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방법 논문

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

10.5K 조회수

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DOI:

10.3791/60440

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2019년 11월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

이 논문에서

요약

이 작품은 1 차적인 oculomotor, trochlear 및 척추 운동 뉴런의 동종 세포 배양을 산출하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 배양은 안구 및 척추 운동 뉴런의 형태학적, 세포적, 분자 적 및 전기 생리학적 특성의 비교 분석에 사용될 수 있다.

초록

Oculomotor 뉴런 (CN3s) 및 trochlear 뉴런 (CN4s) 척추 모터 뉴런에 비해 근위축성 측삭 경화증 (ALS)와 같은 퇴행성 운동 뉴런 질환에 현저한 저항을 나타낸다 (SMNs). 기본 마우스 CN3, CN4 및 SM을 격리하고 배양하는 기능은 이 선택적 취약점의 기반이 되는 메커니즘을 연구하는 방법을 제공합니다. 현재까지 대부분의 프로토콜은 이기종 세포 배양을 사용하므로 실험 결과의 해석을 혼동할 수 있습니다. 혼합 세포 집단과 관련된 문제를 최소화하기 위해 순수한 배양이 필수적입니다. 여기서, 제1 프로토콜은 배아일 11.5(E11.5) IslMN:GFP 형질전환 마우스 배아를 사용하여 동일한 배아로부터 의SMN 대응체와 함께 CN3s/CN4를 효율적으로 정화하고 배양하는 방법을 자세히 설명한다. 이 프로토콜은 CN3/CN4 및 SMN 핵으로부터의 조직 해부 및 해리, FACS 기반 세포 분리, 시험관내 배작에 대한 세부 정보를 제공한다. 이 프로토콜은 기존 프로토콜에 새로운 체외 CN3/CN4 배양 시스템을 추가하고 동시에 비교를 위해 순수한 종 및 연령 일치 SMN 배양을 제공한다. 운동 뉴런의 형태학, 세포, 분자 및 전기 생리학적 특성에 초점을 맞춘 분석은 이 문화 시스템에서 가능합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 발달, 선택적 취약성 및 질병을 정의하는 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다.

서론

1 차적인 운동 신경의 문화는 외인성 스트레스 요인에 신경 발달, 기능 및 감수성의 연구를 가능하게 하는 강력한 공구입니다. 운동 신경 배양은 근위축성 측삭 경화증(ALS)1,2,그의 질병 기전이 불완전하게 이해되는 것과 같은 신경 퇴행성 질환의 연구에 특히 유용하다. 흥미롭게도, ALS 환자와 ALS 모델 마우스 모두에서 척추 운동 뉴런(SMN)의 유의한 세포 사멸에도 불구하고, 오큘러 뉴런(CN3s) 및트로클레어 뉴런(CN4s)에서의 세포 사멸은 상대적으로1,3,4,5,6,7,8,9. 따라서 CN3s/CN4및 SM의 순수 문화어를 비교분석하면 상대적 취약점의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 불행 하 게도, 이러한 분석에 주요 장벽은 이러한 모터 뉴런의 정제 된 문화를 성장 하는 무 능력.

많은 프로토콜은 동물 모델에서 SMN의 정제를 위해 기술되었다. 이러한 프로토콜의 대부분은 밀도 구배 원심 분리10,11,12 및 / 또는 p75NTR-항체 기반 세포 정렬 패닝 기술13,14,15,16을사용합니다. 밀도 구배 원심분리는 다른 척수 세포에 비해 SM의 더 큰 크기를 이용하는 반면, p75NTR은 척수에 있는 SMS에 의해 독점적으로 표현되는 세포외 단백질입니다. 거의 100% 순수 SMN 문화는 이들 프로토콜 들 중 하나 또는 둘 다에 의해 생성되었다11,12,14. 그러나 CN3s/CN4s가 p75NTR을표현하지 않고 다른 특정 CN3/CN4 마커가 확인되지 않았기 때문에 이러한 프로토콜은 CN3/CN4 문화를 생성하는 데 성공하지 못했습니다. 또한 SM보다 작기 때문에 크기에 따라 격리하기가 더 어렵습니다. 대신, CN3s 또는 CN4s의 시험관 내 연구는 해리17,18,19,20,21,17,22, 23,24,25, 슬라이스27,28 배양에 의존했으며, 이질적인 세포 유형으로 구성되며 프로토콜이 존재하지 않았습니다. 기본 CN3 또는 CN4의 격리 및 문화.

