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Summary

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

Abstract

세포 유도 물질 변형을 정량화하면 세포가 미세 환경의 물리적 특성을 감지하고 반응하는 방법에 관한 유용한 정보를 제공합니다. 세포 유도 물질 변형을 측정하기 위한 많은 접근법이 존재하지만, 여기서는 참조가 없는 방식으로 서브 미론 분해능으로 균주를 모니터링하는 방법을 제공합니다. 2 광자 활성화 포토리소그래피 패터닝 공정을 사용하여 형광 피공 마커의 내장 된 배열을 포함하는 기계적 및 생체 능동 적으로 조정 가능한 합성 기판을 생성하여 3 차원을 쉽게 측정하는 방법을 보여줍니다. 3D) 표면 견인에 대한 응답으로 재료 변형 프로파일. 이러한 기판을 사용하여, 세포 장력 프로파일은 관심 셀의 단일 3D 이미지 스택을 사용하여 매핑될 수 있다. 이 방법론을 가진 우리의 목표는 견인력 현미경 검사법을 세포 mechanotransduction 프로세스를 공부하는 연구원을 위한 공구를, 특히 필드에 이민자를 위한 공구를 실행하기 위하여 더 접근하고 쉽게 만드는 것입니다.

Introduction

견인력 현미경 검사법(TFM)은 부착 및 수축 세포에 의해 생성된 신탁 마커의 보간된 변위 필드를 사용하여 셀룰러 견인을 근사화하는 과정입니다. TFM을 사용하여 증식, 분화 및 이동과 같은 중요한 세포 과정에 대한 세포 외 환경에서의 기계적 단서의 영향을^{1,2,3,4로 조사할 수 있습니다. 5},^{6,7,8,9,10,11,12}. 안타깝게도 많은 기존 접근 방식은 고도로 전문화된 분석 및 계산 도구에 익숙해지기 어렵거나 경험이 없는 연구자가 TFM을 사용하기 어렵게 만들 수 있습니다. TFM 플랫폼을 생성하는 방법론을 설명하며, 이는 분석의 어려움을 제거하는 동시에 높은 처리량의 데이터 수집을 제공합니다.

기존의 TFM 접근법 중, 재료 변형을 정량화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 것은 폴리아크릴아미드 (PAA) 또는 폴리와 같은 변형 가능한 하이드로겔에 작은 형광 마커 (일반적으로 나노 또는 마이크로 미터 크기의 형광 비드)를 통합하는 것을 포함합니다. (에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA)^13,14,15. 이러한 비드 기반 접근법은 관심 셀 주위의 fiducial 마커를 조밀하게 클러스터화하여 변위 샘플링을 최대화하는 기능을 제공합니다. 불행히도, 하이드로겔 전체에 걸쳐 비드의 분포는 공간 조직이 무작위이도록 직접 제어될 수 없다. 이러한 무작위 배치는 비드가 서로 너무 가까워서 정확하게 해결하거나, 기판의 패치가 낮은 품질의 데이터를 생성하도록 확산되는 등의 문제를 초래합니다. 셀이 없는 상태에서 fiducial 마커가 있는 위치를 예측할 수 없는 것은 또한 수집된 모든 셀 견인 데이터 집합에 대해 완화된 상태의 기본 마커의 추가 참조 이미지도 캡처해야 하는 제약 조건을 만듭니다. 응력 이미지의 변위가 응력 이미지와 응력 없는 이미지의 차이로 근사화될 수 있도록 참조 이미지가 필요합니다. 완화 된 상태를 달성 하기 위해, 측정 되 고 세포는 화학적으로 이완 또는 완전히 제거. 이 프로세스는 종종 추가 실험 측정의 수집을 방지, 장기 세포 연구를 억제, 및 처리량을 제한. 또한 참조 이미지에는 실험 중에 발생할 수 있는 드리프트를 수용하기 위한 이미지 등록 기술이 필요하며, 종종 스트레스 상태 이미지를 참조하기 위해 번거로운 수동 일치를 초래합니다.

참조가 없는 것으로 간주되는 다른 TFM 방법, 고해상도 리소그래피, 마이크로 접촉 인쇄 또는 마이크로 몰딩^{16,17,18에 의해 fiducial 마커의 분포에 대한 제어의 일부 형태를 구현 ,19,20}. 참조없는 TFM은 제조 과정에서 마커 위치가 어떻게 처방되었는지에 따라 각 신탁 마커에 대한 완화 된 상태를 예측 할 수 있다는 가정을 통해 달성됩니다. 이러한 방법을 사용하면 fiducial 마커 기하학에서 유추할 수 있는 것보다 암시적 참조와 비교하여 fiducial 마커 변위를 측정하는 단일 이미지 캡처 내에서 셀의 장력 상태를 완벽하게 캡처할 수 있습니다. 마커 배치의 일관성은 일반적으로 이러한 플랫폼을 사용하여 달성되지만, 일반적으로 다음과 같은 널리 사용되는 비드 기반 접근 방식에 비해 자신의 단점으로 고통: 1) 감소 견인 해상도; 2) 평면 외 변위의 정확도 감소(경우에 따라 측정할 수 없는 경우); 및 3) 플랫폼 기판 및 재료 (예 : 리간드 프리젠 테이션, 기계적 특성)의 사용자 정의성을 감소시다.

