태아 기 이슬^mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

1 차적인 운동 신경의 문화는 외인성 스트레스 요인에 신경 발달, 기능 및 감수성의 연구를 가능하게 하는 강력한 공구입니다. 운동 신경 배양은 근위축성 측삭 경화증(ALS)^1,2,그의 질병 기전이 불완전하게 이해되는 것과 같은 신경 퇴행성 질환의 연구에 특히 유용하다. 흥미롭게도, ALS 환자와 ALS 모델 마우스 모두에서 척추 운동 뉴런(SMN)의 유의한 세포 사멸에도 불구하고, 오큘러 뉴런(CN3s) 및트로클레어 뉴런(CN4s)에서의 세포 사멸은 상대적으로^{1,3,4,5,6,7,8,9.} 따라서 CN3s/CN4및 SM의 순수 문화어를 비교분석하면 상대적 취약점의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 불행 하 게도, 이러한 분석에 주요 장벽은 이러한 모터 뉴런의 정제 된 문화를 성장 하는 무 능력.

많은 프로토콜은 동물 모델에서 SMN의 정제를 위해 기술되었다. 이러한 프로토콜의 대부분은 밀도 구배 원심 분리^10,11,12 및 / 또는 p75^NTR-항체 기반 세포 정렬 패닝 기술^{13,14,15,16을}사용합니다. 밀도 구배 원심분리는 다른 척수 세포에 비해 SM의 더 큰 크기를 이용하는 반면, p75^NTR은 척수에 있는 SMS에 의해 독점적으로 표현되는 세포외 단백질입니다. 거의 100% 순수 SMN 문화는 이들 프로토콜 들 중 하나 또는 둘 다에 의해 생성되었다^11,12,14. 그러나 CN3s/CN4s가 p75^NTR을표현하지 않고 다른 특정 CN3/CN4 마커가 확인되지 않았기 때문에 이러한 프로토콜은 CN3/CN4 문화를 생성하는 데 성공하지 못했습니다. 또한 SM보다 작기 때문에 크기에 따라 격리하기가 더 어렵습니다. 대신, CN3s 또는 CN4s의 시험관 내 연구는 해리^{17,18,19,20,21,17,22, 23,24,25, 슬라이스27,28} 배양에 의존했으며, 이질적인 세포 유형으로 구성되며 프로토콜이 존재하지 않았습니다. 기본 CN3 또는 CN4의 격리 및 문화.

여기서, 프로토콜은 동일한 배아일11.5(E11.5) Isl^{MN으로부터} CN3s, CN4s 및 SM의 시각화, 절연, 정제 및 배율에 대해 기재되어 있다:GFP 형질전환 마우스^29(도 1, 도 2A). Isl^MN:GFP는 특히 세포막에 국소화되는 원거리 GFP로 운동 뉴런을 라벨을 지정합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 질환의 병리학 적 메커니즘을 밝히기 위해 여러 유형의 운동 뉴런을 종과 연령일치로 비교할 수 있게 합니다.

실험실 동물을 이용한 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 해부 전에 시간 지정 짝짓기 설정

1. 운동 뉴런 수확을 위한 태아 배아 마우스를 생성하기 위해, 각 암컷 마우스의 무게를 측정하고 성인 Isl^MN:GFP 형질전환 마우스 사이의 시간 적 결합을 설정11.5 뉴런 격리의 날 전에 일. 이 프로토콜을 개발하기 위한 목적으로, 129S1/C57BL/6J Isl^MN:GFP 마우스, 숙성 된 2-9 개월, 사용 하 고 시간 매팅 저녁에 설정 되었다.
2. 다음 날 아침 질 플러그에 대한 여성 마우스를 검사합니다. 플러그가 배아일(E) 0.5로 확인된 날짜를 고려합니다.
3. 암컷 마우스의 무게를 측정하고 E8.5−11 사이의 초음파(재료 표참조)를 사용하여 새끼를 검사합니다. 성공적인 짝짓기의 징후를 확인합니다.
   1. 암컷 마우스에서 체중 증가를 검출하여 성공적인 짝짓기(일반적으로 5-6배아가 있는 경우 E9.5에서 1.5g)를 확인합니다.
   2. 초음파 하에 배아를 시각적으로 확인하십시오. 배아는 E9.5 후에 초음파에 의해 쉽게 검출될 수 있습니다. 초음파는 그렇지 않은 여성보다 임신이 더 많기 때문에 체중이 증가한 여성에게만 수행됩니다.
      참고: 암컷 마우스는 임신 이외의 이유로 체중을 증가시킬 수 있으므로 체중 증가만으로는 임신의 신뢰할 수 있는 지표가 아닙니다. 초음파 확인은 임신하지 는 않지만 사용할 수없는 경우 중요하지 않은 여성의 불필요한 희생을 방지합니다.

2. 절제 조건 및 악기 준비

1. 모든 코팅 (커버슬립의 산 세정 제외), 배지 준비, 조직 해리 (원심 분리 및 배양 제외), 및 배양 작업은 배지 및 배아 운동 뉴런의 멸균을 보장하기 위해 층류 후드에서 작동합니다.
2. 멸균 기술에주의를 기울여 오염 위험을 최소화하면서 층류 후드 외부에서 조직 해부를 수행하십시오.
3. 사용하기 전에 70% 에탄올에 담그어 해부 판 1개, 미세 제해 가위 1쌍, 엄지 손가락 드레싱 집게 1쌍, 두몽 #5 핀셋 2쌍, 미세 제해식 나이프 1개, 모리아 미니 천공 숟가락 1개를 살균합니다.