여기서, 프로토콜은 동일한 배아일11.5(E11.5) IslMN으로부터 CN3s, CN4s 및 SM의 시각화, 절연, 정제 및 배율에 대해 기재되어 있다:GFP 형질전환 마우스29(도 1, 도 2A). IslMN:GFP는 특히 세포막에 국소화되는 원거리 GFP로 운동 뉴런을 라벨을 지정합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 질환의 병리학 적 메커니즘을 밝히기 위해 여러 유형의 운동 뉴런을 종과 연령일치로 비교할 수 있게 합니다.

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프로토콜

실험실 동물을 이용한 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 해부 전에 시간 지정 짝짓기 설정

  1. 운동 뉴런 수확을 위한 태아 배아 마우스를 생성하기 위해, 각 암컷 마우스의 무게를 측정하고 성인 IslMN:GFP 형질전환 마우스 사이의 시간 적 결합을 설정11.5 뉴런 격리의 날 전에 일. 이 프로토콜을 개발하기 위한 목적으로, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP 마우스, 숙성 된 2-9 개월, 사용 하 고 시간 매팅 저녁에 설정 되었다.
  2. 다음 날 아침 질 플러그에 대한 여성 마우스를 검사합니다. 플러그가 배아일(E) 0.5로 확인된 날짜를 고려합니다.
  3. 암컷 마우스의 무게를 측정하고 E8.5−11 사이의 초음파(재료 표참조)를 사용하여 새끼를 검사합니다. 성공적인 짝짓기의 징후를 확인합니다.
    1. 암컷 마우스에서 체중 증가를 검출하여 성공적인 짝짓기(일반적으로 5-6배아가 있는 경우 E9.5에서 1.5g)를 확인합니다.
    2. 초음파 하에 배아를 시각적으로 확인하십시오. 배아는 E9.5 후에 초음파에 의해 쉽게 검출될 수 있습니다. 초음파는 그렇지 않은 여성보다 임신이 더 많기 때문에 체중이 증가한 여성에게만 수행됩니다.
      참고: 암컷 마우스는 임신 이외의 이유로 체중을 증가시킬 수 있으므로 체중 증가만으로는 임신의 신뢰할 수 있는 지표가 아닙니다. 초음파 확인은 임신하지 는 않지만 사용할 수없는 경우 중요하지 않은 여성의 불필요한 희생을 방지합니다.

2. 절제 조건 및 악기 준비

  1. 모든 코팅 (커버슬립의 산 세정 제외), 배지 준비, 조직 해리 (원심 분리 및 배양 제외), 및 배양 작업은 배지 및 배아 운동 뉴런의 멸균을 보장하기 위해 층류 후드에서 작동합니다.
  2. 멸균 기술에주의를 기울여 오염 위험을 최소화하면서 층류 후드 외부에서 조직 해부를 수행하십시오.
  3. 사용하기 전에 70% 에탄올에 담그어 해부 판 1개, 미세 제해 가위 1쌍, 엄지 손가락 드레싱 집게 1쌍, 두몽 #5 핀셋 2쌍, 미세 제해식 나이프 1개, 모리아 미니 천공 숟가락 1개를 살균합니다.

3. 요리 / 커버 슬립의 PDL / 라미닌 코팅

참고: 배양은 적용에 필요한 세포의 수에 따라 96웰 또는 24웰 플레이트에서 1차 운동 뉴런을 해리하였다. 웰은 광학적으로 투명하고 두께가 이미징과 호환되는 경우 커버슬립을 사용하지 않고 조직 배양 판에서 직접 이미지를 촬영할 수 있습니다.

  1. 커버립이 필요한 어플리케이션의 경우, 앞서 설명한바와같이 뉴런 격리 최소 2일 전에 산세척, 살균 및 공기 건조 커버슬립을 준비한다. 커버립의 배치는 실험전에 잘 이러한 방식으로 제조 될 수 있으며 실험 품질에 영향을주지 않고 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
  2. 뉴런 격리 2일 전에 인산완충식염수(PBS)에서 20 μg/mL 폴리 D-리신(PDL)의 작동 용액을 준비한다.
    1. Aliquot PDL (1 mg / mL)을 미리 보관하고 재고 용액으로 -20 °C에 보관하십시오.
  3. 충분한 PDL 용액 작업 용액으로 각 커버 슬립 또는 조직 배양 판의 표면을 덮습니다 (예 : 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL 또는 커버립이 있거나없는 24 웰 플레이트에 잘 당 500 μL). 37 °C에서 하룻밤 배양.
  4. 다음날 멸균된 물로 3x를 씻으소서.
    1. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 세척된 PDL 코팅 플레이트를 최종 세척 후 완전히 건조한 경우 최대 1개월 동안 4°C에서 보관합니다.
  5. PBS 1.2 mL에서 10 μL의 라미닌(1.1−1.2 mg/mL)으로 작업 용액을 준비합니다.
    1. 알리쿼트 라미닌 스톡(1.1-1.2 mg/mL)을 미리 보관하고 -80°C에 보관하십시오.
  6. 각 커버슬립의 표면을 커버하거나 표면을 고르게 코팅하기에 충분한 라미닌 용액으로 잘 덮습니다. 사용하기 전에 37°C에서 적어도 2시간 동안 배양하였다.
    참고: PDL/라미닌 코팅 플레이트 및 커버슬립은 37°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있지만, 갓 코팅된 라미닌이 바람직하다. 도금30하기전에 직접 라미닌을 제거하십시오. 라미닌은 건조할 수 없습니다. 접시를 몇 시간 이상 보관해야하는 경우, 그들은 파라핀 필름에 싸여야한다.

