방법 논문

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

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DOI:

10.3791/60410

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2020년 1월 9일

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1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

교신 저자: Moshe Elkabets <moshee@bgu.ac.il>

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

원발성 정상 상피 세포의 사용은 군집된 조절 식 인터스페이스를 사용하여 종양 유전자 및 종양 억제 유전자에 특정 돌연변이를 도입하여 세포 변형에 필요한 게놈 변경을 재현가능하게 유도할 수 있게 합니다. 마우스에 있는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 기지를 둔 게놈 편집 기술. 이 기술은 우리가 정확하게 마우스를 사용하여 인간적인 암에서 일어나는 유전 변경을 모방하는 것을 허용합니다. 뮤린 원발성 세포를 유전적으로 변형시킴으로써 암 발병, 진행, 치료 및 진단을 더 잘 연구할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 시험관에서 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하여 게놈 편집을 가능하게 하기 위하여 Cre 유도가능한 Cas9 마우스 혀 상피 세포를 이용했습니다. 구체적으로, KRAS, p53 및 APC를 정상 혀 상피 세포에서 변경함으로써, 우리는 생체 외에서 뮤린 두경부암(HNC) 세포주생성, 이는 합성 마우스에서 종양발생이다. 여기에 제시된 방법은 특정 게놈 변경을 가진 HNC 세포주를 생성하는 방법을 상세히 기술하고 syngeneic 마우스에 있는 종양 진행을 예측하기 위한 그들의 적합성을 설명합니다. 우리는 이 유망한 방법이 HNC의 종양 생물학 그리고 치료를 공부하는 유익하고 유용할 것이라는 점을 구상합니다.

서론

HNC는전세계적으로 일반적인 악성 1입니다. HNC 신생물의 기원을 모델링하는 것은 현재 과학적 전환점2. 많은 유전 적 돌연변이가 HNC2,3,4 (예를 들어, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 및 RAS)에서 확인되었지만 HNC를 유도하기 위해 함께 요구되는 유전체 변종의 특정 조합은 불분명하게 남아 있다.

인간 HNC 세포주의 현재 사용은 크게 병인 및 치료와 관련된 메커니즘을 해명하는 데 도움이3. 그러나, 면역 타협 된 뮤린 시스템에서 인간 세포주의 연구는 그 한계를 가지고, 이러한 시스템은 생체 내 신생물 과정, 특정 유전자 돌연변이의 역할, 및 면역 미세 환경에서 치료 반응을 해결하지 않기 때문에. 그러므로, 특정 유전 변경을 가진 murine 세포주의 발달 그리고 설치는 다른 유전자가 어떻게 다른 유전자가 변환 프로세스에 기여하는지 공부하고 면역 적격 마우스에 있는 새로운 분자 기지를 둔 치료를 시험하기 위하여 1 차적인 중요합니다.

생물 의학 연구에서 유전자 기능 연구는 DNA 편집 기술의 발전에 의해 크게 영향을 받았습니다, 이중 가닥 휴식 (DSBs)를 도입 하 여, 예를 들어5. 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제, 클러스터된 조절 식 간 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR/Cas9)의 사용을 포함한 이러한 기술은 궤적에서 관심 있는 유전자의 조작을 허용합니다. 최신 CRISPR/Cas9 시스템은 게놈의 특정 부위에서 DSB를 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에게 지시하는 가이드 RNA(gRNA)로 구성됩니다. 이 시스템은 어떤 세포 또는 표적 조직에서 내인성 유전자를 수정하는 데 있어, 심지어 가장 전통적으로 치료하기 어려운 유기체에서도5. 단순성, 속도 및 효율성으로 인해 다른 시스템에 비해 여러 가지 장점이 있습니다.

종양학에서 CRISPR/CAS9 기술은 암세포를 효과적으로 모방할 필요성을 충족시켰습니다. HNC에 있는 이 시스템을 설치하기 위하여는, 우리는 강력한 KRAS 종양유전자 및 2개의 중요한 종양 억제유전자, APC 및 p536를조작했습니다. GENIE 데이터베이스7에따르면, 이 조합은 HNC에서 드물다. RAS 돌연변이 (HRAS, NRAS 및 KRAS)는 모든 HNC 인구의 단지 ~7%에서 존재합니다. 이러한 종양은 치료8,9에내성이있는 경향이있다.

Cas9 및 그 gRNA의 전달은 AAV 또는 렌티바이러스를 사용하여 바이러스 성 전달을 통해 달성된다. 재조합 AAV는 종종 그것의 높은 역가, 온화한 면역 반응, 세포의 넓은 범위를 변환 하는 능력, 그리고 전반적인 안전 으로 인해 대상 세포에 유전자를 제공 하기 위한 바람직한 방법. AAV 시스템을 사용하여 다양한 조직 특이적 마우스 세포주가 생성되고 있으며, 새로운 세포주는 여전히10,11,12로개발되고 있다. 그러나, 뮤린 HNC 세포주 모델 세포를 생성할 수 있는 효율적인 게놈 편집 시스템은 여전히 개발되고 있다. 이 연구에서, 우리는 1 차적인 뮤린 혀 세포를 종양성 상태로 변형시키기 위한 시험관 내 AAV-Cas9 기반 시스템을 개발하고자 했습니다. 이러한 독특한 CRISPR/Cas9 형질전환 프로토콜 및 확립된 종양 세포주들은 다양한 게놈 변화에 의해 유도된 HNC의 생물학을 더 잘 이해하는데 사용될 수 있다.