이러한 단점을 해결하기 위해 새로운 참조 없는 TFM 플랫폼을 설계했습니다. 이 플랫폼은 다광자 활성화 화학을 활용하여 소량의 플루오로포를 하이드로겔 내의 특정 3D 위치로 상호 연결하여 재료 변형을 측정하는 신탁 마커 역할을 합니다. 이러한 방식으로 당사는 비드 기반 접근법과 유사하게 작동하는 플랫폼을 설계했지만, 신탁 마커가 참조가 없는 재료 변형 추적을 허용하는 격자 형 배열로 구성되는 상당한 이점을 가지고 있습니다. 이 참조가없는 속성은 많은 장점을 제공합니다. 무엇보다도, 그것은 세포 견인 상태의 비 관입 모니터링을 허용합니다 (즉, 변위 된 신탁 마커의 참조 위치를 획득하기 위해 세포를 이완하거나 제거 할 필요성을 우회합니다). 이것은 파괴적인 엔드 포인트 TFM 접근 방식으로 어려울 수 있는 TFM과 함께 다른 다운스트림 분석 방법을 통합하기 위해 이 시스템을 설계하는 데 있어 우리의 주요 목표였습니다. 둘째, 격자 형 배열을 기반으로 암시적 참조를 사용하면 변위 분석을 거의 완벽하게 자동화 할 수 있습니다. 배열의 규칙성은 예외적인 경우(예기치 않은 마커 간격 또는 등록 불일치와 같은 예기치 않은 아티팩트를 포함하는 샘플 셀 데이터)의 발생을 최소한으로 유지할 수 있는 예측 가능한 워크플로우를 만듭니다. 셋째, 참조 이미지를 획득할 필요성을 간지러이한 것은 오랜 시간 동안 단일 샘플에서 많은 세포를 모니터링할 수 있는 자유를 제공한다. 이는 현미경의 자동 단계 움직임의 충실도에 따라 위치 설정의 오류가 누적되어 세포 장력에 참조 이미지를 적절하게 등록하는 어려움을 증가시킬 수 있는 기존의 비드 기반 접근법과 대조됩니다. 이미지. 전반적으로 이 플랫폼은 셀룰러 장력 데이터 수집시 더 높은 처리량을 용이하게 합니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 이 참조가 없는 TFM 플랫폼을 생성하기 위해 구현한 2광자, 레이저 스캐닝 리소그래피 기술로 독자에게 익숙해지도록 하여 시드된 세포에 의해 생성된 평면 및 평면 외 견인 구성 요소를 측정할 수 있기를 바랍니다. 표면에. 이 프로토콜에서는 다루지 않는 일부 단일 성분의 합성입니다. 일반적으로, 이들 반응은 앞서^21에설명된 거의 동일한 “원팟” 합성 반응 방식을 포함하며, 이들 제품에 대한 대안도 구매할 수 있다. 또한 시판되는 레이저 스캐닝 현미경을 3D 프린팅 도구로 사용하고 피신 마커 변위 분석을 용이하게 하기 위해 생성된 소프트웨어 기반 도구를 독자에게 숙지하는 것을 목표로 합니다.