4. 해부, 운동 신경 배양 배지 및 해리 솔루션의 준비

참고: 괄호 안에 있는 농도는 각 시약의 최종 농도를 나타냅니다.

  1. 해부를 준비합니다.
    1. 열불활성화 말 혈청을 4°C에서 밤새 해동하고, 1 mL aliquots를 준비하고, -20°C에서 보관한다. 사용하기 전에 RT에서 직접 알리쿼트를 해동하십시오.
    2. -20°C에서 1mL aliquots에 B27-보충제(50x)를 보관하십시오. 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 녹입니다. 동결/해동 주기를 피하십시오.
    3. 글루타민 보충제(100x)를 4°C 또는 -20°C에서 보관하십시오. -20 °C에서 저장하는 경우 0.5 mL aliquots로 나눕니다.
    4. 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)을 -20°C에서 1mL aliquots에 저장합니다. 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 녹입니다.
    5. 해부 매체를 만들기 위해, 최대 절전 E의 9.4 mL을 말 혈청 200 μL (2%), 50x B27 보충제 (1x), 100 μL 의 100 μL (예를 들어, 글루타맥스) 및 100 μL 의 10,000 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL). 해부 된 조직을 수집하고 해리 된 세포의 최종 현탁액을 만들기 위해이 매체를 사용하십시오.
    6. 뉴런 분리 전날 조직 수집을 위해 개별 1.7 mL 미세원심지 튜브에 해부 배지 의 500 μL을 추가합니다. 수집될 각 조직 유형(예를 들어, 양성 대조군, 음성 대조군, CN3/CN4, SMN)에 대해 하나의 튜브를 준비하고 사용 전에 4°C에서 저장한다.
    7. 최대 절전 모드 의 49 mL B27 보충의 1 mL (1 x)와 결합 하 고 이 매체와 함께 24 잘 접시를 채우기 (2 mL/well) 신경 격리 전날. 마우스 배아를 수집하기 위해이 접시를 사용합니다. 사용하기 전에 4°C에서 보관하십시오.
  2. 운동 뉴런 배양 배지를 준비한다.
    1. 라이보비츠의 L15 배지에 25mMM2-메르카포에탄올 250 μL aliquots를 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    2. 멸균된 물에 희석된 BDNF, CNTF 및 GDNF의 100 μg/mL 용액의 5 μL aliquots를 생성합니다. -80°C에서 보관하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동하십시오.
    3. 64 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 5 mg(1.0670 μM)에 추가하여 10 mM 의 산림용액을 완전히 용해시켰다. 그런 다음 멸균수(1.003 mL)를 DMSO 용액에 넣고 와류를 잘 추가합니다. -20°C에서 10 mM의 12 μL 알리쿼트를 저장하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동합니다.
    4. DMSO에서 희석된 100 mM isobutylmethylxanthine(IBMX)의 12 μL aliquots를 준비합니다. -20°C에서 보관하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동하십시오.
    5. 운동 신경 배양 배지를 만들기 위해, 말 혈청 200 μL (2%), 50x B27 보충제 (1x), 100 μL의 100 μL의 100 μL (1x)와 신경 기저 배지의 9.4 mL을 혼합하십시오. 100 μL 의 10,000 U/m: 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL), 20 μL 의 25 mM 2-메르카포에탄올 (50 μM), 바람직하게는 사용하기 전에. 이 단계는 뉴런 격리 1일 전에 수행될 수 있다.
    6. 사용 직전에 100 μg/mL BDNF(10 ng/mL), CNTF(10 ng/mL), GDNF(10 ng/mL) 및 GDNF(10 ng/mL) 및 10 μL의 10 μL(10 μM)을 각각 100 mMM IBMX(100 μM) 뉴런 배양에 추가합니다. 매체를 37°C로 미리 데우다.
  3. 해리 솔루션을 준비합니다.
    1. 파페인 용액(20 U/mL 파파인 및 0.005% DNase)과 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(1 mg/mL 오보뮤코이드 억제제, 1mg/mL 알부민 및 0.005% DNase)을 제조업체의 지시에 따라 준비합니다.
    2. 오보뮤코이드 억제제 및 파파인 용액각각의 500 μL aliquots를 준비하고 -80°C에 보관한다. 사용 직전에 37°C에서 알리쿼트해.