프로토콜

이 연구는 네게브 동물 관리 및 사용 위원회의 벤 구리온 대학에 의해 승인되었다. 동물 실험은 IACUC(IL.80-12-2015 및 IL.29-05-2018(E))에 의해 승인되었다. 이 연구에 사용된 동물 실험, 주거 및 환경 조건의 모든 측면은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드13을준수했다.

1. 아데노 관련 바이러스 생산

  1. 1일차: 세포 배양
    1. DMEM의 15 mL에서 14.5 cm 플레이트 당 종자 4 x 106 HEK293T 셀. 폴리에틸렌민 (PEI)(1 μg / μL)으로 형질 전환용 접시 10 개를 준비하십시오.
  2. 일 2: PEI를 사용하여 HEK293T 세포의 형질 감염
    1. 용지를 제거하고 트랜스펙션 전에 따뜻한 DMEM 1시간으로 다시 급지하십시오.
    2. 전렘 형질 감염 시약 및 DMEM.
    3. AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre SG Sg KRAS sg P53- KRAS HDR), AAV 2/9n 캡시드 플라스미드 10 μg(AAV2의 대표 유전자 및 AAV9의 캡 유전자포함) 10 μg를 함유한 플라스미드를 사용하십시오. 및 플레이트 당 도우미 플라스미드 (pAdDelta F5 도우미)의 10 μg (재료 표참조).
      참고 : 도우미 플라스미드의 새로운 세대 - pAdDeltaF614,15,16 또한 AAV 생산에 사용할 수 있습니다.
    4. 플레이트 당 일반 DMEM의 1 mL에 플라스미드를 섞는다. 그런 다음 90 μL의 폴리에틸렌민 (총 플라스미드 : PEI 농도 = 1:3)을 플라스미드 믹스및 와류에 잠시 추가합니다.
    5. PEI-플라스미드 DNA 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
    6. HEK293T 세포 위에 하강혼합물을 넣고 24시간 동안 5%CO2로 37°C에서 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 옮김을 전달한다.
  3. 3일차: 형질전환 후 중간 변화
    1. 매질을 완전히 제거하고 신선한 DMEM 15 mL를 추가합니다.
  4. 일 5: 바이러스 수확
    1. 드라이 아이스/에탄올 목욕을 준비합니다.
    2. 셀 스크레이퍼로 세포를 수집하고 50 mL 튜브 (50 mL 튜브 당 2 플레이트)로 옮김을 옮니다.
    3. 실온에서 15 분 동안 800 x g의 회전 튜브.
    4. 모든 튜브에서 상급을 폐기하십시오. 용해 완충액의 0.5 mL (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8.5)를 플레이트 당 (즉, 10 플레이트에 대해 5 mL)을 첫 번째 튜브에만 추가하십시오. 셀을 다시 일시 중단하고 총 부피를 다음 튜브로 옮기고 마지막 튜브까지 계속합니다.
    5. 셀 현탁액을 신선한 50 mL 튜브로 옮김. 1.4.4단계에서 설명한 것과 동일한 전달 방법을 사용하여 동일한 부피의 용해 완충액(플레이트당 0.5 mL)으로 튜브를 세척합니다.
    6. 전지 현탁액을 드라이 아이스/에탄올 목욕과 37°C 수조 사이의 ~10분 동결/해동 주기의 3라운드로 진행한다. 해동 후 잠시 소용돌이.
    7. 정제가 같은 날에 수행되는 경우, RT에서 평형 및 용출 버퍼(레시피에 대한 표 1 참조)를 설정합니다.
    8. 접시 당 벤조나아제 50 단위를 넣고 1.5 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
      참고: 벤조나제는 숙주 생산자 세포및 세포 현탁액에 존재하는 플라스미드 DNA로부터 잔류 핵산을 소화하는 데 사용된다.
    9. 튜브를 4°C에서 15분 동안 3,000 x g으로 회전시다.
    10. 18 G 강철 바늘을 사용하여 주사기에서 상판액을 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 용액을 15 mL 튜브로 밀어 조용액을 얻습니다.
    11. 정제 또는 정제를 계속할 때까지 몇 주 동안 4°C에서 용해물을 저장한다.