3. 요리 / 커버 슬립의 PDL / 라미닌 코팅

참고: 배양은 적용에 필요한 세포의 수에 따라 96웰 또는 24웰 플레이트에서 1차 운동 뉴런을 해리하였다. 웰은 광학적으로 투명하고 두께가 이미징과 호환되는 경우 커버슬립을 사용하지 않고 조직 배양 판에서 직접 이미지를 촬영할 수 있습니다.

1. 커버립이 필요한 어플리케이션의 경우, 앞서 설명한^바와같이 뉴런 격리 최소 2일 전에 산세척, 살균 및 공기 건조 커버슬립을 준비한다. 커버립의 배치는 실험전에 잘 이러한 방식으로 제조 될 수 있으며 실험 품질에 영향을주지 않고 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
2. 뉴런 격리 2일 전에 인산완충식염수(PBS)에서 20 μg/mL 폴리 D-리신(PDL)의 작동 용액을 준비한다.
   1. Aliquot PDL (1 mg / mL)을 미리 보관하고 재고 용액으로 -20 °C에 보관하십시오.
3. 충분한 PDL 용액 작업 용액으로 각 커버 슬립 또는 조직 배양 판의 표면을 덮습니다 (예 : 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL 또는 커버립이 있거나없는 24 웰 플레이트에 잘 당 500 μL). 37 °C에서 하룻밤 배양.
4. 다음날 멸균된 물로 3x를 씻으소서.
   1. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 세척된 PDL 코팅 플레이트를 최종 세척 후 완전히 건조한 경우 최대 1개월 동안 4°C에서 보관합니다.
5. PBS 1.2 mL에서 10 μL의 라미닌(1.1−1.2 mg/mL)으로 작업 용액을 준비합니다.
   1. 알리쿼트 라미닌 스톡(1.1-1.2 mg/mL)을 미리 보관하고 -80°C에 보관하십시오.
6. 각 커버슬립의 표면을 커버하거나 표면을 고르게 코팅하기에 충분한 라미닌 용액으로 잘 덮습니다. 사용하기 전에 37°C에서 적어도 2시간 동안 배양하였다.
   참고: PDL/라미닌 코팅 플레이트 및 커버슬립은 37°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있지만, 갓 코팅된 라미닌이 바람직하다. 도금^30하기전에 직접 라미닌을 제거하십시오. 라미닌은 건조할 수 없습니다. 접시를 몇 시간 이상 보관해야하는 경우, 그들은 파라핀 필름에 싸여야한다.

4. 해부, 운동 신경 배양 배지 및 해리 솔루션의 준비

참고: 괄호 안에 있는 농도는 각 시약의 최종 농도를 나타냅니다.

1. 해부를 준비합니다.
   1. 열불활성화 말 혈청을 4°C에서 밤새 해동하고, 1 mL aliquots를 준비하고, -20°C에서 보관한다. 사용하기 전에 RT에서 직접 알리쿼트를 해동하십시오.
   2. -20°C에서 1mL aliquots에 B27-보충제(50x)를 보관하십시오. 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 녹입니다. 동결/해동 주기를 피하십시오.
   3. 글루타민 보충제(100x)를 4°C 또는 -20°C에서 보관하십시오. -20 °C에서 저장하는 경우 0.5 mL aliquots로 나눕니다.
   4. 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)을 -20°C에서 1mL aliquots에 저장합니다. 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 녹입니다.
   5. 해부 매체를 만들기 위해, 최대 절전 E의 9.4 mL을 말 혈청 200 μL (2%), 50x B27 보충제 (1x), 100 μL 의 100 μL (예를 들어, 글루타맥스) 및 100 μL 의 10,000 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL). 해부 된 조직을 수집하고 해리 된 세포의 최종 현탁액을 만들기 위해이 매체를 사용하십시오.
   6. 뉴런 분리 전날 조직 수집을 위해 개별 1.7 mL 미세원심지 튜브에 해부 배지 의 500 μL을 추가합니다. 수집될 각 조직 유형(예를 들어, 양성 대조군, 음성 대조군, CN3/CN4, SMN)에 대해 하나의 튜브를 준비하고 사용 전에 4°C에서 저장한다.
   7. 최대 절전 모드 의 49 mL B27 보충의 1 mL (1 x)와 결합 하 고 이 매체와 함께 24 잘 접시를 채우기 (2 mL/well) 신경 격리 전날. 마우스 배아를 수집하기 위해이 접시를 사용합니다. 사용하기 전에 4°C에서 보관하십시오.
2. 운동 뉴런 배양 배지를 준비한다.
   1. 라이보비츠의 L15 배지에 25mMM2-메르카포에탄올 250 μL aliquots를 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
   2. 멸균된 물에 희석된 BDNF, CNTF 및 GDNF의 100 μg/mL 용액의 5 μL aliquots를 생성합니다. -80°C에서 보관하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동하십시오.
   3. 64 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 5 mg(1.0670 μM)에 추가하여 10 mM 의 산림용액을 완전히 용해시켰다. 그런 다음 멸균수(1.003 mL)를 DMSO 용액에 넣고 와류를 잘 추가합니다. -20°C에서 10 mM의 12 μL 알리쿼트를 저장하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동합니다.
   4. DMSO에서 희석된 100 mM isobutylmethylxanthine(IBMX)의 12 μL aliquots를 준비합니다. -20°C에서 보관하고 사용 직전에 RT에서 알리쿼트를 해동하십시오.
   5. 운동 신경 배양 배지를 만들기 위해, 말 혈청 200 μL (2%), 50x B27 보충제 (1x), 100 μL의 100 μL의 100 μL (1x)와 신경 기저 배지의 9.4 mL을 혼합하십시오. 100 μL 의 10,000 U/m: 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL), 20 μL 의 25 mM 2-메르카포에탄올 (50 μM), 바람직하게는 사용하기 전에. 이 단계는 뉴런 격리 1일 전에 수행될 수 있다.
   6. 사용 직전에 100 μg/mL BDNF(10 ng/mL), CNTF(10 ng/mL), GDNF(10 ng/mL) 및 GDNF(10 ng/mL) 및 10 μL의 10 μL(10 μM)을 각각 100 mMM IBMX(100 μM) 뉴런 배양에 추가합니다. 매체를 37°C로 미리 데우다.
3. 해리 솔루션을 준비합니다.
   1. 파페인 용액(20 U/mL 파파인 및 0.005% DNase)과 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(1 mg/mL 오보뮤코이드 억제제, 1mg/mL 알부민 및 0.005% DNase)을 제조업체의 지시에 따라 준비합니다.
   2. 오보뮤코이드 억제제 및 파파인 용액각각의 500 μL aliquots를 준비하고 -80°C에 보관한다. 사용 직전에 37°C에서 알리쿼트해.