5. 복부 중뇌 및 척수 해부

참고: 형광 해부 입체 현미경으로 5.1.1-5.1.3 단계 및 5.1.5-5.1.6단계를 제외한 다음 단계를 모두 수행합니다. 실험당 총 해부 시간은 전형적으로 3-5 시간, 해부 기술의 숙련도 및 각 실험에 필요한 운동 뉴런의 수에 따라 다.

  1. 복부 중뇌 해부
    1. 임신한 마우스를 약 11.5일 후 이산화탄소 가스와 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시한다.
    2. 에탄올로 복부를 철저히 살포하고 멸균 미세 분축 가위와 엄지 손가락 드레싱 집게를 사용하여 자궁을 제거하십시오. 멸균 PBS에서 자궁을 잠시 씻은 다음 미리 냉각 된 멸균 PBS로 채워진 해부 판으로 옮김하십시오.
    3. IslMN:GFP-양성 배아를 무균 미세 분절 가위, 엄지 드레싱 집게 및 듀몬트 #5 핀셋을 현미경의 밝은 빛 아래 서냉 멸균 PBS에 사용하여 자궁에서 조심스럽게 제거하십시오. 멸균 된 모리아 미니 천포 숟가락을 사용하여, 1x B27로 보충 된 미리 냉각 된 최대 절전 모드 낮은 형광 매체로 채워진 24 웰 플레이트의 별도의 우물로 각 배아를 옮니다. 얼음에 24 웰 플레이트를 유지합니다.
    4. 한 개의 배아를 멸균 해부 플레이트에 옮기고 얼음으로 차가운 멸균 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 완전히 덮습니다.
    5. 해부 단계가 현미경의 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC) 조명 하에 수행되도록 합니다. 핀셋을 사용하여 중뇌를 손상시키지 않고 배아의 꼬리와 얼굴을 제거합니다(그림2Ba). 사지가 현미경의 앞쪽을 가리키는 사지와 꼬리가 있는 경향이 있는 배아를 디스섹터쪽으로 향합니다(별표, 그림 2Bb로표시).
    6. 핀셋을 사용하여 작은 개구부를 생성하기 위해 제 4 심실의 지붕을 슬릿. 이 개구부를 사용하여 핀셋을 네 번째 심실과 지붕 사이에 생성된 공간에 연결합니다. 배아의 등쪽 표면을 따라 해부하고 피질과 횡측을 바닥 판 및 모터 컬럼으로 해부한다(도2Ca,b). GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 밝히기 위해 오픈 북 방식으로 해부된 조직을 엽니다.
      참고: 중간엽, CN3 및 CN4를 포함하는 복부 중뇌에서 조직의 작은 조각은 지금 드러날 것입니다.
    7. 조심스럽게 배아에서 복부 중뇌를 분리하고 핀셋과 미세 제해 칼을 사용하여 수막 조직을 제거합니다. 핀셋 및 미세 제해 나이프를 사용하여 양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 바닥 판 및 기타 GFP 음성 주변 조직에서 해부합니다(그림2D). 절제 된 조직에서 GFP 양성 운동 뉴런의 수를 최대화 하지만 만지거나 손상 하지 마십시오.
    8. 별도의 CN3 및 CN4 핵의 집합이 요구되는 경우, 이들 두 핵의 중간선을 따라 절단한다(도2D에서노란색 점선). P1000 파이펫을 사용하여, 최소한의 HBSS로 해부된 복부 중뇌 조직을 수집하고 해부 매체로 채워진 표지된 1.7 mL 마이크로 원심 분리튜브에 놓습니다(단계 4.1.5 참조). 해리될 때까지 얼음에 보관하십시오.
    9. 총 수가 실험 요건을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아에서 복부 중뇌를 계속 풀링합니다(이상적인 세포 수의 경우 8단계를 참조하십시오).
      참고: 조직은 해리 및 선별 도중 스트레스를 받기 때문에 적어도 10x104 CN3/CN4 운동 뉴런을 산출하는 적어도 10개의 복부 중뇌의 풀링된 집합은 추천됩니다.
  2. 복부 척수 해부
    1. 머리가 현미경의 전면을 향하고, 분리쪽으로 배아를 유지하는 경향이 있습니다. 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 쌍의 핀셋 끝을 네 번째 심실의 미개봉 된 꼬리 부분에 삽입하십시오.
    2. 배아의 전체 rostrocaudal 범위에 걸쳐 뒷뇌와 척수의 나머지 부분을 등도로 엽니다. 등쪽 조직을 절단하여 열고, 제 4 심실에서 시작하여 집게를 가위로 사용하여 척추척수의 중앙 운하쪽으로 작용합니다(그림 2Ca,b). 이 시술 중에 복부 척수를 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
    3. 핀셋 한 쌍으로 배아를 잡고 핀셋의 다른 쌍으로 양쪽에 등쪽 조직의 플랩을 꼬집습니다(그림 2Ea,b).
      참고: 절제된 등지 조직에는 등지 피부, 중간엽, 등지 뿌리 중추 (DRGs), 등뒤뇌 및 척수가 포함되어 있습니다. SMN 핵을 손상시키지 않고 가능한 한 많은 조직을 제거하십시오.
    4. GFP 양성 SMN 바로 아래를 관통하는 미세 해부 나이프를 사용하여 복부 척수를 제거합니다. 양면에 톱과 같은 움직임으로 복부 척수를 들어 올립니다(그림 2Fa,b). 부동 복부 척수를 C1 바로 위를 가로로 자르고, 여기서 첫 번째 GFP 양성 전방 경적 프로젝트(그림 2G). 또한, 하지의 위쪽 경계에서 가로로잘라냅니다(그림 2G). 이 절차 후에 복부 척수의 자궁 경부 (C1)-요추 (L2-L3) 부분을 제거하십시오.
    5. 복부 척수 등쪽을 위로 올려 놓고 핀셋 한 쌍으로 GFP 양성 SMN 컬럼 사이에 GFP 음성 조직을 눌러 잡습니다. GFP 양성 SMN 컬럼의 양면을 미세 해부 나이프로 트리밍하여 나머지 부착 된 중간엽, DRG 및 등쪽 척수를 제거합니다(그림 2H). GFP 양성 운동 뉴런을 손상시키지 않고 최대화하도록 주의하십시오.
    6. P1000 파이펫을 사용하여 최소한의 HBSS로 해부된 척수 조직을 수집하고 해부 매체로 채워진 SMN 라벨 1.7 mL 미세 원심 분리튜브에 놓습니다. 해리될 때까지 얼음에 보관하십시오. 총 수가 실험 요건을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아에서 복부 척수를 계속 풀링합니다.
      참고: 조직은 해리 및 선별 중에 스트레스를 받기 때문에 약 2.1 x 104 SMN을 산출하는 적어도 3개의 복부 척수를 수집하는 것이 좋습니다.
    7. IslMN:GFP 마우스 배아의 안면 운동 뉴런과 사지를 각각 GFP 양성 및 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 대한 GFP 음성 대조군으로 수집한다. 사지는 SMN의 GFP 양성 축삭이 이 배아 나이에 사지로 아직 확장되지 않았기 때문에 GFP 음성입니다.