Protocol

1. PEGDA 베이스 하이드로겔 광중합

1. 시약 수집
   1. 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포산산(LAP), 3.4 kDa 폴리(에틸렌) 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), n-비닐 피롤리 도네 (NVP), 알렉사플루어 488 라벨 PEGDA (PEG-488), 알렉사플루어 633 표기 PEGDA (PEG-633), 및 PEGylated RGDS 펩티드 ( PEG-RGDS)를 각각 냉동고에서 실온으로 가져온다.
   2. 별도의 호박 색 미세 원심 분리 튜브에서 LAP 3 mg, PEGDA 10 mg, PEG-488 5 mg, PEG-633 20 mg 및 RGDS 펩타이드 6 mg을 측정하십시오.
2. 프리 폴리머 용액의 제조
   1. LAP를 인산완충 식염수 1 mL(PBS, pH 7.4)에 용해시켰다. 용해된 LAP 용액의 200 μL을 사용하여 PEGDA를 용해시다. 이어서, PEGDA 용액의 200 μL을 사용하여 PEG-RGDS를 용해시다.
      참고: 세포 형상의 조절이 필요한 경우, 기본 하이드로겔 전중합액에서 PEG-RGDS를 용해하는 것은 프로토콜의 후반부2광자, 레이저 스캐닝 리소그래피를 통해 첨가될 것이기 때문에 생략한다.
   2. 80 μL의 PBS를 사용하여 PEG-488을 용해시다. 이 용액의 2.5 μL을 프리 폴리머 용액에 추가하십시오.
      참고: PEG-488은 최종 하이드로겔에게 패터닝 중에 탐색하는 데 사용할 수 있는 형광 신호를 제공하며, 농도는 신호 강도를 변경하도록 수정될 수 있습니다.
   3. 용액에 존재할 수 있는 미립자를 제거하기 위해 0.2 μm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터를 통해 완전한 프리 폴리머 용액을 필터링합니다. 반응제가 제대로 합성되면 필터가 막히지 않아야 합니다.
3. 베이스 하이드로겔광중합
   1. 퍼플루오로알코시 알칸(PFA)의 얇은 평평한 시트위에 프리 폴리머 용액의 3 μL을 놓습니다. 평평한 150 μm 두께의 폴리디메틸실록산(PDMS) 스트립을 둘러싸고 있지만, 접촉하지 않는 프리 폴리머 용액을 떨어뜨린다. PDMS에 아크릴레이트 실란화 커버슬립^{21,22,23,24를} 놓고 커버슬립 아래에 프리 폴리머 액적을 배치하여 프리 폴리머 액적을 두께로 평평하게 합니다. PDMS 스페이서.
   2. 하이드로겔이 완전히 형성될 때까지 샌드위치 프리 폴리머 용액을 UV 광에 노출시십시오(370-400nm 빛의 14^mW/cm2에서 약 1분).
   3. PDMS 스페이서에서 커버 슬립을 조심스럽게 분리하고 고성능 양면 아크릴 접착제를 사용하여 오픈 바닥 페트리 접시에 부착하십시오. 접착제 접촉면에 압력을 가하여 커버슬립, 접착제 및 페트리 접시 사이에 완벽한 밀봉을 만들어 유리가 깨지지 않도록 주의하십시오.
   4. 생물학적 및 미립자 오염물질을 최소화하기 위해 멸균 여과 된 PBS를 사용하여 페트리 접시에 하이드로 겔을 헹구고 있습니다.
   5. 필요에 따라 1.3.1-1.3.4 단계를 반복하여 원하는 수의 하이드로겔을 만듭니다.
   6. LAP 용액의 나머지 800 μL에 8 μL의 NVP를 추가하고 이 용액과 용해되지 않은 PEG-633을 패턴화할 준비가 될 때까지 보관하십시오.
      참고: NVP가 있는 LAP 용액은 빛에 매우 민감하며 어둠 속에서 유지되지 않으면 중합됩니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸면 유통 기한을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.

2. 패터닝 지침 작성

1. 이진 이미지 디자인
   1. fiducial 마커 배열을 처방하기 위한 가상 마스크를 만들려면 이미지 처리 또는 그리기 소프트웨어를 사용하여 가로 세로 비율이 100:1(예: 길이 2000픽셀 x 너비 20픽셀)의 이미지를 만듭니다.
   2. 이미지의 긴 축을 따라 중앙에 있는 검은색 배경에 100개의 균등한 간격의 흰색 픽셀행을 만듭니다.
   3. 이 이미지를 *.tif 파일 유형으로 저장합니다.
      참고 : 셀 모양의 제어가 원하는 경우^21,25,26,27^,28,추가 가상 마스크를 만듭니다. 정사각형 이미지 캔버스를 사용하고 검은색 배경에 긍정적인 흰색 피처를 만듭니다. 백색 특징에 적합한 크기를 근사화하기 위해(결국 셀 접착을 지원) 이미지의 총 크기가 레이저 스캐닝 리소그래피에 사용되는 현미경 뷰필드의 크기와 동일하다고 가정합니다.
2. 바이너리 이미지를 디지털 마스크로 변환
   1. 소프트웨어 리포지토리^29에서무료로 사용할 수 있는 LSM-ROI-Generator 기능을 다운로드하십시오.
   2. Matlab을 열고 다운로드한 함수 파일의 디렉토리를 찾습니다. 디렉터리에서 run_script.m Matlab 스크립트를 열고 스크립트를 실행합니다.
   3. 변환을 위해 이진 *.tif 파일을 선택합니다. 그런 다음 폴더를 선택하여 지역 파일을 저장합니다.
   4. 선택한 이미지의 미크론으로 원하는 최종 크기를 입력합니다. 입력 이미지의 배율이 조정되고 이러한 매개 변수와 일치하도록 치수가 조정됩니다. 전체 이미지가 현미경의 시야에 맞도록 하려면 이미지의 총 크기가 현미경 뷰필드의 크기보다 작거나 같아야 합니다.
   5. ROI 생성기 옵션에서 단일 픽셀 배열을 만드는 경우 작은 영역/단일 픽셀에서 체크박스 제거를 선택 취소하고 사각형으로표시된 체크박스를 선택 취소하고 아래에서 사용을 선택 취소해야 합니다. 수평 브레이크 라인. 그런 다음 확인을클릭합니다.
      참고: 단일 셀 패턴을 만들기 위해 영역 파일을 만드는 경우 기본 옵션이 적절합니다.
   6. 이전에 지정된 폴더에서 결과 *.ovl 파일을 찾습니다. 이 파일은 2광자 레이저 스캐닝 리소그래피 동안 레이저 셔터를 제어하는 원하는 영역을 로드하기 위해 현미경으로 가져와야 합니다.