5. 복부 중뇌 및 척수 해부

참고: 형광 해부 입체 현미경으로 5.1.1-5.1.3 단계 및 5.1.5-5.1.6단계를 제외한 다음 단계를 모두 수행합니다. 실험당 총 해부 시간은 전형적으로 3-5 시간, 해부 기술의 숙련도 및 각 실험에 필요한 운동 뉴런의 수에 따라 다.

1. 복부 중뇌 해부
   1. 임신한 마우스를 약 11.5일 후 이산화탄소 가스와 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시한다.
   2. 에탄올로 복부를 철저히 살포하고 멸균 미세 분축 가위와 엄지 손가락 드레싱 집게를 사용하여 자궁을 제거하십시오. 멸균 PBS에서 자궁을 잠시 씻은 다음 미리 냉각 된 멸균 PBS로 채워진 해부 판으로 옮김하십시오.
   3. Isl^MN:GFP-양성 배아를 무균 미세 분절 가위, 엄지 드레싱 집게 및 듀몬트 #5 핀셋을 현미경의 밝은 빛 아래 서냉 멸균 PBS에 사용하여 자궁에서 조심스럽게 제거하십시오. 멸균 된 모리아 미니 천포 숟가락을 사용하여, 1x B27로 보충 된 미리 냉각 된 최대 절전 모드 낮은 형광 매체로 채워진 24 웰 플레이트의 별도의 우물로 각 배아를 옮니다. 얼음에 24 웰 플레이트를 유지합니다.
   4. 한 개의 배아를 멸균 해부 플레이트에 옮기고 얼음으로 차가운 멸균 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 완전히 덮습니다.
   5. 해부 단계가 현미경의 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC) 조명 하에 수행되도록 합니다. 핀셋을 사용하여 중뇌를 손상시키지 않고 배아의 꼬리와 얼굴을 제거합니다(그림2Ba). 사지가 현미경의 앞쪽을 가리키는 사지와 꼬리가 있는 경향이 있는 배아를 디스섹터쪽으로 향합니다(별표, 그림 2Bb로표시).
   6. 핀셋을 사용하여 작은 개구부를 생성하기 위해 제 4 심실의 지붕을 슬릿. 이 개구부를 사용하여 핀셋을 네 번째 심실과 지붕 사이에 생성된 공간에 연결합니다. 배아의 등쪽 표면을 따라 해부하고 피질과 횡측을 바닥 판 및 모터 컬럼으로 해부한다(도2Ca,b). GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 밝히기 위해 오픈 북 방식으로 해부된 조직을 엽니다.
      참고: 중간엽, CN3 및 CN4를 포함하는 복부 중뇌에서 조직의 작은 조각은 지금 드러날 것입니다.
   7. 조심스럽게 배아에서 복부 중뇌를 분리하고 핀셋과 미세 제해 칼을 사용하여 수막 조직을 제거합니다. 핀셋 및 미세 제해 나이프를 사용하여 양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 바닥 판 및 기타 GFP 음성 주변 조직에서 해부합니다(그림2D). 절제 된 조직에서 GFP 양성 운동 뉴런의 수를 최대화 하지만 만지거나 손상 하지 마십시오.
   8. 별도의 CN3 및 CN4 핵의 집합이 요구되는 경우, 이들 두 핵의 중간선을 따라 절단한다(도2D에서노란색 점선). P1000 파이펫을 사용하여, 최소한의 HBSS로 해부된 복부 중뇌 조직을 수집하고 해부 매체로 채워진 표지된 1.7 mL 마이크로 원심 분리튜브에 놓습니다(단계 4.1.5 참조). 해리될 때까지 얼음에 보관하십시오.
   9. 총 수가 실험 요건을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아에서 복부 중뇌를 계속 풀링합니다(이상적인 세포 수의 경우 8단계를 참조하십시오).
      참고: 조직은 해리 및 선별 도중 스트레스를 받기 때문에 적어도 10x10⁴ CN3/CN4 운동 뉴런을 산출하는 적어도 10개의 복부 중뇌의 풀링된 집합은 추천됩니다.
2. 복부 척수 해부
   1. 머리가 현미경의 전면을 향하고, 분리쪽으로 배아를 유지하는 경향이 있습니다. 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 쌍의 핀셋 끝을 네 번째 심실의 미개봉 된 꼬리 부분에 삽입하십시오.
   2. 배아의 전체 rostrocaudal 범위에 걸쳐 뒷뇌와 척수의 나머지 부분을 등도로 엽니다. 등쪽 조직을 절단하여 열고, 제 4 심실에서 시작하여 집게를 가위로 사용하여 척추척수의 중앙 운하쪽으로 작용합니다(그림 2Ca,b). 이 시술 중에 복부 척수를 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
   3. 핀셋 한 쌍으로 배아를 잡고 핀셋의 다른 쌍으로 양쪽에 등쪽 조직의 플랩을 꼬집습니다(그림 2Ea,b).
      참고: 절제된 등지 조직에는 등지 피부, 중간엽, 등지 뿌리 중추 (DRGs), 등뒤뇌 및 척수가 포함되어 있습니다. SMN 핵을 손상시키지 않고 가능한 한 많은 조직을 제거하십시오.
   4. GFP 양성 SMN 바로 아래를 관통하는 미세 해부 나이프를 사용하여 복부 척수를 제거합니다. 양면에 톱과 같은 움직임으로 복부 척수를 들어 올립니다(그림 2Fa,b). 부동 복부 척수를 C1 바로 위를 가로로 자르고, 여기서 첫 번째 GFP 양성 전방 경적 프로젝트(그림 2G). 또한, 하지의 위쪽 경계에서 가로로잘라냅니다(그림 2G). 이 절차 후에 복부 척수의 자궁 경부 (C1)-요추 (L2-L3) 부분을 제거하십시오.
   5. 복부 척수 등쪽을 위로 올려 놓고 핀셋 한 쌍으로 GFP 양성 SMN 컬럼 사이에 GFP 음성 조직을 눌러 잡습니다. GFP 양성 SMN 컬럼의 양면을 미세 해부 나이프로 트리밍하여 나머지 부착 된 중간엽, DRG 및 등쪽 척수를 제거합니다(그림 2H). GFP 양성 운동 뉴런을 손상시키지 않고 최대화하도록 주의하십시오.
   6. P1000 파이펫을 사용하여 최소한의 HBSS로 해부된 척수 조직을 수집하고 해부 매체로 채워진 SMN 라벨 1.7 mL 미세 원심 분리튜브에 놓습니다. 해리될 때까지 얼음에 보관하십시오. 총 수가 실험 요건을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아에서 복부 척수를 계속 풀링합니다.
      참고: 조직은 해리 및 선별 중에 스트레스를 받기 때문에 약 2.1 x 10⁴ SMN을 산출하는 적어도 3개의 복부 척수를 수집하는 것이 좋습니다.
   7. Isl^MN:GFP 마우스 배아의 안면 운동 뉴런과 사지를 각각 GFP 양성 및 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 대한 GFP 음성 대조군으로 수집한다. 사지는 SMN의 GFP 양성 축삭이 이 배아 나이에 사지로 아직 확장되지 않았기 때문에 GFP 음성입니다.