2. AAV 정제

  1. 5일차 이상
    1. RT에서 평형 및 용출 버퍼를 배치합니다.
    2. 평형 버퍼의 10 mL로 크로마토그래피 컬럼을 세척합니다.
    3. 열(17)에 헤파린 아가로즈 플레이트당 0.5 mL를 추가한 다음 평형 버퍼(헤파린 아가로즈의 부피의 4배)를 추가합니다. 열을 반전시켜 솔루션을 혼합하고 아가로즈 퇴적물을 보자.
    4. 중력에 의해 컬럼에서 평형 버퍼를 용해시다.
      참고: 아가로오스가 마르지 않도록 평형 버퍼를 남겨 두십시오.
    5. 원유 용해를 컬럼에 적재하고 일정한 교반으로 4 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오. 기둥을 똑바로 세워 놓고 아가로스가 퇴적될 수 있도록 합니다.
    6. 중력에 의해 원유 용해를 용해.
    7. 평형 버퍼 (헤파린 아가로즈의 부피의 4 배)로 컬럼을 씻습니다.
    8. 100 kDa 원심 단백질 필터를 컬럼 아래에 놓고 용출 완충제(헤파린 아가로즈의 부피의 3배)를 사용하여 바이러스를 필터에 용출합니다.
      참고: 용출 버퍼는 15mL를 초과해서는 안 됩니다.
    9. 3,000 x g에서 3000 x g의 원심분리기를~30분 간~1 mL 미만이 필터에 남게 한다.
    10. 필터에 1mL 미만이 남을 때까지 ~ 30 분 동안 3,000 x g에서 PBS 및 원심 분리기로 필터를 채웁니다. 이 단계를 2x 반복하여 모든 소금을 제거합니다.
    11. 3,000 x g의 원심분리에 의해 필터에 바이러스 용액을 집중시켜 가능한 한 작은 부피(200 μL 미만)에 도달한다.
    12. 바늘과 주사기로 바이러스 용액을 흡인하고 0.22 μm 필터를 통해 용액을 튜브에 밀어 넣습니다.
    13. 저장을 위해 농축 된 바이러스 입자의 aliquots를 확인하십시오.
      참고: aliquots는 -80°C에서 장기 보관을 위해 4°C에서 단기 보관의 경우 ~20 μL이어야 하며~ 5μL이어야 합니다.
    14. 앞서14, 18,19,20에기재된 바와 같이 바이러스 역가 및 바이러스 성 환전효율을결정한다.

3. 1 차 세포의 격리 및 배양

  1. 1일차
    1. 6주령 남성 또는 여성 B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*, -EGFP)에의한CO2 질식 또는 기타 IACUC 승인 프로토콜을 안락사시한다.
      참고: 이러한 CRISPR/Cas9 노크인 마우스는 CAG 프로모터에 의해 지시된 cas9 엔도너첼리스 및 EGFP의 Cre 재조합 의존적 발현을 가지고 있다. 이들 마우스의 게놈에 존재하는 상류 록스-스톱-록스(LSL) 서열은 Cre 재조합이 없는 상태에서 Cas9 및 EGFP의 발현을 방지한다. 단일 가이드 RNA(sgRNAs) 및 Cre 소스와 조합하여 사용될 때, 이들은 생체 내 또는 생체내 또는 생체내14에서단일 또는 다중 마우스 유전자의 편집을 허용한다.
    2. 외과 용 가위를 사용하여 안락사 된 마우스에서 혀를 해부하십시오.
    3. 메스를 사용하여 혀 조직을 매우 작은 조각으로 잘라서 수동으로 조직을 해리시다. 4.5ml의 RPMI 일반 배지(아웃 세럼 포함)를 함유하는 15 mL 튜브에서 조직 단편을 수집한다.
    4. 삼중 효소 혼합물(200 μl)을 조직 단편에 첨가한다(레시피에 대한 표 1 참조).
    5. 37°C에서 30분 동안 조직-효소 혼합물을 배양하고 10분마다 튜브를 탭하여 조직의 효소 해리를 향상시킵니다.
    6. 효소 작용을 멈추기 위해 HBSS/PBS를 함유한 5% 태아 소 혈청(FBS)을 조직-효소 혼합물에 추가합니다.
    7. 상기 세포 현탁액을 멸균 된 70 μm 나일론 메쉬를 통해 필터링하여 분산 된 세포와 더 큰 조직 단편을 분리합니다.
    8. RT에서 HBSS/PBS에서 300 x g의 원심분리로 여과된 셀 현탁액을 5분 동안 세척합니다.
    9. 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단하고 (RPMI/DMEM에서 10% FBS) 뚜렷한 세포 식민지가 형성될 때까지 60 mm 배양 접시에서 자랍니다.
      1. 배양 세포 응집체는 세포 콜로니가 형성될 때까지 3 mL의 완전한 배지(RPMI/DMEM에서 10% FBS)를 함유하는 60 mm 배양 접시에서 필터 위에 유지된다.
    10. 배양의 1 주일 후에 섬유아세포 오염의 존재를 위해 1차 세포를 현미경으로 검사한다. 응집체 및 세포 현탁액으로부터 개발된 1차 세포를 섬유아세포를 제거하기 위해 37°C에서 0.25 트립신 0.02% EDTA 용액으로 치료한다.
      참고: 일반적으로 세포 응집체에서 1 차적인 배양은 단세포 현탁액에 비교된 더 많은 식민지를 일으킵니다. 이 식민지에서 세포는 AAV 납품을 가진 더 나은 감전 효율성을 제공합니다.