3. 제작 된 신탁 마커 배열

1. 베이스 하이드로겔 담그기
   1. 저조도 조건에서 LAP/NVP 용액의 200 μL을 AF633에 추가합니다(둘 다 1단계에서 준비). 빛으로부터 보호하면서 완전히 섞으세요.
   2. 1단계에서 PEGDA 하이드로겔을 함유한 페트리 접시에서 모든 PBS 용액을 제거합니다.
   3. 용존 PEG-633을 하이드로겔에 첨가하여 염기 하이드로겔을 완전히 포괄하는 액적을 형성한다.
      참고 : 페트리 접시의 구멍이 하이드로 겔보다 약간 큰 경우, 그것은 패터닝 용액을 보유하는 우물 역할을 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 패터닝 용액을 추가하기 전에 커버슬립이 완전히 건조되었는지 또는 하이드로겔이 유출되어 패터닝 중에 하이드로겔이 탈수될 수 있는지 확인하십시오.
   4. 페트리 접시를 현미경 스테이지의 샘플 홀더에 로드하고 뚜껑을 페트리 접시에 놓습니다. 패터닝 용액이 어둠 속에서 적어도 30 분 동안 하이드로 겔에 담가 두십시오.
      참고: 이 흡수 시간 동안 현미경을 켜고 구성할 수 있습니다. 488 nm 레이저를 사용하여 몸을 담그는 동안 하이드로겔을 이미지화하는 것은 괜찮습니다.
2. 현미경 구성
   1. 488 nm 레이저 라인과 이미지 AlexaFluor 488에 적합한 필터를 사용하여 PEG-488 신호를 사용하여 하이드로겔을 찾습니다. 이러한 검출기에서 더 긴 방출 파장의 블록 수집은 PEG-633의 신호로 포화됩니다.
   2. 수직 및 수평 타일 스캔을 사용하여 XY 평면에서 하이드로겔의 중심을 찾고 여기에서 스테이지 위치를 0으로 설정합니다.
   3. 라인 스캔 및 z 스택 기능을 사용하여 하이드로겔의 표면을 찾습니다. 여기서 포커스 위치를 0으로 설정합니다. XY 중심에서 이러한 라인 스캔을 반복하여 하이드로겔을 평평하게 하여 표면 위치를 식별하고 현미경 스테이지에 대한 세트 나사를 조정합니다.
   4. 현미경 소프트웨어 작업 영역 내에서 포토패킹을 위한 별도의 실험 파일을 만듭니다. 다광자 전력을 1.8%(목표의 후면 조리개에서 측정된 740nm에서 15.5mW)로 설정하고 스캐닝 속도를 6(0.1 μm/μs)로 설정합니다. 픽셀당 0.1 μm의 픽셀 크기와 100:1의 가로 세로 비율을 달성하도록 이미지 프레임의 크기를 픽셀 단위로 조정합니다.
   5. 2.2단계에서 만든 영역 파일(*.ovl)을 지역 탭에 로드합니다.
   6. z 스택 함수를 켜고 간격을 3.5 μm로 설정하여 총 깊이 28 μm및 총 z 슬라이스 수 9를 설정합니다.
   7. 위치 함수를 사용하여 하이드로겔의 특정 위치를 설정하여 fiducial 마커 배열이 포토패턴화됩니다.
      참고: 이러한 위치의 z-위치는 각 z 스택의 중심 위치를 지정합니다. 위치를 배치 할 때, 각 위치는 패턴 볼륨이 모든 표면 위치에서 하이드로 겔과 겹치는 것을 보장해야합니다.
   8. 타일 함수를 사용하여 각 위치에 추가 행과 열을 지정합니다. 패턴이 있는 영역이 겹치지 않도록 주의하십시오. 이상적으로는 패턴이 있는 영역이 위치 간에 비어 있고 사용할 수 없는 위치를 제거할 수 있을 만큼 충분히 가깝도록 해야 합니다.
3. 피덕실 마커 어레이의 포토패턴 화
   1. 담그 시간이 30분 마크에 가까워지면 하이드로겔 표면의 연속적인 z-stack 라인 스캔을 5분마다 수행하여 제로 포커스 위치를 기준으로 표면 위치의 변화에 따라 팽윤여부를 확인합니다.
   2. 5분 간격으로 표면 위치가 변경되지 않으면 3.2.4 단계에서 생성된 패터닝 설정을 로드하고 실행합니다.
   3. 패터닝 실험이 완료되면 488 nm 레이저를 사용하여 하이드로겔의 표면이 패터닝 중에 이동하지 않았는지 확인합니다.
      참고: 하이드로겔의 표면이 패터닝 이전과 동일한 위치에 있지 않으면 여러 시나리오가 존재합니다. 하이드로겔은 패터닝 전에 팽윤에 도달하지 않았고, 하이드로겔은 패터닝 중에 건조되기 시작했거나, 현미경은 z-drift를 경험했다. 이 서피스 변환의 소스를 식별하고 후속 패터닝 실행에서 수정해야 합니다.
   4. 현미경에서 하이드로겔을 제거하고 페트리 접시에서 PEG-633 용액을 흡인합니다.
      참고 : 하이드로 겔은 여전히 빛에 매우 민감합니다. 모든 헹구가 완료 될 때까지 어둠 속에서 하이드로 겔을 유지하는 것은 매우 중요합니다.
   5. 멸균 여과 된 PBS로 하이드로 겔을 3 번 헹구고 각 연속 헹구 사이에 헹구십시오. 이 트리플 린스를 1시간 동안 15분마다 반복합니다.
   6. 하이드로겔을 밤새 PBS에서 헹구도록 하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
   7. 하이드로겔을 PBS로 삼중 헹구어 보라고 합니다. 그런 다음 200 증거 에탄올 용액으로 하이드로겔을 빠르게 3 배로 헹구고 PBS로 또 다른 삼중 헹구를 합니다. 하이드로겔이 장시간 200증거 에탄올에 담그지 마십시오.
      참고 : 패터닝 용액의 일부 구성 요소는 용액에서 충돌하여 하이드로 겔 표면에 침전되어 633 nm 조명에서 형광 (~ 1-5 미크론 두께)의 고체 층으로 나타날 수 있습니다. 200 증거 에탄올로 헹구는 것은 이러한 원치 않는 구성 요소를 제거해야합니다.
4. 연속적인 포토패킹을 사용하여 단일 셀 패턴 생성(선택 사항)
   참고: 셀 확산 영역과 모양을 제어하는 것이 필요한 경우 여러 번의 패터닝을 수행할 수 있습니다. 베이스 젤은 초기 제형에서 생략된 PEG-RGDS를 가져야 합니다. 형광 피세포 마커의 표백을 피하기 위해 fiducial 마커 어레이의 패터닝을 마지막으로 수행하는 것이 좋습니다.
   1. 1단계에서 제조된 LAP/NVP 용액에 20 mg의 PEG-RGDS를 용해하십시오.
   2. PEG-633 솔루션 대신 PEG-RGDS 솔루션을 사용하여 3.1 – 3.3 단계를 반복합니다. 단일 셀 패턴을 정의하는 적절한 영역 파일을 사용합니다(지침은 2단계 참조).
      참고: PEG-RGDS 패턴의 배열을 시각화하려면 몇 가지 옵션이 있습니다. PEG-RGDS의 형광 변이체는^21,30 또는 PEG-RGDS를 형광 PEG로 도핑할 수 있습니다. 권장: 488 nm 레이저 라인은 기본 하이드로겔에서 PEG-488 신호를 표백하기 위해 다광자 패터닝 레이저와 함께 실행될 수 있으며 RGDS 통합과 일치하는 비형광 영역을 생성합니다.