6. 조직 해리

참고: 총 해리 시간은 일반적으로 실험당 1.5시간입니다.

1. 따뜻한 파파인 및 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액을 해리하기 30분 전에 37°C로 aliquots.
2. 미세 해부 된 조직을 저속으로 간단히 회전시킵니다.
3. P100 파이펫을 사용하여 조직을 흡입하지 않고 가능한 한 많은 최대 절전 모드 E를 조심스럽게 제거하십시오.
   참고: 다음 단계에서 파파인 해리의 효능을 감소하지 않도록이 단계 후 모든 잔류 최대 절전 모드 E를 제거해야합니다.
4. 미세 해부 조직 샘플을 함유하는 1.7 mL 미세 원심 분리지 튜브 각각에 파파인 용액의 적당 부피를 첨가한다(표1).
   참고: 해리를 위한 파고통의 적절한 부피는 세포에 대한 스트레스를 최소화하면서 효과적인 해리를 최대화하기 위해 결정되었다.
5. P200 파이펫으로 8x를 부드럽게 트리튜레이합니다. 모든 삼중 단계를 부드럽게 수행하여 운동 뉴런 생존 가능성을 보존합니다.
6. 37°C에서 30분 동안 조직을 함유하는 튜브를 배양하고, 손가락으로 10분마다 10배씩 쓸어넘기고, 배양 후 P200 피펫으로 각 현탁액을 8x 부드럽게 삼각화한다. 300 x g에서 5 분 동안 세포를 회전시면 됩니다.
7. 다음 단계에서 오로서무코이드 억제의 효능을 보장하려면 P1000 피펫을 사용하여 조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상상체를 제거하고 폐기하십시오.
8. 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액의 적절한 부피에 펠릿을 다시 일시중단(표 1)P200 파이펫으로 8x를 부드럽게 삼각시켜.
9. 2 분 동안 기다렸다가 비분리 된 조직의 나머지 조각이 튜브 바닥에 정착 할 수 있습니다.
10. P200 파이펫을 사용하여 비고반조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상급체를 수집하십시오. 상급체를 신선한 1.7 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
11. 6.10단계 이후 일부 조직 덩어리가 분리되지 않은 상태로 남아 있는 경우, 원래 1.7mL 미세원심지 튜브에 남아 있는 비분리된 조직에 대해 6.8-6.10단계를 반복하여 세포의 응력을 최소화하면서 해리된 세포의 최종 수율을 최대화합니다. 6.10 단계의 상급에 포함 된 이전에 해리.
12. 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운. 조심스럽게 제거하고 P1000 파이펫을 사용하여 상류를 폐기.
13. P1000 파이펫을 사용하여 8x파이펫을 피펫팅하여 적절한 부피의 해부배지(표 1)로펠릿을 다시 놓습니다. 최종 현탁액의 적절한 부피는 세포 밀도가 10⁷ 셀 / mL을 초과하지 않도록 결정되었으며, 이는 유세포 분석 기계의 흐름을 차단할 수 있지만 세포가 과도하게 희석되지 않도록하여 정렬 속도가 느려집니다.
14. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸쳐 큰 덩어리 또는 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 서스펜션을 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮기고 필요할 때까지 얼음에 보관하십시오.

