진제 및 공단량체. 리소그래피 중 pegylated fluorophore information을 개선합니다. |
참고문헌
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E.
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재인쇄 및 허가