4. 1 차 세포의 AAV 전환

  1. 제 10일
    1. 종자 2 x 105 전체 매체의 2 mL에서 6 웰 플레이트에서 잘 당 5 기본 세포 (RPMI / DMEM에서 10 % FBS).
    2. 다음 날, 1012 바이러스 게놈 /mL (1010 트랜스듀싱 단위 / mL)로 세포를 변환하고 37 °C에서 48 시간 동안 바이러스 입자 함유 매체로 세포를 인큐베이션합니다.
    3. 바이러스 입자 함유 매체를 제거하고 완전한 매체로 AAV 형질전환 세포를 공급한다.
      참고: 전형을 받은 세포만 GFP를 발현하고 증식하기 시작합니다. 전이수술을 받지 않은 세포는 결국 2주 이내에 사망합니다.
    4. 배양 2주 후, 세포를 시화하여 유효성 검사 및 생체내 종양발생 실험을 하였다.
      참고: Cas9 마우스로부터의 AAV 형화 세포 및 정상 원발성 세포로부터의 게놈 DNA는 표준 프로토콜을 사용하여 특정 게놈 편집을 검증하기 위해 추출되었습니다. 추출된 DNA의 시퀀싱 및 서열화 된 데이터의 분석(표 2)혼성화 캡처 기반 차세대 시퀀싱 분석 (예를 들어, MSK-IMPACT 플랫폼)을 상술한 바와 같이수행하였다.

5. 면역 형광 및 서쪽 얼룩을 사용하여 종양 성 세포로 정상 세포의 변환을 검증

  1. 면역 형광
    1. 종자 2 x 105 세포를 12 mm 유리 커버립에 놓고 밤새 인큐베이터에 놓습니다.
    2. PBS (pH = 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 세포를 수정하고 면역 형광 라벨링 공정을 합니다.
    3. 1% BSA 또는 PBST에서 1% 혈청으로 고정 된 세포를 가습 챔버에서 RT에서 1 시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 사용되는 1차 항체는 토끼 단클론 항-KRT 14, 토끼 단클론 항-E-카데린 항체, 및 Cas9 마우스 mAb이다.
    4. 1x PBS로 5분 동안 세포를 3x 세척하여 커버립에서 1차 항체 용액을 제거합니다.
    5. Cy3 당나귀 항 토끼 IgG 및/또는 Cy3 염소 반대로 마우스 IgG 이차 항체를 PBST에서 5% BSA에서 1 시간 동안 암흑에서 RT로 세포를 배양합니다.
    6. 커버립으로부터 이차 항체 용액을 제거하고 5.1.4단계에서 설명한 바와 같이 세포를 3x 세척한다.
    7. DAPI(DAPI 플루오로마운트)를 함유한 마운팅 매미를 떨어뜨리면 커버슬립을 장착합니다.
    8. 슬라이드가 형광 현미경 검사법을 사용하여 이미지 될 때까지 4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.
  2. 웨스턴 블로팅
    1. 종자 1 x 106을 100 mm 배양 접시에 형질 전환시킨 세포를 밤새 인큐베이터에 놓는다.
    2. 변형된 세포를 200 μl 의 얼음 차가운 PBS로 세척하고 긁어냅니다.
    3. 세포 현탁액을 4°C에서 2,000 x g에서 10분 동안 함유하는 튜브를 펠렛 세포에 담는다.
    4. 용해 완충제(표 1참조)를 사용하여 세포를 용해시키고 용해 억제제 칵테일 및 프로테아제 억제제가 4°C에서 10분 동안 함유한다. 원심분리기는 10,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 용해시키고 제거된 용해액을 수집한다.
    5. 시판되는 브래드포드 분석 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정합니다. 4x 샘플 버퍼 (500 mM Tris pH = 6.8, 40 % 글리세롤, 8 % SDS, 20 % H2O, 0.02 % 브로모페놀 블루)를 사용하여 단백질 샘플을 0.5 또는 1 μg / μL로 조정하십시오.
      참고: 시료는 -80°C또는 웨스턴 블롯 분석이 수행될 때까지 보관할 수 있습니다.
    6. 총 용해액 (30 μg)을 10 % 나트륨 도데실 황산염 - 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 분리하십시오. 염료가 젤의 바닥에 닿도록 하십시오. 단백질을 30분 동안 25V에서 반건조 블로팅하여 나일론 멤브레인으로 옮긴다.
    7. 트리스 완충 식염수 (TBS)-0.1 % 트웬 (TBST)에 5 % BSA를 부어 완전히 덮습니다. RT에서 1 시간 동안 멤브레인을 1 시간 동안 차단하십시오. 1 차 항체 (항 Cre, 항 Cas9, 항 GFP, 항 β 카테닌, 항 p53, 항 인포스포 ERK 및 5 % BSA TBST에서 희석 된 항 β 액틴)를 밤새 4 °C에서 배양합니다.
    8. 배양 후, 1x TBST로 멤브레인을 10 분 동안 씻어 용액이 멤브레인을 완전히 덮는지 확인하십시오. 이 세척을 3배 수행한 다음 고추냉이 과산화제(HRP)-공액이 있는 이차 항체(5% BSA TBST에서 희석된 1:10,000)를 멤브레인에 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    9. 배양 후, 1x TBST로 멤브레인을 10 분 동안 씻어 용액이 멤브레인을 완전히 덮는지 확인하십시오. 케밀 발광 이미징을 수행하여(재료 표참조) 밴드를 노출하고 그에 따라 이미지를 캡처합니다.
  3. 면역 적격 마우스에서 형질전환 된 세포의 종양 성 잠재력 검증
    참고: 마우스는 네게브의 벤 구리온 대학의 제도적 지침에 따라 유지 및 처리되었다. 끄 덕. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) 및 C57BL/6 마우스를 생체 내 연구에 사용하였다. 마우스는 12시간 의 빛/암흑 주기를 가진 공기 여과된 층류 캐비닛에 보관되었고, 음식과 물 광고 리비텀을 공급하였다.
    1. 6-8주된 여성 NOD를 사용하십시오. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) 및 연구를 위한 C57BL/6 마우스.
    2. AAV-Cas9 형질전환 세포를 트립시니화. 37°C에서 미리 온DMEM을 사용하여 트립시니화를 중지하고 50 mL 튜브로 수집합니다.
    3. 실온에서 10 분 동안 800 x g의 튜브를 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 FBS없이 DMEM 배지에 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리를 다시 수행하고 1x PBS에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
      참고: 셀을 너무 오래 1x PBS에 두지 마십시오. 항상 세포 응집을 방지하기 위해 얼음에 세포 현탁액을 유지.
    4. 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 1x PBS를 사용하여 원하는 농도 (2.5 x 107 셀 / mL)로 세포를 희석하십시오. 각 NOD의 오른쪽 측면에 있는 AAV-Cas9 형질전환 세포 현탁액의 피하 주사를 통해 종양을 생성한다. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) 마우스(2 x 106 셀/마우스). 합성 마우스에서 직교 모델을 생성하려면 0.5 × 106 기본 세포 또는 AAV-Cas9 변형 세포를 C57BL/6 면역 적격 마우스의 혀로 주입하십시오.
    5. 동물에게CO2 질식에 의한 주입 후 2주 후 안락사시키고, 면역성 화학 분석을 위해 안락사된 마우스로부터 종양을 해부한다.