7. 형광 활성화 세포 선별 (FACS)

참고: 이 프로토콜은 15mw 405 nm 바이올렛 레이저, 100mw 488 nm 블루 레이저, 75mw 594 nm 오렌지 레이저 및 40 mw 640 nm 레드 레이저가 장착 된 FACS 선별기를 사용하여 최적화되었습니다. 세포는 100 μm 노즐을 통해 무균 조건 하에서 멸균 PBS에서 피집액으로 분류하였다. 셀 응력최소화를 위해 유량은 1-3의 샘플 압력으로 설정되어 초당 최대 1,000-4,000개의 이벤트를 획득했습니다. 총 FACS 시간은 일반적으로 실험당 1-2시간입니다.

1. 셀 채우기를 제대로 시각화할 수 있도록 전진 및 측면 분산을 위한 전압을 설정합니다. 셀 선별에 적합한 전압을 설정하는 것은 복잡하며 숙련된 FACS 운영자가 필요합니다.
2. 서로 다른 셀 모집단을 구별하기 위해 측면 분산 영역(SSC-A)에 의해 결정된 내부 복잡성과 정방향 분산 영역(FSC-A)에 의해 결정된 크기에 따라 셀을 플롯합니다. 그림 3Aa 및 도면 Ba에 표시된 대로 라이브 셀 주위에 게이트를 그려 파편과 죽은 세포를 배제합니다. 게이트된 영역 내의 셀을 모집단 1(P1)으로 그룹화합니다.
3. 셀 덩어리와 더블을 제외하려면 SSC-A대 측면 분산 폭(SSC-W)을 기준으로 P1 셀을 다음에 플롯합니다. 단일 세포의 모집단을 인구 2(P2)로게이트(그림 3Ab 및 그림 Bb).
4. 전방 산란 폭(FSC-W)과 FSC-A를 기준으로 P2 셀을 플롯하고 단일 셀의 모집단을 모집단 3(P3)으로 게이트합니다(그림3Ac 및 그림 Bc).
   참고: 7.3 및 7.4에서 두 개의 연속 게이트를 사용하면 셀 덩어리와 더블릿(높은 FSC-W 및 높은 FSC-A)이 제외됩니다.
5. 게이트 P3 세포 대 동종 엽 형성증에 대 한 GFP에 따라 (APC). APC 채널은 자동 형광을 감지합니다. 이 채널에서 게이팅을 하면 자가형광 세포 캡처를 방지할 수 있습니다. GFP 음수 셀을 사용하여 FITC/GFP 형광 채널의 전압을 조정합니다. 이상적으로, 약 10²이 세포 인구를 위한 위치 게이트. 모터 뉴런의 각 유형에 대해 GFP 양성 모집단 4(P4)에 대한 게이트 임계값을 개별적으로 선택합니다(그림3광고 및 그림 Bd).
   참고: 순수한 배양을 얻기 위해 CN3s/CN4에 대한 GFP 게이트를 보다 훨씬 높게 설정합니다(그림3광고 및 그림 Bd). SMN 문화에 대 한 낮은 GFP 게이트 glia 및 비 모터 뉴런에 의해 배양의 오염으로 이어질. 이것은 새는 프로모터 때문에 몇몇 glia 및 비 모터 뉴런에 있는 저수준 GFP 표현이 있기 때문에 확률이 높습니다. 총 셀에 비해 GFP 양성 세포의 비율은 일반적으로 0.5-1.5% CN3s/CN4s에 대 한 그리고 1.5-2.5% SM에 대 한. 해부가 성공한 경우, 이러한 수치는 GFP 양성 게이트에 대한 적절한 위치를 결정하는 벤치마크로 사용될 수있다(그림 3Ae 및 그림 Be).
6. 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 수행합니다. 500 μL의 운동 뉴런 배양 배지로 채워진 신선한 1.7 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 P4 세포를 수집합니다. 도금될 때까지 얼음에 보관하십시오.
   참고: 셀을 우물로 직접 정렬 할 수 있지만, 이것은 우물 당 고르지 않은 수의 셀을 초래합니다. 세포를 1.75 mL 미세 원심 분리튜브로 분류한 다음 수동으로 플레이트하여 도금 분포를 더욱 균일하게 합니다.

