방법 논문

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

DOI:

10.3791/60446

⸱

2020년 5월 31일

 ,  ,  , 
1Department of Marine Biology and Ecology, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, University of Miami, 2Department of Biology, University of Miami, 3The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, Faculty of Health Sciences, and Regenerative Medicine and Stem Cell Research Center, Ben Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.

초록

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산호초는 인위적 스트레스로 인해 위협을 받고 있습니다. 이러한 스트레스에 산호의 생물학적 반응은 세포 수준에서 발생할 수 있습니다,하지만 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 스트레스에 산호 응답을 조사 하려면, 우리는 세포 응답을 분석 하기 위한 도구가 필요. 특히, 우리는 세포 집단이 스트레스에 반응하는 방법을 더 잘 이해하기 위하여 기능적인 측정법의 응용을 촉진하는 공구가 필요합니다. 현재 연구에서는, 우리는 돌산호에 있는 다른 세포 인구를 격리하고 분리하기 위하여 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 이용합니다. 이 프로토콜은 다음을 포함한다: (1) 골격으로부터 산호 조직의 분리, (2) 단일 세포 현탁액의 생성, (3) 유세포 측정을 위한 다양한 마커를 사용하여 산호 세포를 표지하는 것, 및 (4) 게이팅 및 세포 선별 전략. 이 방법은 연구원이 분석, 기능 분석 및 다른 세포 집단의 유전자 발현 연구를 위한 세포 수준에서 산호에 작동하도록 가능하게 할 것입니다.

서론

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산호초는 지구상에서 가장 중요한 생태계 중 하나입니다. 그들은 물고기와 무척추 동물에 대한 중요한 서식지를 제공함으로써 생물 다양성을 촉진하고 관광1을통해 음식과 경제적 생계를 제공함으로써 인류 공동체를 유지하는 데 중요합니다. 산호초의 주요 빌더인 산호동물(Phylum: Cnidaria)은 파도와 폭풍 피해를 완화하는 대형 탄산칼슘 프레임워크를 만들어 해안 지역사회를 돕습니다2.

산호는 성인으로서 바이러스, 고고학, 박테리아, 프로티스트, 곰팡이, 그리고 특히 조류 디노플라젤레이트 패밀리 심비오디니아과3의구성원을 포함하는 다양한 내분비파트너를 호스트하는 세실 동물이다. 환경의 변화는 종종 질병 발발과 공생 Symbiodiniaceae따라서 산호 식민지에서 추방되는 산호 표백으로 이어지는이 지역 사회에서 불균형을 일으킬 수 있습니다, 따라서 산호에 대한 영양의 주요 소스를 제거. 이 두 가지 시나리오는 종종산호 호스트4,5,,6의죽음을 일으킵니다. 급....

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프로토콜

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1. 에어 브러시와 압축기를 통해 산호 골격에서 조직의 해리

참고 : 얼음에 단계를 수행하고 장갑으로 손을 보호합니다.

  1. 에어 컴프레서, 호스 및 에어브러시를 연결하여 에어브러시 키트를 조립합니다(그림2). 압력 게이지를 276-483 kPa 사이로 설정합니다.
    참고: 이 연구에 사용된 권장 압축기 및 공기 호스는 최대 압력 393kPa로 미리 설정되었습니다. 이 276-483 kPa 범위 의 외부 사용은 세포막의 골격 또는 파열에서 부적당한 세포 제거 귀착될 수 있습니다. 이 범위는 각 종에 따라 다를 수 있으며 생존 시험이 필요할 수 있습니다. 생존시험은 간단한 혈세포계와 4′,6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI) 염료 배제 분석법을 사용하여, 화합물 현미경상에서 가시화된 세포 슬러리의 서브세트로 수행될 수 있다.
  2. 오토클레이브에 100 mL의 세포 염색 매체를 준비, 멸균 유리 용기는 10x 인산완충식염수(PBS; 칼슘 및 마그네슘 없음)의 33 mL를 최종 농도3.3배, 태아 송아지 혈청 2 mL(FCS; 30분 동안 56°C에서 불활성화된 열)을 총 부피의 2% 내지, 1 M HEPES의 2 mL의 최종 농도에 2 mL를 첨가하여 mPES의 ....