결과

AAV 시스템을 사용하여 일반 Cas9 셀 변환
도 1은 본 연구에서 사용된 AAV 이식유전자 플라스미드의 상세한 벡터 맵을 제공한다. 그림 2는 AAV-Cas9 기반 시스템의 설계 및 작동을 간략하게 설명합니다. 바이러스 성 입자를 생성하기 위해, HEK293T 세포는 PEI 형질감염 방법을 사용하여 AAV 이식 유전자 벡터 및 기타 바이러스 성 패키징 벡터로 형질감염되었다. 형질전환 후, 바이러스 함유 세포를 수집하고 용해시키고, 헤파린 아가로즈 정제 공정을 사용하여, 바이러스 입자를 정제하고 농축시켰다(도2A). 이러한 정제된 바이러스 입자는 효능을 확인하기 위해 Cas9 마우스로부터 분리된 1차 세포의 시험관내 형형파를 사용하였다. 우리 시스템에서, AAV 이식 유전자 발현 카세트는 유비쿼터스 CAG 프로모터(pCAG), LoxP-Stop-LoxP 카세트(LSL), Cas9 뉴클레아제 유전자, 자가 클리빙 P2A 펩티드 및 리포터 유전자(EGF) 2개(EG)를 운반하는 마우스 세포 내의Cre 의존적 Cas9 Rosa26 표적화 템플릿으로 상동 재조합을 통해 도입됩니다. 형질전환된 세포의 Cre 재조합 활성은 LSL을 절제하고 Cas9 및 GFP 발현을 유도한다(도2B). Cas9 뉴클레아제 활성은 gRNA를 통해 지시되는 관심 있는 표적 부위에서 이중 가닥 의 휴식을 도입하고 유전자 편집에 도움을 줍니다. 이 연구에 사용된 AAV 시스템은 다중GAS(KRAS, p53 및 APC를 위한 sgRNAs)를 전달하고 또한 형질전환 된 세포에서 상동성 지향 수리 (HDR)를 통해 내인성 KRASG12D 알레일을 표현하는 데 도움이됩니다.

