이 작품은 1 차적인 oculomotor, trochlear 및 척추 운동 뉴런의 동종 세포 배양을 산출하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 배양은 안구 및 척추 운동 뉴런의 형태학적, 세포적, 분자 적 및 전기 생리학적 특성의 비교 분석에 사용될 수 있다.
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방법 논문
태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스
이 논문에서
요약
초록
Oculomotor 뉴런 (CN3s) 및 trochlear 뉴런 (CN4s) 척추 모터 뉴런에 비해 근위축성 측삭 경화증 (ALS)와 같은 퇴행성 운동 뉴런 질환에 현저한 저항을 나타낸다 (SMNs). 기본 마우스 CN3, CN4 및 SM을 격리하고 배양하는 기능은 이 선택적 취약점의 기반이 되는 메커니즘을 연구하는 방법을 제공합니다. 현재까지 대부분의 프로토콜은 이기종 세포 배양을 사용하므로 실험 결과의 해석을 혼동할 수 있습니다. 혼합 세포 집단과 관련된 문제를 최소화하기 위해 순수한 배양이 필수적입니다. 여기서, 제1 프로토콜은 배아일 11.5(E11.5) IslMN:GFP 형질전환 마우스 배아를 사용하여 동일한 배아로부터 의SMN 대응체와 함께 CN3s/CN4를 효율적으로 정화하고 배양하는 방법을 자세히 설명한다. 이 프로토콜은 CN3/CN4 및 SMN 핵으로부터의 조직 해부 및 해리, FACS 기반 세포 분리, 시험관내 배작에 대한 세부 정보를 제공한다. 이 프로토콜은 기존 프로토콜에 새로운 체외 CN3/CN4 배양 시스템을 추가하고 동시에 비교를 위해 순수한 종 및 연령 일치 SMN 배양을 제공한다. 운동 뉴런의 형태학, 세포, 분자 및 전기 생리학적 특성에 초점을 맞춘 분석은 이 문화 시스템에서 가능합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 발달, 선택적 취약성 및 질병을 정의하는 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다.
서론
1 차적인 운동 신경의 문화는 외인성 스트레스 요인에 신경 발달, 기능 및 감수성의 연구를 가능하게 하는 강력한 공구입니다. 운동 신경 배양은 근위축성 측삭 경화증(ALS)1,2,그의 질병 기전이 불완전하게 이해되는 것과 같은 신경 퇴행성 질환의 연구에 특히 유용하다. 흥미롭게도, ALS 환자와 ALS 모델 마우스 모두에서 척추 운동 뉴런(SMN)의 유의한 세포 사멸에도 불구하고, 오큘러 뉴런(CN3s) 및트로클레어 뉴런(CN4s)에서의 세포 사멸은 상대적으로1,3,4,5,6,7,8,9. 따라서 CN3s/CN4및 SM의 순수 문화어를 비교분석하면 상대적 취약점의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습....
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프로토콜
실험실 동물을 이용한 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 해부 전에 시간 지정 짝짓기 설정
- 운동 뉴런 수확을 위한 태아 배아 마우스를 생성하기 위해, 각 암컷 마우스의 무게를 측정하고 성인 IslMN:GFP 형질전환 마우스 사이의 시간 적 결합을 설정11.5 뉴런 격리의 날 전에 일. 이 프로토콜을 개발하기 위한 목적으로, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP 마우스, 숙성 된 2-9 개월, 사용 하 고 시간 매팅 저녁에 설정 되었다.
- 다음 날 아침 질 플러그에 대한 여성 마우스를 검사합니다. 플러그가 배아일(E) 0.5로 확인된 날짜를 고려합니다.
- 암컷 마우스의 무게를 측정하고 E8.5−11 사이의 초음파(재료 표참조)를 사용하여 새끼를 검사합니다. 성공적인 짝짓기의 징후를 확인합니다.
- 암컷 마우스에서 체중 증가를 검출하여 성공적인 짝짓기(일반적으로 5-6배아가 있는 경우 E9.5에서 1.5g)를 확인합니다.
- 초음파 하에 배아를 시각적....
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결과
이 프로토콜의 목적은 운동 신경 장애의 기본 메커니즘을 비교 분석할 수 있도록 1차 CN3s/CN4및 SMN 을 장기적으로 고도로 정화하고 배양하는 것이었습니다(개요는 그림 1 및 그림 2 참조).
일단 뉴런이 성공적으로 분리되고 배양에서 성장되면, 거의 순수한 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양체를 수득하였다(도5A,B)적어도 14 DIV(도4 및 도 6)에대해 유지하였다. 2 DIV에서 CN3/CN4 및 SMN 배양물의 순도는 각각 93.5±2.2% 및 86.7±4........
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토론
역사적으로, CN3 및/또는 CN4 운동 뉴런의 체외 연구는 해리 된17,18,19,20,21,17,22,23,24,25,슬라이스27,28 배양과 같은 이기종 문화에 의존해 왔으며, 이러.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
브리기테 페트만(미국 매사추세츠 주 바이오젠)에게 SMN 해부기술 에 대한 강의에 감사드립니다. 다나 파버 암 연구소 흐름 세포 측정 시설, 하버드 의과 대학의 면역학 부문 흐름 세포 측정 시설, 조슬린 당뇨병 센터 흐름 세포 분석 코어, 브리검 과 여성의 병원 흐름 세포 측정 코어, 보스턴 어린이 병원 흐름 세포 측정 연구 시설 기본 모터 뉴런의 FACS 격리를위한; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. 로즈, 추가 엥글 연구소 회원 및 프로젝트 ALS 컨소시엄 회원으로 기술 지원 및 사려 깊은 토론을 제공합니다. 이 연구는 프로젝트 ALS에 의해 지원되었다. 또한, R.F.는 일본 심장 재단 / 바이엘 야쿠힌 연구 보조금 해외 및 유전학 T32 GM007748에 NIH 교육 보조금에 의해 지원되었다; J.J.는 Schepens 안과 연구소와 발달 신경학 교육 프로그램 박사 후 펠로우십 (5T32NS007473-19)을 통해 보스턴 아동 병원을 통해 안구 질환의 분자 기지 (5T32EY007145-16)에서 NIH / NEI 교육 프로그램에 의해 지원되었습니다. M.C.W는 NEI (5K08EY027850)와 어린이 병원 안과 재단 (교수 발견 상)에 의해 지원되었다; E.C.E.는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.
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재료
Penicillium cyclopium
Sigma-Aldrich C1530 CPA의 Islet1 SMZ18 및 DS-Ri1을 사용한 SMZ1500 줌 실체 현미경 LOGOQ e VET용
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| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP 유세포 분석기 | BD Bioscience | - | 여기에는 405, 488, 594 및 640nm 레이저가 장착된 4개의 레이저 시스템이 있습니다. |
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참고문헌
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010). ....
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