8. 정제 된 기본 운동 뉴런의 문화

1. FACS-단리 CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 운동 신경 배양 배지로 각각 5 x 10³ 및 1 x 10 4 세포/mL의 밀도로 37°C로 미리 기운을 제거하였다.
   참고: 하나의 E11.5 배아는 약 1 x 10³ CN3/CN4 및 7 x 10³ SMN을 산출합니다. 그러나, 이러한 수율은 해부 된 조직의 순도, 세포 해리의 철저성 및 FACS 동안 GFP 게이트의 적절한 임계 값에 크게 의존합니다.
2. 37°C 조직 배양 인큐베이터로부터 PDL 및 라미닌으로 미리 코팅된 웰 플레이트 96개를 각 웰로부터 층류 후드 및 흡인 라미닌으로 이송한다. 세척하지 않고 즉시 접시와 커버슬립을 사용하십시오.
3. 희석된 CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 PDL/라미닌 코팅 된 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL을 추가하십시오. 최종 세포 밀도는 각각 CN3/CN4 및 SMN에 대해 1 x 10³ 및 2 x 10³ 셀/웰이어야 합니다.
   참고: 96웰 플레이트(2 x 10³ 셀/웰)에서 SM의 초기 도금 밀도는 CN3s/CN4s(1 x 10³ 셀/well)의 두 배이며, 시험관 내 2일과 9일(DIV)에서 유사한 최종 운동 뉴런 수와 밀도를 얻기 위해(4−6 x 10² 및 2−4 x 10² 셀당 웰당)
4. 배양 뉴런을 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양한다.
5. 5일마다 뉴런을 공급하여 기존 배지의 절반(100 μL)을 제거하고 동일한 부피의 신선한 운동 뉴런 배양 배지로 대체합니다. 신경 프로세스가 1 DIV에서 보이고 14 DIV(그림 4)에의해 더 두껍고 길어지도록하십시오. 신경 세포 체확대 되 고 장기 배양에서 집계 하는 경향이, 특히 SM에 대 한(그림 4).
   참고: 배양된 세포를 분리하지 않도록 원래 배지 볼륨의 절반을 남겨 모든 배지 및 용액 변경을 수행합니다. 여기에는 고정 및 면역 세포 화학 (ICC) 단계가 포함됩니다. 모든 매체가 제거되면 얼마나 부드럽게 제거하든 대부분의 세포가 분리되어 씻겨 나오게 됩니다.

이 프로토콜의 목적은 운동 신경 장애의 기본 메커니즘을 비교 분석할 수 있도록 1차 CN3s/CN4및 SMN 을 장기적으로 고도로 정화하고 배양하는 것이었습니다(개요는 그림 1 및 그림 2 참조).

일단 뉴런이 성공적으로 분리되고 배양에서 성장되면, 거의 순수한 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양체를 수득하였다(도5A,B)적어도 14 DIV(도4 및 도 6)에대해 유지하였다. 2 DIV에서 CN3/CN4 및 SMN 배양물의 순도는 각각 93.5±2.2% 및 86.7±4.7%,운동 뉴런 마커 인 아일렛1 및 뉴런 마커 TUJ1을 사용하여 ICC에 의해 평가될때(도 5B)이었다. 그러나, 이러한 높은 순도는 FACS 동안 GFP 게이트에 대한 적절한 임계값을 설정에 배아의 나이와 에 크게 의존(그림 3). E10.5에서 배아의 해부는 조직의 부드러움과 접착제의 증가로 인해 E11.5에서 해부보다 더 어렵고, 그 결과 운동 뉴런 수율이 감소합니다. 그러나, E10.5 CN3s/CN4s 및 SMN의 순도는 E11.5 배아(각각 2DIV에서 92.8%와 82.2%,단일 실험에서 얻은 데이터)에 비해 비교되었습니다. E13.5 배아가 사용되었을 때 CN3s/CN4s 및 SMN의 순도는 가장 높은 GFP 양성 집단만 수집된 경우에도 극적으로 감소했습니다(각각 2DIV에서 20.7%와 7.4%, 단일 실험에서 얻은 데이터), 아마도 비운동 뉴런에서 GFP의 발현 때문일것입니다(그림 7). 이 같은 경향은 E12.5 문화에 도 마찬가지, 비록 그것은 훨씬 덜 극적인. 따라서 E12.5 이상의 배아는 이 프로토콜을 사용하여 운동 뉴런의 정제에 사용하기에 적합하지 않습니다.

순수한 운동 뉴런 배양은 운동 뉴런의 고립된 성장 패턴, 행동 및 취약성을 이해하는 데 유용합니다. 이 예는 이 문화가 화학 처리에 모터 신경 반응을 시험하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다. 1차 CN3s/CN4및 SM이 상구체 망막(ER) 스트레스에 대한 차동 반응을 보이는지 확인하기 위해, CN3s/CN4및 SM의 1차 단일 배양은 이 프로토콜을 사용하여 수득되었고 ER 스트레스기, 사이클로피아존산(CPA)의 다양한 농도로 처리되었습니다. 뉴런은 CPA(5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 μM) 또는 2 DIV에서 비하 대조군(DMSO)으로 처리하고 생존율을 평가하기 위해 3일 후에 ICC를 고정하였다(도8A). 각 샘플에서 실행 가능한 뉴런의 수를 계산하고 생존율은 DMSO로 처리된 웰에서 생존 가능한 세포의 수로 나눈 약물 처리 웰에서 생존 세포의 수로 계산되었다. CN3/CN4 단문화는 SMN 단문화에 비해 CPA 처리(10-25 μM)에 훨씬 더 내성이있었다(도 9 및 도 8B)31.

결론적으로, 이 프로토콜은 고도로 정제된 1차 마우스 배아 CN3/CN4 및 SMN 배양물의 생성을 허용하여 뉴런 행동의 조사를 위한 강력하고 신뢰할 수 있는 시스템을 제공한다.