4. 신탁 마커 배열 시각화

1. 조작된 어레이의 z 스택 이미지 획득
   1. 페트리 접시의 PBS를 세포 배양에 사용되는 세포 매체로 대체합니다.
      참고 : 페놀 레드 무료 미디어는 광 독성을 방지하기 위해 이미지 수집 중에 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 1시간 의 흡수 시간 후, 구조화 조명 모듈과 고배율 수침 렌즈가 장착된 광시야 형광 현미경을 사용하여 형광 피감 마커에 적합한 필터 세트를 사용하여 하이드로겔을 시각화합니다.
   3. 하이드로겔의 표면으로부터 20 μm 이상의 깊이를 포함하는 고해상도 z-stack 이미지(Z에서 간격0.4 μm)를 수집하여 패턴영역내의 하이드로겔내로, z-stack의 상한이 물리적으로 1-2개 이상의 이미지를 포함하고 있는지 확인한다. 패턴 영역(즉, 형광 피덕셜 마커가 더 이상 표시되지 않고 노이즈만 있는 경우).
      참고: 이 이미지 스택을 수집하면 모든 패터닝 매개 변수가 올바른지 확인하고 5.3단계에서 셀 데이터와 함께 분석할 수 있습니다.

5. 포토패턴 하이드로겔을 사용하여 TFM 수행

1. 파종 세포
   참고: 불임유지를 위해 모든 표준 조직 배양 관행을 따르십시오.
   1. 세포 시딩 에 앞서, 세포 배양 및 유지관리를 위한 각각의 세포주에 대한 표준 프로토콜을 따르십시오.
   2. (선택 사항) 하이드로겔의 멸균이 우려되는 경우, 항생제를 함유하는 매체에서 24시간 동안 하이드로겔을 인큐베이션한 다음 정상 매체로 헹구는다.
   3. 종자 세포에, 하이드로겔 페트리 접시에 사용되는 최종 부피의 미디어에서 트립신화된 세포를 먼저 다시 중단한다.
   4. 하이드로겔 접시에서 모든 용액을 제거하고 셀 라덴 매체로 교체하십시오.
   5. 하이드로겔이 세포가 함유된 매체에 방해받지 않고 10분 동안 그대로 두도록 합니다.
   6. 조심스럽게 인큐베이터에 페트리 접시를 이동합니다. 인큐베이터에서 세포를 4 시간 동안 또는 세포가 눈에 띄게 부착 될 때까지 유지하십시오.
   7. 셀 이면의 미디어를 무세포 매체로 교체하여 부착되지 않은 셀을 제거합니다.
2. 세포와 신탁 마커의 이미지 획득
   1. 현미경상 인큐베이션 챔버의 온도를 37°C 및 CO 2~5%로 설정하고 챔버가 설정점에 도달할 수 있도록 합니다.
   2. 샘플 홀더에 페트리 접시를 놓고 패턴 영역을 찾습니다.
   3. 관심 세포(COI)를 찾아 COI의 투과 또는 형광 이미지를 획득합니다.
      참고: 이 이미지는 분석 중에 셀 경계를 분할하는 데 사용되므로 이미지가 셀 보더를 명확하게 시각화해야 합니다.
   4. 4.1.4 단계에서와 같이 COI 아래에 패턴된 배열의 z 스택을 획득합니다.
   5. 세포의 전송 되거나 형광 이미지의 두 번째 세트를 획득.
      참고: 두 번째 이미지 세트를 첫 번째 이미지로 비교하여 광독성으로 인한 세포 손상이 관찰되는지 여부와 이미지 수집 설정을 조정해야 하는지 여부를 결정합니다. 노출 후에 수축하는 세포는 결과에 영향을 미칠 수 있는 중요한 광독성 효력을 겪었을 가능성이 있습니다.
   6. 각 COI에 대해 5.2.3-5.2.5 단계를 반복합니다.

