여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.
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방법 논문
시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형
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이 논문에서
요약
초록
시아노박테리아는 유용한 산업 상품의 재생 가능한 생산을 위해 유전자 변형될 수 있는 원핵광합성 생물의 다양한 그룹입니다. 합성 생물학의 최근 발전은 CyanoGate와 같은 여러 복제 도구 키트의 개발로 이어졌다, 시아노 박테리아로 후속 변환 또는 부부 전달을위한 플라스 미드 벡터를 구축하기위한 표준화 모듈 형 복제 시스템. 여기서 우리는 자가 복제 벡터(예를 들어, 형광 마커 발현 카세트를 운반)를 조립하기 위한 상세한 방법과 시아노박테리아 균주 시네코시스티스 sp. PCC 6803 또는 Synechococcus로 벡터의 부부 전달을 설명한다. elongatus UTEX 2973. 또한, 플레이트 리더 또는 유세포측정법을 사용하여 유전적 부분(예를 들어, 프로모터)의 성능을 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다.
서론
시아노박테리아는 다양한 자연및 이종성 고부가가치 대사산물의 생합성에 사용될 수 있는 자가영양균으로1,2,3,4,5, 6. 몇몇 장애물은 여전히 그들의 상업적 생존가능성을 확장하기 위하여 극복될 필요가 있고, 특히, 이종 영양바이오 플랫폼(예를 들어, 대장균 및 효모)에 비해 상대적으로 가난한 수율은7. 최근 사용 가능한 유전 공학 도구의 확장과 시아노박테리아 연구에서 합성 생물학 패러다임의 섭취는 이러한 과제를 극복하고 효율적인 바이오 팩토리로서 시아노박테리아를 더욱 발전시키는 데 도움이 되고 있다8, 9,10.
시아노박테리아에 DNA를 도입하기 위한 주요 접근법은 형....
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프로토콜
1. 플랜트 모클로 및 시아노게이트 툴킷을 사용한 벡터 어셈블리
참고 : 벡터 어셈블리를 진행하기 전에 사용자가 식물 및 CyanoGate MoClo 시스템12,15의벡터 레벨 구조에 익숙해지는 것이 좋습니다.
- 레벨 0 부품 의 구성
참고: 레벨 0 파트는 전체 벡터또는 레벨 0 수락자(예: gBlocks, IDT)를 사용하여 어셈블리를 위한 선형 시퀀스로 합성할 수 있습니다. 대안적으로, 서열은 소스 템플릿(예를 들어, 벡터 또는 정제된 게놈 DNA)으로부터 증폭될 수 있다. 여기서, 증폭된 제품으로부터 새로운 레벨 0 부품을 생성하는 방법에 대해 설명한다. 레벨 0에서 레벨 T까지의 골든 게이트 어셈블리 프로세스개요가그림 1.- 프라이머를 디자인합니다.
- 어떤 레벨 0 모듈을 조립하고 적절한 식별 결정 5′ 및 3′ 오버행(표 1)12,15. BPiI 또는 BsaI 제한 부위의 존재를 복제하기 위해 DN....
- 프라이머를 디자인합니다.