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도 1: 본 연구에서 사용된 AAV 이식유전자 플라스미드의 벡터 맵. 이 AAV 시스템은 CRE 재조합과 KRAS, p53 및 APC를 대상으로 하는 3개의 U6 구동 sgRNAs를 표현하는 AAV 백본을 가지고 있습니다. 또한 KRAS G12D 상동성 지향 수리 (HDR) 기증자가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 일반 세포를 변형시키는 AAV-Cas9 시스템의 설계 및 작동. (A)AAV 이식유전자 및 패키징 플라스미드로 이를 분사한 후 HEK293T에서 AAV 입자의 생산 및 정제의 개요. (b)AAV 입자를 가진 1 차 세포의 바이러스성 transduction 및 Cre 의존적인 Cas9 발현이 CRISPR 편집 및 종양성 세포로의 1 차 세포의 변환을 가능하게 하는 기계장치. CRE 재조합 증분 카세트를 가진 HDR을 통해 KRAS G12D 대문자의 녹킨을 가진 3개의 상이한 유전자에 대한 gRNA를 통합하는 단일 AAV 벡터가 Cre 의존적 Cas9 마우스 1차 세포내로 전달되었다. 형질전환된 세포에서의 Cre 재조합 활성은 LoxP-Stop-LoxP 카세트의 절제에 이르게 하고 Cas9 및 GFP 발현을 유도한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분리된 마우스 배아 섬유아세포 내 AAV-Cas9 시스템의 검증
원발성 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포는 세포 성장 및 증식에서 유전자 절제의 결과를 연구하기 위해 독점적으로 사용되어 왔다22. 정상 세포를 변형시키는 AAV-Cas9 시스템의 효율성을 검증하기 위해, 우리는 AAV를 사용하여 Cas9 마우스 배아 (E14)에서 분리 된 MEF 세포를 변환했습니다. MEF 세포는 앞서23,24에기재된 바와 같이 단리되었다. 14일된 Cas9 마우스 배아로부터의 MEF는 시험관 내에서 배양및 트랜스듀싱이 용이하기 때문에 사용되었다. 간단히 말해서, AAV 변환을 통해 MEF를 변환하기 위해 약 30% 합류에서 1차 MEF는 트랜스덕션에 대한 준비가 된 것으로 간주되었다. 변환 1시간 전에 MEF 문화 매체가 변경되었습니다. 정제된 AAV는 얼음 위에 해동되었고 MEF 배양 배지는 흡기되었다. 10 6-1014 바이러스게놈/mL에서 변화하는 적시로 바이러스 상상체를 각각 웰에 첨가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 바이러스성 상층체는 48시간 후에 제거하였고, MEF 배양 배지의 2 mL로 대체한 다음, GFP 발현까지 37°C에서 배양한 후, 약 5일 후에 환전후. GFP 표현 MEF는 서브 컬처링 및 검증되었습니다. 이 벡터에 대 한 우리는 발견 1012 바이러스 게놈/mL (에 해당 1010 변환 단위/mL) 효율적으로 종양 성 MEF에 기본 MEF 세포를 변환할 수 있습니다(그림 3A). 형질전환된 세포는 Cre, Cas9 및 GFP를 발현하였다(도3B,C). AAV 형질전환 MEF 세포의 종양전위전에 접근하기 위해, 0.5 x 10 6세포(1차/AAV-트랜스듀싱MEF)를 NOD-SCID 마우스에서 혀, 입술 및 피하로 주입하였다. 형질전환된 세포는 종양을 형성하지 않은 원발성 MEF와 비교하여 이들 마우스에서 종양을 형성하였다(도3D-F).

figure-results-3
도 3: AAV-Cas9 시스템을 이용한 1차 MEF 세포의 검증 및 시험관내 형형변환. (a)AAV 입자를 사용하여 Cas9 마우스로부터 채취한 배아로부터 섬유아세포의 체외형형형의 윤곽. (B)GFP, Cre 및 Cas9의 발현을 나타내는 1차 MEF 및 AAV-트랜스듀싱 MEF 세포의 대표적인 면역형광 이미지. DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었다. (C)배아 정상 섬유아세포 및 유전자 편집섬유아세포에서 Cre, Cas9, GFP 및 β-액틴을 나타내는 서양 블롯팅. (D)형질전환된 섬유아세포로 주사한 후 NOD-SCID 마우스에서 개발된 혀 종양의 대표적인 이미지. (E)형질전환된 섬유아세포로 주입한 후 NOD-SCID 마우스에서 형성된 립종양의 대표적인 이미지. (F)형질전환된 섬유아세포로 주입한 후 NOD-SCID 마우스에서 개발된 측면 종양의 대표적인 이미지. 화살표는 종양을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AAV-Cas9 시스템을 사용하여 1차 혀 상피 세포로부터 종양성 뮤린 혀 상피 세포라인의 체외 생성
MEF 세포를 사용하여 AAV 시스템의 형질전환 특성을 검증한 후, Cas9 마우스로부터 1차 혀 상피 세포를 분리하고 시험관내에서 배양하였다. 1 차적인 혀 세포는 AAV 바이러스성 입자 (1010 cfu/mL)로 변환되고, 1 주일 세포후에 GFP를 발현하기 시작했습니다. 1차 혀 상피세포의 종양성 형질전환(도4A)은면역형광 및 서양 블로팅(도4B,C)을이용하여 확인하였다. 형질전환된 세포는 향상된 KRT 14, E-카데린 및 GFP 발현을나타낸다(도 4B). 1차 혀 상피 세포의 종양성 형질전환은 GFP(즉, Cas9 및 GFP의 Cre-의존적 발현)의 발현에 의해확인되었다(도 4C). KRT14 및 E-카데린의 발현은 그들의 상피 세포 특성을 확인한다. 단백질 검증은 향상된 β-카테닌, 포스포-ERK 및 감소된 p53 발현(그림4C)을확인하였으며, 이는 APC 및 p53의 효과적인 하향 조절 및 돌연변이 KRAS를 혀 세포내로 의혼을 나타내는, 따라서 종양성으로 만들었다. 형질전환된 세포로부터 분리된 DNA의 깊은 시퀀싱에 의한 게놈 분석은 AAV-Cas9 시스템에 의한 TP53 및 APC 유전자의 효과적인 유전자 편집 및 프레임 시프트를 확인하였다(표2). AAV 형질전환혀세포의 종양성 성질은 면역적격 야생형 C57BL/6 마우스의 혀에 주입함으로써 추가로 평가되었다. 형질전환된 혀 세포는, 혀의 KRAS 돌연변이 상피 세포로 지정 (KRAS Mut EpT), C57BL/6 마우스에서 효율적으로 종양을 형성한다(그림4D). KRAS Mut EpT 종양은 일상적인 헤마톡신 및 에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학에 의해 경구 및 악안면 병리학자에 의해 평가되었다. 종양은 눈에 띄는 핵 atypia를 가진 스핀들 세포 형태를 전시했습니다: 흉막증, hyperchromatism, 거대한 핵, 몇몇 핵톨리, 및 비정형 유사분열 수치를 가진 높은 유사분열 비율. 혈관 내 침략과 혈관 침범도 주목되었다. 이러한 형태학적 특징은 존재하지 않는 종양 관련 염증에 매우 제한되었다. 면역조직화학적으로, 신생물 세포는 E-카데린 및 KRT 14, 상피 조직의 두 마커 모두에 대해 세포학적으로 양성이었다. KRT 14는 편평상피의 전형적이며, 종양 세포의 편평상피 기원을 지원하여 편평상피종의 진단을 뒷받침한다(도4E). 그러므로, 이 접근은 원하는 유전자 변경을 가진 시험관내 1 차적인 세포를 변환을 위한 다재다능한 방법론을 제공합니다. 또한, 이 방법론은 실제 종양 미세 환경 milieu에서 신생물의 더 나은 이해를 위해 합성 마우스에서 생체 내에서 이러한 개발된 세포주의 사용을 용이하게 한다.