그림 1: 마우스 배아 운동 뉴런의 제조를 위한 계획. 회로도는 마우스 배아 운동 뉴런의 격리 및 배양에 관여하는 단계와 각 단계에 대한 시간 또는 일의 대략적인 시간을 예시한다. CN3/CN4 및 SMN에 대한 해부 절차의 순서는 각각 순차적으로 1에서 4까지 레이블이 지정됩니다. 약어: CN3/CN4= 오큘로모터 뉴런/트로클레어 뉴런; SMN = 척추 운동 뉴런; FACS = 형광 활성화 세포 선별; h = 시간; d = 일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 복부 중뇌 및 자궁 경부(C1)-요추(L2-L3) 부분의 복부 척수의 해부. (a)측삭(a)및 등도(b)E11.5 IslMN에서 GFP 양성 운동 뉴런의 뷰 :GFP 형질전환 마우스 배아플루오세인(FITC) 조명하에. 전체 마운트 E11.5 배아는 배아를 투명하게 하기 위해 앞서 설명한대로 32를 제조하였다. 이어서, 배아는 항-GFP 염색(green)으로 면역형광 표지에 의해 분석되었다. 이미지는 공초점 현미경으로 캡처되었습니다. 배율 막대 = 200 μm(측면 도면) 및 400 μm(등쪽 도면). 약어: S = 우수; I = 열등; V = 복부; D = 등도. (B-H) E11.5 복부 중뇌 및 복부 척수 조직의 이미지에 강조 해부 단계는 형광 해부 입체 현미경을 사용하여 밝은 빛 (Bb) 또는 FITC 조명에서 장착 된 카메라로 촬영. 배율 막대 = 200 μm (D) 및 1mm (A−C, E−H). (B)(a)빨간 선을 따라 절단 하 여 배아의 얼굴과 꼬리를 제거 합니다. (b)배아를 해부를 위해 위치시켰다. 현미경의 전면의 위치는 별표로 표시됩니다. (C)제4 심실(a) 측면도 및(b)등도의 지붕을 슬릿하기 위해 단색 적선을 따라 절단한다. 이 개구부를 사용하여 배아 등쪽의 표면을 따라 뇌로 절단합니다 (점선 빨간색 화살표로 표시된 궤적). 이것은 두개골에서 해제될 수 있는 mesenchyme, CN3 및 CN4를 포함하는 조직을 드러낸다. SMN 해부를 위해, 네 번째 심실과 그 지붕 사이의 동일한 개구부에 집게를 삽입 한 다음 배아의 꼬리 쪽을 향해 절단 (탄도는 파선 노란색 화살표로 표시). (D)양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 함유하는 복부 중뇌의 최종 보기. 조직의 가장자리는 빨간색 사각형으로 강조 표시됩니다. 원하는 경우 노란색 점선을 따라 절단하여 CN3 및 CN4 핵을 따로 수집합니다. (E)뒷뇌와 척수의 나머지 부분을 연 후, 등쪽 조직을 핀셋(a) 전후로 양쪽의 빨간선 위로 꼬집었다. (f)적색선(a)전및(b)후 척수에 대한 과잉 조직 복부의 양자 제거. (G)빨간색 선으로 표시된 두 위치에서 복부 척수의 절단. 로스트랄 측에서는 첫 번째 GFP 양성 전방 경적 프로젝트가 C1 위를 가로로 부동 복부 척수 절단. 척수의 꼬리 말단을 하반신의 상부 경계에서 가로로 절단합니다. 일단 이 절단이 만들어지면, 복부 척수의 요추 (L2-L3) 부분을 통해 자궁 경부 (C1) 멀리 해부될 수 있습니다. (H)GFP 양성 SMN 컬럼을 포함하는 복부 척수의 최종 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 복부 중뇌(A) 및 복부 척수(B)의 대표적인 정렬 플롯. (AA와 바) 전방 산란 면적(FSC-A) 대 측면 분산 영역(SSC-A) 이물질 및 죽은 셀을 배제하기 전에 플롯을 정렬합니다. (아브, BB, Ac, BC) 셀덩어리(b)및 doublets(c)를 제외하기위한 정렬된 플롯은 각각 폭(SSC-W) 대 SSC-A 및 순방향 분산 폭(FSC-W) 대 FSC-A를 기준으로 합니다. (광고 및 BD) 정렬된 플롯을 사용하여 Isl MN:GFP-양성 운동 뉴런을 분리합니다. 순수한 배양을 얻으려면 GFP 게이트는 CN3s/CN4(광고)보다 SM(Bd)에 대해더 높게 설정해야 합니다. (Ae 와 Be) FACS 정렬을 통해 수집을 위해 게이트된 셀의 백분율입니다. %Parent는 이전 문이 닫힌 셀 모집단의 셀 수에 대한 현재 문이 닫힌 모집단의 셀 백분율을 나타내지만 %Total은 총 셀을 기준으로 게이트된 셀의 백분율을 나타냅니다. 총 세포와 비교하여 GFP 양성 세포의 예상 백분율 (빨간색으로 박스) CN3 / CN4에 대한 0.5-1.5 %와 SMN의 1.5-2.5 %입니다. 해부가 성공적으로 수행된 경우 이러한 백분율을 벤치마크로 사용하여 GFP 양성게이트(광고 및 Bd)를설정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 2, 7 및 14 DIV에서 기본 CN3/CN4 및 SMN 단일 문화어의 위상 대비 이미지. 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양물의 대표적인 차동 간섭 콘트라스트 이미지는 해당 이미지 수집 및 처리 소프트웨어 및 40x 목표를 사용하여 반전형광 현미경으로 2, 7 및 14 DIV에서 캡처되었습니다. 신경 과정은 14 DIV에 의해 더 두껍고 길어졌습니다. 두 배양물 모두 최소 14DIV. 스케일 바 = 50 μm을 유지할 수 있습니다.