6. 이미지 분석

1. 분석을 위한 이미지 파일 준비
   1. 5.2단계에서 수집된 데이터를 사용하여, COI 주변 영역의 자른 이미지 스택을 준비하여 스택의 하단 이미지(첫 번째 이미지)가 첫 번째 프레임을 나타내며: (1) >80%의 패턴 마커 컬럼이 표시되고, (2) 최상위 이미지(마지막 이미지)를 나타냅니다. 스택에서 더 이상 눈에 보이는 fiducial 마커를 포함하지 않습니다 (즉, 하이드로 겔 표면 위), (3) COI를 둘러싼 비 응력 fiducial 마커의 적어도 20 μm가있다.
      참고: 이미지를 자르면 분석 중에 계산 시간이 크게 줄어듭니다. 이후 단계의 분석 코드는 이미지를 자르지 않고 실행할 수 있지만 권장되지는 않습니다.
   2. 이전 단계에서 스택의 XY 자르기와 일치하도록 전송된 이미지 및/또는 형광 이미지의 자른 이미지를 만듭니다.
   3. 셀 모양을 더 대표하는 절개된 전송 된 이미지 또는 형광 이미지를 사용하여 이미지를 손으로 분할 (셀 테두리 추적) 또는 이미지 처리 도구를 통해 사용합니다.
   4. 이 이미지를 이진 이미지로 변환하여 셀의 내부가 검은색(즉, 강도 = 0) 셀을 둘러싼 영역이 흰색(즉, 강도  0)인 경우. 이 이미지를 이진 Mask.tif로저장합니다.
   5. 각 COI에 대해 단일 폴더에서 이미지 스택 파일, 전송된 이미지 파일 및 이진 마스크 파일을 수집합니다.
2. 이미지에서 분석 스크립트 실행
   1. 복제 또는 소프트웨어 저장소^29에서무료로 사용할 수있는 TFM 분석 기능을 다운로드합니다. 하위 폴더에 많은 종속성이 있기 때문에 전체 리포지토리를 다운로드해야 합니다.
   2. Matlab을 열고 코드 리포지토리의 로컬 복제본의 디렉터리 및 모든 하위 폴더를 경로에 추가합니다.
   3. Matlab 작업 영역 내의 디렉터리를 6.1단계에서 준비된 이미지가 저장된 폴더 위치로 설정합니다.
   4. tracking.m 스크립트를 열고 실행합니다. 메시지가 표시되면 지침에 따라 적절한 이미지를 로드하고 초기 전처리 단계를 수행하고 개체 추적 알고리즘에 대한 오류를 확인합니다.
   5. 스크립트가 완료되면 dispShear.m 함수를 열고 실행합니다. 이 스크립트에는 사용자의 입력이 필요하지 않습니다.
   6. dispShear.m 스크립트가 완료되면 disp3D.m을열고 실행합니다. 이미지를 열라는 메시지가 표시되면 지침을 따르십시오.
      참고: 런타임 동안 스크립트는 패턴배열이미지에 선을 그려달라고 요청할 수 있습니다. 이 선은 패터닝 중에 스캐닝 레이저의 기본 모션 축을 나타내야 하며 패턴이 있는 fiducial 마커행으로 정렬되어야 합니다. 이 프로세스는 코드에 가장 정렬된 수탁자 마커 행을 생성할 수 있는 방향(예: fiducial 마커의 행 또는 열)을 지시합니다.
   7. dispShear.m 코드가 완료되면 dispSurface.m 코드를 실행한 다음 interpFinal3D_2.m 코드를 실행합니다. 이러한 스크립트에는 사용자의 입력이 필요하지 않습니다.