figure-results-4
도 4: AAV-Cas9 시스템을 사용하여 1차 혀 상피 세포의 시험관 내 형질전환. (a)Cas9 마우스의 혀로부터 수득된 정상 상피 세포의 시험관내 형질전환의 개략적 표현. (B)KRT14, E-카데린 및 GFP의 발현을 나타내는 AAV-형질전환 혀 상피 세포의 대표적인 면역형광 이미지. (C)Cas9, β-카테닌 및 인광-ERK 업조절을 나타내는 서양 얼룩은 p53 단백질 수준 하향 조절, 유전자 편집상피세포를 나타낸 다. (D)면역적격 마우스의 혀에서 발달한 종양의 대표적인 이미지는 형질전환된 혀 상피 세포(KRAS Mut EpT)로 주입한 후이다. (E)H&E, E-카데린 및 KRT 14염색을 위한 종양 조직 섹션의 대표적인 이미지는 20배 및 40배 배율로 염색된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이러스 수확을 위한 세포 용해 완충제볼륨
150 mM 나클876.6mg
50 mM 트리스-HCl605.7mg
HCl을 사용하여 pH 8.5 조정
분자 등급의 물최대 100mL
평형 버퍼
1 mM MgCl2 9.52 mg
2.5 mM KCl18.64 mg
PBS 1X에서 모두 혼합하고 pH를 7.2로 조정합니다.최대 100mL
용출 버퍼
0.5 M 나클2.92g
PBS 1X에서 모두 혼합하고 pH를 7.2로 조정합니다.최대 100mL
10X 트리플 효소 스톡 솔루션:
콜라게나아제최종 1 g [10 mg/ml]
히알루로니다제100 mg [1 mg/ml]
드나세 (주)20,000 단위 최종 conc. [200 mg/ml]
PBS 1X최대 100mL
플라스미드 믹스(14.5cm 플레이트 1개용)
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR10μg
AAV 2/9 캡시드 벡터10μg
pAD 델타 F5 도우미10μg
PEI (1μg/ μl 스톡)90μl
DMEM1 mL

표 1: 이 연구에 사용된 버퍼 의 조리법입니다.

표 2: 크라스 뮤트 EpT 세포의 게놈 분석 데이터. 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).

토론

여러 가지 방법은 이전에 성공25,26,27,28의가변 학위를 가진 배양에서 1 차 세포를 형질전환하는 데 사용되어 왔다. 이들 방법의 대부분은 마우스 섬유아세포변형14,17,18,19 또는 4-니트로퀴놀린-1-산화물(4-NQO)21,22와 같은 발암물질을 사용하여 뮤린 세포주 모델을 개발한다. 녹아웃 및 형질전환 마우스 모델의 사용은 또한 HNC의 발달과 분화를 지배하는 다양한 분자 경로에 대한 우리의 이해를 크게 향상시켰습니다. 독특한 유전 패턴을 가진 뮤린 경구 상피 세포주를 사용하면 이러한 연구를 확실히 보완할 수 있으며, 이후의 생화학 적 분석술은 HNC의 치료 및 진단에 기여할 것입니다. 그러나, 단지 몇몇 보고만이 마우스 경상피세포28,29,30,31,32, 33 및 이들 세포주의 확립을 광범위하게 사용하지 않고 있다.

이 뮤린 경구 상피 세포주의 주요 한계는 분자 수준에서 광범위하게 특성화되지 않고 드문 유전자 패턴을 발현하는 것으로 나타났다는 것입니다. 따라서, 이러한 뮤린 세포주 모델의 제한된 분자 이해와 효율적인 방법론의 부족으로 인해 뮤린 세포주를 확립하기 위한 Cas9 노크인 마우스에서 AAV-CRISPR 게놈 편집 기술의 고유한 잠재력을 활용하게 되었습니다. 특정 유전자 변경. 이 연구에서는, 우리는 암종 세포를 초래하는 유전 변경을 확인하기 위하여 1 차적인 뮤린 세포를 종양성 국가로 변환하기 위한 시험관 내 AAV-Cas9 시스템을 소개하고 개발했습니다. 우리는 성공적으로 몇몇 sgRNA 조합에 의하여 AAV 중재한 CRISPR 유도한 체세포 유전자 편집을 사용하여 고효율을 가진 특정 유전자 돌연변이를 가진 뮤린 혀 상피 세포를 설치했습니다.