6. 조직 해리

참고: 총 해리 시간은 일반적으로 실험당 1.5시간입니다.

  1. 따뜻한 파파인 및 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액을 해리하기 30분 전에 37°C로 aliquots.
  2. 미세 해부 된 조직을 저속으로 간단히 회전시킵니다.
  3. P100 파이펫을 사용하여 조직을 흡입하지 않고 가능한 한 많은 최대 절전 모드 E를 조심스럽게 제거하십시오.
    참고: 다음 단계에서 파파인 해리의 효능을 감소하지 않도록이 단계 후 모든 잔류 최대 절전 모드 E를 제거해야합니다.
  4. 미세 해부 조직 샘플을 함유하는 1.7 mL 미세 원심 분리지 튜브 각각에 파파인 용액의 적당 부피를 첨가한다(표1).
    참고: 해리를 위한 파고통의 적절한 부피는 세포에 대한 스트레스를 최소화하면서 효과적인 해리를 최대화하기 위해 결정되었다.
  5. P200 파이펫으로 8x를 부드럽게 트리튜레이합니다. 모든 삼중 단계를 부드럽게 수행하여 운동 뉴런 생존 가능성을 보존합니다.
  6. 37°C에서 30분 동안 조직을 함유하는 튜브를 배양하고, 손가락으로 10분마다 10배씩 쓸어넘기고, 배양 후 P200 피펫으로 각 현탁액을 8x 부드럽게 삼각화한다. 300 x g에서 5 분 동안 세포를 회전시면 됩니다.
  7. 다음 단계에서 오로서무코이드 억제의 효능을 보장하려면 P1000 피펫을 사용하여 조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상상체를 제거하고 폐기하십시오.
  8. 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액의 적절한 부피에 펠릿을 다시 일시중단(표 1)P200 파이펫으로 8x를 부드럽게 삼각시켜.
  9. 2 분 동안 기다렸다가 비분리 된 조직의 나머지 조각이 튜브 바닥에 정착 할 수 있습니다.
  10. P200 파이펫을 사용하여 비고반조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상급체를 수집하십시오. 상급체를 신선한 1.7 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
  11. 6.10단계 이후 일부 조직 덩어리가 분리되지 않은 상태로 남아 있는 경우, 원래 1.7mL 미세원심지 튜브에 남아 있는 비분리된 조직에 대해 6.8-6.10단계를 반복하여 세포의 응력을 최소화하면서 해리된 세포의 최종 수율을 최대화합니다. 6.10 단계의 상급에 포함 된 이전에 해리.
  12. 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운. 조심스럽게 제거하고 P1000 파이펫을 사용하여 상류를 폐기.
  13. P1000 파이펫을 사용하여 8x파이펫을 피펫팅하여 적절한 부피의 해부배지(표 1)로펠릿을 다시 놓습니다. 최종 현탁액의 적절한 부피는 세포 밀도가 107 셀 / mL을 초과하지 않도록 결정되었으며, 이는 유세포 분석 기계의 흐름을 차단할 수 있지만 세포가 과도하게 희석되지 않도록하여 정렬 속도가 느려집니다.
  14. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸쳐 큰 덩어리 또는 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 서스펜션을 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮기고 필요할 때까지 얼음에 보관하십시오.