      참고: interpFinal3D_2.m 스크립트는 변위 데이터를 외부에서 얻은 소프트웨어를 사용하여 표면 견인으로 변환하며, 이는 이전에^{설명된 31입니다.} 이러한 외부 함수를 적용하기 위해 interpFinal3D_2.m는 변위 데이터를 균일한 그리드로 보간하여 변환 함수의 입력역할을 합니다. 다른 변환 방법을 사용하거나 견인이 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   8. 모든 스크립트가 실행되면 초기 디렉터리에서 모든 데이터와 출력을 찾을 수 있는지 확인합니다.
   9. 각 COI에 대해 6.2.3 – 6.2.8단계를 반복합니다.
      참고: 코드 리포지토리 에는 디렉터리 목록에서 각 스크립트를 자동으로 일괄 적으로 실행할 수 있는 스크립트가 포함된 폴더가 있습니다. 사용 방법에 대한 지침은 자동화 스크립트 자체(예: 코드 내의 주석)를 참조하십시오.

Representative Results

Discussion

이 프로토콜의 목표는 TFM 데이터의 생성 및 분석과 관련된 많은 어려움을 완화하는 워크플로우를 제공하는 것입니다. 일단 준비되면, photopatterned 하이드로겔은 표준 조직 배양 사례 및 형광 현미경 검사법의 지식만 요구하는 사용이 간단합니다. 참조가 없는 측면은 셀 라덴 하이드로겔에서 평온한 탐색을 가능하게 하며 참조 및 변형된 이미지 간의 이미지 등록과 같은 번거로운 이미지 처리 단계를 제거합니다. 결과 분석은 거의 완전히 자동화되어 있으며 개별 COI의 데이터를 처음부터 끝까지 10분 이내에 분석할 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 과제는 포토패턴 하이드로겔의 제조에서 비롯됩니다. 프로토콜에 사용된 시약의 대부분은 사내에서 합성되기 때문에 합성 하이드로겔 물질을 사용한 경험이 거의 없는 사용자가 이 프로토콜을 시도하는 것을 다소 억제할 수 있을 것으로 예상됩니다. 즉, 이 프로토콜에 사용된 모든 PEGylated 구성 요소는 한 냄비 반응을 사용하여 거의 동일한 프로토콜에서 합성되며 많은 구성 요소가 상용 공급 업체에서 구입할 수 있습니다.

이 프로토콜은 또한 레이저 스캐닝 현미경의 사용에 대한 숙달이 필요합니다. 레이저 스캐닝 파라미터는 레이저 강도, 대물 렌즈 및 기타 현미경 구성 요소가 동일한 모델의 현미경 사이에서도 달라질 수 있으므로 모든 다른 현미경에 대해 최적화되어야 합니다. 사진 패터닝에 가장 적합한 현미경 설정을 결정하는 간단한 방법은 다양한 설정으로 스캔 패널을 수행하는 것입니다. 샘플에서 받은 총 레이저 노출에 영향을 주는 모든 설정은 패턴마커의 크기와 품질에 영향을 미칩니다. 여기에는 스캔 속도, 픽셀 크기, 평균 수, 레이저 전력/강도/플렌스, 배율 및 숫자 조리개^32,33이포함됩니다. 레이저 파워와 스캔 속도를 조정하는 것이 가장 쉬운 경우가 많므로 이러한 두 가지 매개 변수로 시작하는 것이 좋습니다. 또한 영역 파일을 생성하는 데 사용되는 소프트웨어는 우리가 사용하는 현미경의 브랜드를 위해 특별히 설계되었으며 다른 현미경 만들기 및 모델을 수용하기 위해 보강해야 할 수도 있음을 주목해야한다. 프로토콜에 제공된 설정을 통해 사용자는 XY에서 0.84±0.11 μm의 전체 너비 하프 맥스 치수의 3D 가우시안과 같은 강도 프로파일을 사용하여 타원 마커를 생성하고 Z에서는 3.73±0.30 μm을 생성할 것으로 예상해야 합니다. 개체 감지 알고리즘은 질량 중심을 사용하여 마커 중심을 식별하고 마커가 명확한 강도 구배를 표시할 때 가장 잘 수행됩니다.

