우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다.
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방법 논문
총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다
이 논문에서
요약
초록
수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 클러스터링 이벤트를 검출하고 군집의 정도를 측정하는 몇 가지 방법이 적용 가능하다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포의 막에 있는 mEGFP 꼬리표 수용체 동종 복합체의 평균 올리고메릭 상태를 결정하기 위하여 화상 진찰 접근을 기술합니다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다. N&B는 형광 상관분광법(FCS) 및 광자 계수 히스토그램(PCH)과 유사한 방법으로, 형광의 형광 강도의 변동에 대한 통계적 분석을 기반으로 조명 안팎으로 확산되는 형광 의 강도에 대한 통계적 분석을 기반으로 합니다. 관찰 시간 동안 볼륨을 볼 수 있습니다. 특히, N&B는 올리고머 혼합물에서 평균 단백질 수에 대한 정보를 얻기 위해 PCH를 단순화한다. 강도 변동 진폭은 불소의 분자 밝기와 조명 부피 내의 평균 형광부 수에 의해 설명됩니다. 따라서 N&B는 진폭 분포의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도와 분산만 고려합니다. 이것은, 동시에, 방법의 강도와 약점이다. 두 순간만 고려되기 때문에 N&B는 혼합물에서 알 수 없는 올리고머의 어금니 분율을 확인할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태만 추정합니다. 그럼에도 불구하고, 단순히 형광 강도의 시간 변동을 모니터링함으로써, 픽셀 단위로 라이브 셀의 이미지의 상대적으로 작은 시간계 (다른 모멘트 방법에 비해)에 적용 될 수있다. 픽셀당 유효 시간을 몇 마이크로초로 줄여 초 단위로 수집할 수 있으므로 빠른 올리고머화 역학에 필요합니다. 마지막으로, 넓은 세포 지역 뿐만 아니라 하위 세포 구획을 탐구할 수 있습니다.
서론
우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 수용체 분자의 평균 올리고메상태를 결정하기 위한 총 내부 반사 형광 수 및 밝기(TIRF-N&B) 이미징 접근법을 설명하며, 수용체 어셈블리를 연결하는 것을 목표로 합니다. 단백질의 생물학적 기능에 역학(그림 1).
세포외 리간드 결합시, 수용체는 그들의 형태, 올리고머화, 잠재적인 공동 수용체 및 막 조성에 따라 세포내 신호 변환을 개시한다. 수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 세포 신호의 주요 사건으로 인식1,2,3,4,5,6, 7,몇 가지 방법은 클러스터링 이벤트를 감지하고 실험적으로 클러스터링의 정도를 측정 할 수 있습니다8,9. 공초점 부피(....
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프로토콜
1. 견본 준비
- 1일차. 유리 바닥 접시에 100,000-200,000 세포 / mL의 농도에서 완전한 배지에 종자 HeLa 세포. 씨앗 6-8 접시를 복제합니다.
참고: 이 예에서, 배지는 10% 열 불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS), 1 mM 나트륨 피루브, 100 U/ 100 μg 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충됩니다. 여러 가지 복제 요리가 준비됩니다. - 2-3일차. 세포가 하위 합류에있을 때, 단백질 플라스미드와 요리의 절반을 트랜스 펙하고 두 번째 절반은 세럼이없는 배지에서 참조 플라스미드 (단량체 및 디머)를 사용합니다.
참고: 형질감염은 페놀 레드없이 항생제, 0.1% 소 혈청 알부민 및 25 mM HEPES 완충액으로 보충된 무혈청 배지로 만들어집니다. - 3-4일차. 형질 감염된 세포가 접시의 바닥에 부착되어 있고 세포막이 형광인지 확인하십시오. 자란 세포나 형광이 매우 낮은 접시를 버리십시오.
참고: 세포가 자라지 않도록하십시오. 세포는 잘 분포되어야하며 접시의 유리 영역에 부착해야합니다(그림 1A). 사전 코팅 된 유리 바닥 ....
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결과
동일한 배양 접시에 시드된 두 개의 대표적인 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포에 대한 결과는 도 5 및 보충표 1에나타내었다. 두 세포를 FGF2 리간드를 첨가한 후 0분(도5A,위) 및 7분(도5A,하단)에 포획하였다.