7. 형광 활성화 세포 선별 (FACS)

참고: 이 프로토콜은 15mw 405 nm 바이올렛 레이저, 100mw 488 nm 블루 레이저, 75mw 594 nm 오렌지 레이저 및 40 mw 640 nm 레드 레이저가 장착 된 FACS 선별기를 사용하여 최적화되었습니다. 세포는 100 μm 노즐을 통해 무균 조건 하에서 멸균 PBS에서 피집액으로 분류하였다. 셀 응력최소화를 위해 유량은 1-3의 샘플 압력으로 설정되어 초당 최대 1,000-4,000개의 이벤트를 획득했습니다. 총 FACS 시간은 일반적으로 실험당 1-2시간입니다.

  1. 셀 채우기를 제대로 시각화할 수 있도록 전진 및 측면 분산을 위한 전압을 설정합니다. 셀 선별에 적합한 전압을 설정하는 것은 복잡하며 숙련된 FACS 운영자가 필요합니다.
  2. 서로 다른 셀 모집단을 구별하기 위해 측면 분산 영역(SSC-A)에 의해 결정된 내부 복잡성과 정방향 분산 영역(FSC-A)에 의해 결정된 크기에 따라 셀을 플롯합니다. 그림 3Aa 및 도면 Ba에 표시된 대로 라이브 셀 주위에 게이트를 그려 파편과 죽은 세포를 배제합니다. 게이트된 영역 내의 셀을 모집단 1(P1)으로 그룹화합니다.
  3. 셀 덩어리와 더블을 제외하려면 SSC-A대 측면 분산 폭(SSC-W)을 기준으로 P1 셀을 다음에 플롯합니다. 단일 세포의 모집단을 인구 2(P2)로게이트(그림 3Ab 및 그림 Bb).
  4. 전방 산란 폭(FSC-W)과 FSC-A를 기준으로 P2 셀을 플롯하고 단일 셀의 모집단을 모집단 3(P3)으로 게이트합니다(그림3Ac 및 그림 Bc).
    참고: 7.3 및 7.4에서 두 개의 연속 게이트를 사용하면 셀 덩어리와 더블릿(높은 FSC-W 및 높은 FSC-A)이 제외됩니다.
  5. 게이트 P3 세포 대 동종 엽 형성증에 대 한 GFP에 따라 (APC). APC 채널은 자동 형광을 감지합니다. 이 채널에서 게이팅을 하면 자가형광 세포 캡처를 방지할 수 있습니다. GFP 음수 셀을 사용하여 FITC/GFP 형광 채널의 전압을 조정합니다. 이상적으로, 약 102이 세포 인구를 위한 위치 게이트. 모터 뉴런의 각 유형에 대해 GFP 양성 모집단 4(P4)에 대한 게이트 임계값을 개별적으로 선택합니다(그림3광고 및 그림 Bd).
    참고: 순수한 배양을 얻기 위해 CN3s/CN4에 대한 GFP 게이트를 보다 훨씬 높게 설정합니다(그림3광고 및 그림 Bd). SMN 문화에 대 한 낮은 GFP 게이트 glia 및 비 모터 뉴런에 의해 배양의 오염으로 이어질. 이것은 새는 프로모터 때문에 몇몇 glia 및 비 모터 뉴런에 있는 저수준 GFP 표현이 있기 때문에 확률이 높습니다. 총 셀에 비해 GFP 양성 세포의 비율은 일반적으로 0.5-1.5% CN3s/CN4s에 대 한 그리고 1.5-2.5% SM에 대 한. 해부가 성공한 경우, 이러한 수치는 GFP 양성 게이트에 대한 적절한 위치를 결정하는 벤치마크로 사용될 수있다(그림 3Ae 및 그림 Be).
  6. 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 수행합니다. 500 μL의 운동 뉴런 배양 배지로 채워진 신선한 1.7 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 P4 세포를 수집합니다. 도금될 때까지 얼음에 보관하십시오.
    참고: 셀을 우물로 직접 정렬 할 수 있지만, 이것은 우물 당 고르지 않은 수의 셀을 초래합니다. 세포를 1.75 mL 미세 원심 분리튜브로 분류한 다음 수동으로 플레이트하여 도금 분포를 더욱 균일하게 합니다.