그림 5: 분리된 E11.5 마우스 CN3/CN4 및 SMN 배양의 특성화. (a)대표적인 E11.5 마우스 CN3s/CN4s(상단) 및 SMN(하단)의 대표적인 면역세포화학 이미지는 2DIV. 뉴런 마커 TUJ1(녹색)과 운동 뉴런 마커 인 Islet1(빨간색)을 배양하여 뉴런 및 핵을 분석하기 위해 DAPI(blue)로 대응하였다. 거의 모든 배양 된 세포는 운동 뉴런이었다 (TUJ1+, 아일렛1+). 이미지는 해당 이미지 수집 및 처리 소프트웨어와 20배 의 목표를 사용하여 반전된 형광 현미경으로 캡처되었습니다. 샘플은 포화 픽셀 없이 최대 신호 강도를 달성하기 위해 이미지화 및 처리되었습니다. 다음 도면에서 모든 현미경 작업 및 이미지 처리는 달리 명시되지 않는 한 이러한 조건에서 수행되었다. 스케일 막대 = 100 μm.(B)2 DIV에서 E11.5 마우스 CN3/CN4 및 SMN 배양의 순도. CN3/CN4 및 SMN 배양물의 순도는 각각 93.5±2.2% 및 86.7±4.7%였다. 죽은 신경 세포 체는 pyknotic 핵 형태와 막 붓기에 대 한 스크리닝에 의해 평가 되었다. 신경 프로세스는 비슬과 팽윤의 표시가 관찰될 때 퇴화 과정으로 분류되었습니다. 세포 체 사멸도 퇴화 과정도 없는 세포는 실행 가능한 비운동 뉴런(TUJ1+, Islet1- - ) 또는 생존 가능한 운동 뉴런(TUJ1+,Islet1+)33으로간주되었다. 운동 뉴런 배양의 순도는 실행 가능한 운동 뉴런의 총 수와 실행 가능한 운동 뉴런으로 나눈 실행 가능한 운동 뉴런의 수로 계산되었다. 값은 3개의 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. 학생의 t 시험에 의해 중요하지 않습니다 (p > 0.05) 셀 카운팅은 20배 배율 하에서 수동으로 수행되었다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 2, 7, 및 14 DIV에서 1차 CN3/CN4 및 SMN 단일 배양물의 대표적인 면역세포화학. 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양체는 TUJ1(녹색)으로 면역형광 라벨링에 의해 2, 7, 14 DIV에서 분석되었고, 핵은 DAPI(청색)로 반점화하였다. 신경 프로세스에 의해 두껍고 더 이상 14 DIV. 신경 세포 신체 크기 확대 되 고 장기 배양에서 집계 하는 경향이 되었다, 특히 SM에 대 한. CN3/CN4 및 SMN 배양모두 적어도 14DIV. 이미지는 10배 배율로 포획되었다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: E13.5 마우스 CN3/CN4 및 SMN 격리 배권의 특성화. E13.5 CN3/CN4 및 SMN을 이 프로토콜을 사용하여 분리 및 배양하고 TUJ1(녹색) 및 아일렛1(적색)으로 면역형광 라벨링에 의해 2DIV에서 분석하였고, 핵은 DAPI(청색)로 반염색하였다. 많은 비운동 신경 세포(TUJ1+, Islet1-)가 존재하여 CN3/CN4 및 SMN 순도 모두에서 급격한 감소를 초래하고, SMN 배양물에서 더 뚜렷한 감소가 있었다. 이미지는 20배 배율로 캡처되었습니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: CN3s/CN4가 CPA에 의해 유도된 ER 스트레스에 선택적으로 저항한다는 것을 입증하는 1차 운동 뉴런 배양의 대표적인 적용. (a)실험 개요: 1차 CN3/CN4 및 SMN 단일배양은 2 DIV에서 CPA 또는 비위 대조군(DMSO)으로 처리하였고, 세포 비진은 치료 3일 후 면역세포화학 분석을 통해 평가하였다. 이 개요는 출판된 작업31에서수정되었습니다. (B)2 DIV에서 3일 동안 5-30 μM CPA로 처리된 CN3s/CN4s 및 SM의 생존율정량화 뉴런은 TUJ1을 가진 세포의 면역형광 표지에 의해 분석되었고, 핵은 DAPI로 반염색하였다. 생존율은 약물 처리된 웰에서 생존 가능한 세포의 수(도 5B 범례 참조)를 비히클 단독(DMSO)을 함유하는 웰에서 생존 세포의 수로 나눈 값으로 계산하였다. 셀 카운팅은 20배 배율 하에서 수동으로 수행되었다. 값은 4개의 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. * p < 0.05; p < 0.005 학생의 t 시험에 의해. 이 그림은 이전에 출판된 작업31에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 9: 2 DIV에서 시작하여 CPA의 증가 농도에 3 일 노출 후 1 차 CN3/CN4 및 SMN 단일 배양물의 대표적인 면역 세포 화학. 뉴런은 TUJ1(녹색)을 가진 세포의 면역형광 표지에 의해 분석되었고 핵은 DAPI(청색)로 반염색하였다. 1차 CN3s/CN4는 1차 SM보다 CPA 치료에 더 강했다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 적절한 양의 파파인, 알부민-오보뮤코이드 및 해리 단계에 사용되는 최종 현탁액. 다양한 수의 복부 중뇌 및 복부 척수 조직과 함께 사용되는 파파인 및 알부민-오보뮤코이드의 적절한 볼륨은 여러 차례의 최적화 후 제조업체의 지침에서 수정되었습니다. 조직은 해리 및 선별 중에 스트레스를 받기 때문에 10 개 이상의 복부 중뇌와 3 개 이상의 복부 척수의 풀링 컬렉션을 권장합니다. 파파인의 양은 효과적인 해리와 이 절차의 스트레스 사이의 균형을 고려하여 결정되었습니다. 알부민 -오보뮤소이드 억제제 용액의 양은 파파인의 절반입니다. 최대 절전 모드 E 최종 현탁액의 적절한 부피는 세포 밀도가 107 셀/mL을 초과하지 않도록 결정되었지만 세포가 과도하게 희석되지 는 않습니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.