도 5는 또한 순수한 단량체, GPI-mEGFP(도5B,상단) 또는 공유 연결된 디메릭 플루오로폴레, GPI-mEGFP-mEGFP(그림
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토론
N&B는 셀 모델 및 라벨링 전략의 선택에 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 이미지 캡처 시간 동안 안정적으로 부착된 상태로 유지되는 라이브 셀에만 적용할 수 있습니다. 전체 셀 강성 변위로 인한 추가 변동은 적절한 이미지 복원 접근법38로처리될 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 세포가 움직일 때, 세포막은 또한 변형되고, 구조 변형, 큰 추가 편광을 일으키, 막 단백질의 분석에 심각한 한계를 소개합니다. 이 작업에서, 형광 구조체는 구성FGFR1이 무시할 수 있기 때문에 HeLa 세포주에서 발현된다. 구성 단백질의 존재는 피하는 조건, 그렇지 않으면 형광 및 비 형광 수용체 올리고머의 혼합 인구는 가능성이 형성 할 것이다. 결과적으로, 형광태그가 붙은 단백질 집단의 밝기만을 기반으로 하는 N&B 분석은 평균 올리고머 상태에 대한 신뢰할 수 없는 추정치를 반환합니다. 이러한 양상은 FGF2 리간드의 존재 시 FGFR1 이광과 같은 밝기가 2의 인자에 의해서만 증가하는 수용체 이광 이벤트.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
CNIC는 시엔시아, 이노베이션 y 유니버시다데스 및 프로 CNIC 재단의 지원을 받으며, 세베로 오초아 우수 센터(SEV-2015-0505)입니다. 우리는 또한 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) "우나 마네라 드 헤이서 유로파"에 의해 지원됩니다. UC는 아소시아지오네 이탈리아나 리카르카 술 칸크로, 국제 암 연구 협회(현재 전 세계 암 연구로 알려짐), 이탈리아 보건부의 지원을 인정합니다. A.T.는 2011-2012년 "프로게토 프로게토 프로페셔널이바노 베치"와 함께 자신의 작품을 부분적으로 지원한 것에 대해 "폰다지오네 방카 델 몬테 디 롬바르디아"를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3색 고속 TIRF Leica AM TIRF MC 도립 현미경, SMI 자동 TIRF 정렬. 현미경에는 다이오드 488nm 레이저, 100x 1.46 오일 TIRF 대물렌즈, 490/20 및 525/50의 Ex/Em 대역통과 필터, 온도/CO2 인큐베이터 및 Andor DU 8285 VP EMCCD 카메라가 장착되어 있습니다. 현미경은 라이카 LIF 소프트웨어로 작동됩니다. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| 소 혈청의 알부민 98% 미니먼 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM 페놀 레드 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 21063029 | 현미경 검사에 무함유 |
| 세럼 DMEM 고포도당 글루타MAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10566-016 | 완전 배지에 사용 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, 적격, 브라질 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | 완전 배지에 대한 10% 불활성화 보충제 |
| 유리 바닥 35mm 멸균 1.5 접시 | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | 비코팅, 유리 두께 0.17 미크론 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| 인간 자궁 경부 암종(HeLa), 무혈청 동물 성분(AC) 세포 | Millipore-Sigma ECACC, 다름슈타트, 독일 | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD(이면조사형) ANDOR Solis 소프트웨어 | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | ANDOR 카메라 현미경의 추가 포트에 설치된 이 카메라는 N&를 획득하는 데 사용됩니다. B 시계열 | |
| Matlab 실행 파일 N& B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, 마드리드, 스페인 | https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | 보충제 페니실린/스트렙토마이신 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 발현 벡터 | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI 발현 벡터 | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, 마드리드, 스페인 | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | 리간드 용액: 0.01%BSA가 보충된 PBS의 FGF2 20ng/mL. | |
| 피루브산 나트륨 GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 용 1mM 보충제 |
| MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR | 2300 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드 | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% 보충제, 트랜스펙션에 사용되는 페놀 레드가 없는 배지 |
참고문헌
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
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