8. 정제 된 기본 운동 뉴런의 문화

  1. FACS-단리 CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 운동 신경 배양 배지로 각각 5 x 103 및 1 x 10 4 세포/mL의 밀도로 37°C로 미리 기운을 제거하였다.
    참고: 하나의 E11.5 배아는 약 1 x 103 CN3/CN4 및 7 x 103 SMN을 산출합니다. 그러나, 이러한 수율은 해부 된 조직의 순도, 세포 해리의 철저성 및 FACS 동안 GFP 게이트의 적절한 임계 값에 크게 의존합니다.
  2. 37°C 조직 배양 인큐베이터로부터 PDL 및 라미닌으로 미리 코팅된 웰 플레이트 96개를 각 웰로부터 층류 후드 및 흡인 라미닌으로 이송한다. 세척하지 않고 즉시 접시와 커버슬립을 사용하십시오.
  3. 희석된 CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 PDL/라미닌 코팅 된 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL을 추가하십시오. 최종 세포 밀도는 각각 CN3/CN4 및 SMN에 대해 1 x 103 및 2 x 103 셀/웰이어야 합니다.
    참고: 96웰 플레이트(2 x 103 셀/웰)에서 SM의 초기 도금 밀도는 CN3s/CN4s(1 x 103 셀/well)의 두 배이며, 시험관 내 2일과 9일(DIV)에서 유사한 최종 운동 뉴런 수와 밀도를 얻기 위해(4−6 x 102 및 2−4 x 102 셀당 웰당)
  4. 배양 뉴런을 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 배양한다.
  5. 5일마다 뉴런을 공급하여 기존 배지의 절반(100 μL)을 제거하고 동일한 부피의 신선한 운동 뉴런 배양 배지로 대체합니다. 신경 프로세스가 1 DIV에서 보이고 14 DIV(그림 4)에의해 더 두껍고 길어지도록하십시오. 신경 세포 체확대 되 고 장기 배양에서 집계 하는 경향이, 특히 SM에 대 한(그림 4).
    참고: 배양된 세포를 분리하지 않도록 원래 배지 볼륨의 절반을 남겨 모든 배지 및 용액 변경을 수행합니다. 여기에는 고정 및 면역 세포 화학 (ICC) 단계가 포함됩니다. 모든 매체가 제거되면 얼마나 부드럽게 제거하든 대부분의 세포가 분리되어 씻겨 나오게 됩니다.

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결과

이 프로토콜의 목적은 운동 신경 장애의 기본 메커니즘을 비교 분석할 수 있도록 1차 CN3s/CN4및 SMN 을 장기적으로 고도로 정화하고 배양하는 것이었습니다(개요는 그림 1 및 그림 2 참조).

일단 뉴런이 성공적으로 분리되고 배양에서 성장되면, 거의 순수한 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양체를 수득하였다(도5A,B)적어도 14 DIV(도4 및 도 6)에대해 유지하였다. 2 DIV에서 CN3/CN4 및 SMN 배양물의 순도는 각각 93.5±2.2% 및 86.7±4....