이 방법론은 HNC의 세포 자율 병인을 더 잘 이해하기 위한 새로운 실험 접근법을 제공합니다. 뮤린 원발성 혀 상피 세포로 시작하여, 우리는 제한된 유전자 세트를 삭제하고 단일 KRAS 돌연변이를 도입하여 종양 발생으로 이러한 세포를 변형시킬 수 있었습니다. 이 방법론을 사용하여, 그밖 암종에서 연루되는 것으로 알려진 그밖 유전자가 HNC를 더 밀접하게 닮은 악성종양을 생성할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 지금 가능합니다. KRAS Mut EpT로부터의 종양의 형태학적 특성은 편평상피세포 암종을 확인하였다. 합성 마우스에서 KRAS Mut EpT 종양의 조직 병리학 분석은 두경부 암종의 공격적인 생물학적 행동과 연관되고 지지된다. 따라서, 암세포의 유전자형을 종양의 특정 임상 및 조직병리학적 특징에 연결하는 것이 가능할 수 있다.

이 방법론의 주요 장점은 특정 유전자 돌연변이를 사용하여 모든 장기의 1 차 세포에서 세포주를 개발하고 시스템을 보다 견고하고 안정적으로 만드는 AAV-Cas9의 사용입니다. 내 인성 Cas9 시스템은 다른 유전자 녹아웃을 활용할 수 있게 합니다. 현재 방법론의 주요 단점은 1 차 적인 세포를 변환 하는 데 필요한 바이러스 입자의 높은 역가 뿐만 아니라 1 차 배양을 분리 하 고 확립 하는 데 필요한 시간. 그러나, 이것은 각 세포 모형을 위한 격리 프로세스를 표준화해서 극복될 수 있었습니다. 효율적인 트랜스덕션을 위해 높은 AAV 바이러스 성기를 요구하는 문제는 바이러스 포장 및 더 나은 정제 공정을 위한 최신 세대의 캡시드 및 도우미 플라스미드를 사용하여 완화될 수 있습니다.

미래에, 더 좋고 더 능률적인 AAV 시스템은 기관 특정 유전자 변형 종양 모형을 만들기 위하여 생체 내에서 설계되고 추정될 수 있었습니다. 결론적으로, 이 접근법에 의한 뮤린 세포주를 확립하는 것은 종양학의 맥락에서 여러 가설을 시험하기 위한 시험관내 세포 배양 기반의 귀중한 도구로 작용할 것이다.

공개 사항

M.S.는 생명과학 연구소의 자문위원회에 있으며, 메나리니 리체는 푸마 생명공학, 다이치 산키오, 타르그면역, 면역메딕스, 메나리니 리세체로부터 연구자금을 받았습니다. M.S.는 또한 메벤디 메디컬 트래블의 공동 창립자이며, 지난 2년 동안 메나리니 리에르체와 ADC 제약으로부터 명예를 얻었습니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 포드 델타 5 도우미 플라스미드를 제공 해 주신 다니엘 Gitler 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF)에 의해 지원되었다, 700/16) (ME), 미국-이스라엘 양국 과학 재단 (BSF, 2017323) (ME 및 MS), 이스라엘 암 협회 (ICA, 20170024) (ME), 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), 그리고 우려 재단 (#7895 me). 펠로우십: 저와 BGU 크릿만과 SJ 및 MP에 대한 알론 펠로우십.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure 염소 안티 마우스 IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
토끼 단클론 항-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β 카테닌세포 신호 기술9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
배양 매체, 화학 물질 및 시약
Bradford 시약Bio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI 플루오로마운트Southern Biotech0100-20
DMEM생물학 산업 이스라엘 Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova 및 Westar Nova 2.0)시아 아나겐XLS3.0100 및 XLS071.0250
FBS생물 산업 이스라엘 Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSS시그마H6648
헤파린 - 아가로 스시그마H6508
분리 II 게놈 DNA 키트BiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries 이스라엘 Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
펜 연쇄상구균 솔루션생물학 산업 이스라엘 Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFA산타 크루즈 생명 공학30525-89-4
인산가수분해효소 억제제 칵테일BiotoolB15001A/B
프로테아제 억제제 칵테일MilliporeSigmaP2714-1BTL
트리스 완충제MERCK Millipore648311-1KG
strong>효소
벤조나아제시그마E1014
콜라겐분해효소 IV써모 피셔 사이언티픽17104019
DNAse써모 피셔 사이언티픽18047019
히알루로니다아제밀리포어시그마H3506
트립신생물학 산업 이스라엘 Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
<강한>유리 제품
커버 슬립바 나오르BNCB00130RA1
슬라이드바 나오르BN9308C
<강한>마우스 균주
C57BL/6엔비고
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
끄덕임. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITRandall J Platt 박사와 Joseph Rosenbluh 박사, MIT 및 Harvard의 Broad Institute of MIT 및 Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 캡시드 벡터Addgene112865
pAD Delta F5 도우미Ben Gurion University of the NegevDaniel Gitler 박사, 보건 과학 학부 생리학 및 세포 생물학과 및 Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA 필터 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µ m 멸균 필터, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µ m 멸균 필터, 13mmMillexSLHV013SL
Culture 플레이트Greiner Bio-One
Falcon 튜브Greiner Bio-One
< 제공 , ,

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