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결과

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전반적으로, 이 프로토콜은 기능적 분석에 사용될 수 있는 살아있는 산호 세포 집단의 식별 및 수집을 용이하게 하기 때문에 유용합니다. 워크플로우는 산호 조직을 탄산칼슘 골격에서 기계적으로 분리하는 것으로시작되었습니다(그림 1). 이것은 부적당한 기술이 높은 세포 사망을 초래하고 많은 양의 파편을 만들 수 있기 때문에 가장 중요한 초기 단계 중 하나입니다. 효소 분리는 증가된 조직 전단 및 높은 세포 사망을 초래할 수 있기 때문에 조언되지 않습니다. 에어브러시를 사용한 기계적 분리는 이러한 과제를 감소시킵니다(그림2),평균 세포 사망률을 ~10%로 감소시킵니다(데이터는 표시되지 않음). 에어브러시 매개 된 골격으로부터 조직의 기계적 분리에 이어, 생성된 슬러리는 세포 스트레이너를 통해 여과하여 세포 현탁액으로 여과되었다. 세포 현탁액을 DNA(DAPI), ROS, 및.......

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토론

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이 프로토콜은 Rosental 외18에서 적응하고 P. 다미코니스 세포의 식별 및 격리를 위해 개발되었다. 이 방법론은 상대적인 세포 크기, 상대세포 세분성, 세포 자가형광 및 손상되지 않은 세포막의 존재를 포함한 세포 본질적 인자를 검사를 통해 파편, 생존 불가능한 세포 및 Symbiodiniaceae 호스팅 세포를 제거하기 위해 샘플을 필터링하는 과정에 중점을 둡니다. 이러한 기술은 다른 산호 종에 적용 할 수 있습니다. 그러나, FACS 게이팅 전략은 세포 집단 특성에 있는 종 특정 다름 때문에 변화할 수 있습니다.

산호 건강을 이해하기위한 FACS의 유용성은 세포를 차별화하고 격리하기 위해 다양한 세포 본질적 인 인자를 사용하는 능력에 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 생존가능성, 반응성 산소 종 농도 및 리소좀 함량에 기초하여 산호 세포를 분화하기 위해 외인성 세포 염색의 추가 사용을 설명합니다. 이전에 Rosen.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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NTK는이 연구에 자금을 조달하기위한 자연 과학 및 공학 마이애미 연구 상 대학을 인정하고 싶습니다. BR은 비교 및 진화 면역학 실험실에 자금을 지원한 알렉스와 앤 라우터바흐에게 감사를 표하고 싶습니다. BR의 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF) 번호에 의해 지원되었다: 1416/19 및 2841/19, HFSP 연구 보조금, RGY0085/2019. 우리는 기술 지원을 위한 잔나 코제바에바와 마이크 코넬리에게 감사드립니다. 우리는 또한 마이애미 대학, 의학의 밀러 학교의 흐름 세포 분석 공유 자원 에 FACS 세포계에 대한 액세스 및 기술 지원을 섀넌 Saigh에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에어브러시 키트 & 압축기TCP 글로벌ABD KIT-H-SETPaasche H 시리즈 싱글 액션 사이펀 피드 에어 브러시 키트 마스터 TC-20 압축기 & 에어 호스
BD FACSAria IIBD644832
뼈 절단기벌크 암초 공급205357바다 불가사의 산호 돌 뼈 절단기
세포 여과기Corning35234040 um; BD 팔콘; 개별 포장; 메 마른; 나일론
CellRox GreenLife TechnologiesC104442.5mM(DMSO); 여기/방출: 485/520 nm
수집 백Grainger38UV35Reloc Zippit 6"L x 4"W 표준 재밀봉 가능한 폴리 백, 지퍼 씰 클로저, 투명; H2O에서 2mil 두께
DAPIInvitrogenD130610mg; 여기/방출: 358/461 nm
태아 종아리 혈청Sigma-AldrichF2442-100ML57°C에서 열 비활성화; C 30분 동안
혈구계Sigma-AldrichZ359629Bright-Line Hemacymeter
HEPES 버퍼Sigma-AldrichH0887
LysoTracker Deep RedLife TechnologiesL124921mM in DMSO; 흡수/방출: 647/668 nm
마이크로 원심분리기 튜브VWR87003-2941.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS)Gibco70011-044pH 7.4; 10X
라운드 보텀 튜브VWR3520635 mL 폴리프로필렌 라운드 보텀 튜브
주사기BD3096281 mL BD Luer-Lok 주사기 멸균, 단일 사용 폴리카보네이
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참고문헌

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  1. Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
  2. Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communicat....

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