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토론

역사적으로, CN3 및/또는 CN4 운동 뉴런의 체외 연구는 해리 된17,18,19,20,21,17,22,23,24,25,슬라이스27,28 배양과 같은 이기종 문화에 의존해 왔으며, 이러...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

브리기테 페트만(미국 매사추세츠 주 바이오젠)에게 SMN 해부기술 에 대한 강의에 감사드립니다. 다나 파버 암 연구소 흐름 세포 측정 시설, 하버드 의과 대학의 면역학 부문 흐름 세포 측정 시설, 조슬린 당뇨병 센터 흐름 세포 분석 코어, 브리검 과 여성의 병원 흐름 세포 측정 코어, 보스턴 어린이 병원 흐름 세포 측정 연구 시설 기본 모터 뉴런의 FACS 격리를위한; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. 로즈, 추가 엥글 연구소 회원 및 프로젝트 ALS 컨소시엄 회원으로 기술 지원 및 사려 깊은 토론을 제공합니다. 이 연구는 프로젝트 ALS에 의해 지원되었다. 또한, R.F.는 일본 심장 재단 / 바이엘 야쿠힌 연구 보조금 해외 및 유전학 T32 GM007748에 NIH 교육 보조금에 의해 지원되었다; J.J.는 Schepens 안과 연구소와 발달 신경학 교육 프로그램 박사 후 펠로우십 (5T32NS007473-19)을 통해 보스턴 아동 병원을 통해 안구 질환의 분자 기지 (5T32EY007145-16)에서 NIH / NEI 교육 프로그램에 의해 지원되었습니다. M.C.W는 NEI (5K08EY027850)와 어린이 병원 안과 재단 (교수 발견 상)에 의해 지원되었다; E.C.E.는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.

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재료

Penicillium cyclopium
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 염소 anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP 유세포 분석기BD Bioscience- 여기에는 405, 488, 594 및 640nm 레이저가 장착된 4개의 레이저 시스템이 있습니다.
BD 팔콘 70μ m 나일론 세포 스트레이너CORNING352350FACS 전에 해리 세포를 필터링합니다.
스냅 캡이 있는 BD Falcon 둥근 바닥 시험관CORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
세포 배양 마이크로 플레이트, 96 웰, PS, F-바닥 (굴뚝 웰)Greiner Bio-One International655090우리는 여러 개의 96 웰 접시를 시도했으며
현미경 검사용 ICC 원형 커버 안경Karl Hecht & 어시스트1001/14우리는 면적이 넓기 때문에이 커버 슬립을 사용했습니다 (지름 : 14mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. (CNTF 휴먼 프로스펙-Tany TechnoGene, Ltd.)CYT-272
Cyclopiazonic acid. 응급실 스트레스 요인 중 하나입니다.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie TipsRoboz Surgical InstrumentRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany 주식회사 테크노진CYT-305
GlutaMAX 보충제Thermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E low fluorescenceBrainBitsHELF배아의 GFP 발현 관찰을 방해하는 형광은 낮아야 합니다.
말 혈청, 열 불활성화, 뉴질랜드 원산지Thermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylmethylxanthine
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 매체Thermo Fisher Scientific11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
마이크로 해부 가위Roboz 수술 기구RS-5913
마이크로 나이프 4.75" 1.7 mm x 27 mm 블레이드Roboz 수술 기구RS-6272
Moria Mini Perforated SpoonFine Science Tools10370-19
마우스 단클론 항체 뉴런 클래스 III &베타;-튜불린(TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti 라이브 셀 형광 현미경 및 원소 소프트웨어Nikon-Differentialinterference contrast images and immunocytochemistry images of cell cultures with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS)Fisher ScientificA202-212헹굼용 커버슬립
Olympus 1.7mL 마이크로튜브, ClearGenesee Scientific22-281이 튜브는 맥락에서 "1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브"를 설명한 튜브입니다.
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorpLK003150Papain 용액 및 alubumin-ovomucoid 억제제 용액이 이 키트에서 제조됩니다.
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysin(PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Abcamab1095171:200에 대한 토끼 단클론 항체
카메라Nikon-Dissection을 수행하고 절개된 배아 및 조직의 이미지를 이러한 형광 현미경으로 캡처합니다.
Sylgard 170 블랙 실리콘 봉지재 - A+B 0.9kg 키트다우코닝1696157우리는 이 키트를 사용하여 해부 접시를 만듭니다.
TC 처리 접시, 100mm x 20mmGenesee Scientific25-202이 접시를 사용하여 해부 접시를 만듭니다.
Thum 드레싱 집게 4.5" 톱니 모양 2.2mm 팁 너비Roboz 수술 기구RS-8100
변환기GE HealthcareL8-18i-RS암컷 마우스 초음파용
수의학 초음파 기계GE HealthcareLOGOQ e VET암컷 마우스 초음파용
Zeiss LSM 700 시리즈 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 및 Zen 소프트웨어Carl Zeiss-배아의 컨포칼 이미지는 이러한 장비로 캡처되었습니다.
Sigma-Aldrich C1530 CPA의 Islet1 SMZ18 및 DS-Ri1을 사용한 SMZ1500 줌 실체 현미경 LOGOQ e VET용

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