하이드로겔을 적절히 헹구고 빛으로부터 오염물질로부터 보호하는 것은 세포 배양에 매우 중요합니다. 프로토콜에서 언급한 바와 같이, 일부 패터닝 성분은 하이드로겔의 표면에 용액 및 침전물에서 충돌할 수 있다. 이러한 성분이 표면에서 완전히 헹구지 않으면 세포 접착력이 예기치 않게 영향을 받을 수 있습니다. 하이드로겔이 패터닝 용액에 담가있는 동안, 심지어 작은 용량에서 UV 스펙트럼 빛에 노출되면, 패터닝 용액은 중합하기 시작하고 나쁜 결과를 얻을 것이다. 마지막으로, 공기 중의 미립자 또는 여과되지 않은 미립자는 특히 형광인 경우 분석을 복잡하게 만듭니다. 이러한 오염 물질이 프로토콜의 모든 단계에서 샘플에 유입되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다.

분석 코드는 변형된 마커와 동일한 행 또는 열에 있는 변형되지 않은 마커에서 원래 배열을 예측하여 변형된 fiducial 마커의 참조 위치를 예측합니다. 이렇게 하면 분석이 크게 단순화되지만 분석할 수 있거나 분석할 수 없는 항목도 일부 제한됩니다. 최소한 분석되는 각 변형마커는 정확한 예측을 할 수 있도록 변형되지 않은 마커열과 행의 2개 이상의 멤버를 가져야 합니다. 행은 현미경의 단일 라인 스캔에 인쇄된 점 그룹에 의해 정의되며, 컬럼은 z-stack 함수를 사용하여 단일 수직 축에 패턴이 있는 마커에 의해 정의됩니다. 이렇게 하면 각 패턴 영역의 길이와 깊이를 기준으로 단일 셀 또는 소규모 셀 클러스터로 분석이 제한됩니다. 두 패턴 영역을 서로 완벽하게 나란히 배치하면 이 문제는 해결되지 않습니다. 이는 XY 구성 요소가 정렬될 수 있지만 샘플 표면이 초점 평면과 스테이지 모두에서 완벽하게 평평하지 않으면 배열의 Z 위치 구성 요소를 완벽하게 정렬하는 것이 불가능하기 때문입니다. 이러한 제한을 피하는 가장 좋은 방법은 특히 접착 리간드 배치를 지시하는 패터닝의 추가 라운드를 사용하는 것입니다. 제대로 정렬되면 셀 접착이 패턴의 사용 가능한 영역으로 제한될 수 있습니다.

분석 코드는 마커가 Z에서 약 3.5 μm, X및 Y에서 2.1 μm 간격으로 배열되는 사각형 배열에 최적화되었습니다. 최종 간격은 패터닝 충실도 및 부종에 따라 달라지지만 행 내 간격이 일관된 경우 성능에 큰 영향을 미치지 않습니다(행 간 간격 가변성은 추적에 영향을 주지 않음). 코드가 서로 규정된 배열에서 완료되도록 실행될 수 있지만 배열이 여기에 나열된 매개 변수와 일치하지 않으면 현재 상태가 좋지 않을 수 있습니다. 분석 코드의 현재 목표는 가변 간격과 삼각형 배열에 대한 지원을 포함하여 견인 재구성 정확도를 향상시키고 사각형 배열에 비해 지역 편향을 줄일 수 있습니다.

결론, 우리는 세포 기능을 교란하지 않고 TFM 데이터의 허구 수집 및 분석을 허용하는 TFM에 대한 접근 방식을 제공합니다. 이 접근 방식의 목표는 TFM 데이터의 해상도와 품질을 손상시키지 않으면서 보다 접근하기 쉽고 방해가 되지 않는 TFM 접근 방식을 제공하는 것입니다. 우리는 이 방법론이 세포의 관찰된 물성성질과 세포 표현형의 생화학적 지식의 융합을 촉진할 것으로 기대합니다.

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	<em>in-house</em>	<em>in-house</em>	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	<em>in-house</em>	<em>in-house</em>	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	<em>in-house</em>	<em>in-house</em>	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	<em>in-house</em>	<em>in-house</em>	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray&reg; B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.