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결과
골든 게이트 조립 워크플로우를 입증하기 위해, 식 카세트는 다음 레벨 0 부품을 포함하는 레벨 1 위치 1(Forward) 수용자 벡터(pICH47732)로 조립되었다: C-피코시아닌 오페론 P cpc560(pC0.005)의 프로모터, eYFP(pC0.008) 및 이중 종결자 T rrnB(pC0.082)에 대한 코딩 시퀀스(pC0.082)(12). 조립 반응의 변형 후, 성공적인 어셈블리는 대장균 콜로니의 표준 청백색 스크리닝을 사용하여 확인되었습니다(그림3). 레벨 1 벡터 및 엔드 링크 1 벡터(pICH50872)에서의 eYFP 발현 카세트를 다음 레벨 T 수용기 벡터(pPMQAK1-T)로 조립하여 벡터 cpcBA-eYFP(도4
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토론
골든 게이트 어셈블리는 다른 벡터 어셈블리 방법에 비해 몇 가지 장점이 있으며, 특히 확장성20,21의측면에서. 그럼에도 불구하고 랩에서 골든 게이트 시스템을 설정하려면 다양한 부품과 수용자 벡터 라이브러리 및 전체 조립 프로세스에 익숙해지는 데 시간이 필요합니다. 더 복잡한 어셈블리를 위해 또는 많은 수의 복잡한 어셈블리를 병렬로 수행할 때(예: 여러 유전자 발현 카세트를 포함하는 레벨 T 벡터 제품군 만들기)에 신중한 계획이 필요한 경우가 많습니다. 먼저 필요한 모든 유전자 발현 카세트 조합을 나열한 다음 레벨 0에서 실리코 수준 T로 워크플로를 매핑하는 것이 좋습니다. 이 과정에서 사용자는 레벨 T에서 순차적이지 않은 레벨 1 벡터를 조립할 수 있는 플랜트 MoClo 키트에서 사용할 수 있는 레벨 1 "더미" 부품을 고려해야 합니다(예: 레벨 1 위치 1 및 위치 3 벡터는 "더미" 부품과 함께 조립할 수 있음) 레벨 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 산업 생명 공학 및 생명 에너지 (NIBB)의 PHYCONET 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC) 네트워크와 금융 지원을위한 산업 생명 공학 혁신 센터 (IBioIC)에 감사드립니다. GARG, AASO 및 AP는 BBSRC EASTBIO CASE 박사 프로그램(보조금 번호 BB/M010996/1), 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아(CONACYT) 박사 프로그램, IBioIC-BBSRC 협력 교육 파트너십(CTP) 박사 프로그램, 각각. 콘래드 멀리노(런던 퀸 메리 대학교) 및 폴 에릭 젠슨과 줄리 안네마리 지타 제들러(코펜하겐 대학교)에게 플라스미드 벡터 및 프로토콜 기여와 조언에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | 2.1.3에 사용됩니다. |
| 표 2에 사용된 | 아데노신 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 |
| 한천 (미생물학 테스트 완료) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | 8.3에 사용됩니다. |
| 아가로스 | Bioline BIOLINE | BIO-41026 | 6. |
| Attune NxT 유세포분석기 | Thermo Fisher | Scientific-4.3.1에서 사용됨. | |
| 표 2에 사용된 | 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 |
| BpiI (BbsI) | 2에 사용된 | Thermo Fisher Scientific | ER1011 |
| 표 2에 사용된 | BsaI(Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 |
| 카르베니실린 디소듐 | VWR International | A1491.0005 | 2.1.3에 사용됩니다. |
| Corning Costar TC 처리 된 평평한 바닥 24 웰 플레이트 | Sigma-Aldrich | CLS3527 | 4.1.3에 사용됩니다. |
| 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | 3.6.2에 사용됩니다. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA 추출 키트. 5에서 사용하는. |
| FLUOstar Omega Microplate 리더 | BMG | 에서 사용됩니다. | |
| GeneJET 플라스미드 Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | 플라스미드 정제 키트. 2.3.2단계에서 사용됩니다. |
| 유리 구슬 (직경 0.5mm) | BioSpec 제품 | 11079105 | 5.2에 사용됩니다. |
| 글리세롤 | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | 2.3.1, 3.6.2에 사용되었습니다. |
| 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | 2.1.3에 사용되었습니다. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | 2.1.3에 사용됨. |
| 멤브레인 필터(0.45 μ m) | MF-Millipore | HAWP02500 | 3.3.7 |
| 마이크로 플레이트, 96 웰, 플랫 바닥 (굴뚝 우물) 및 마이크로에 사용됩니다. CLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | 4.2.1에서 사용되었습니다. |
| 1.1.2.2에 사용되는 | Monarch DNA 젤 추출 키트 | New England Biolabs | T1020S |
| Monarch PCR DNA 정리 키트 | New England Biolabs | T1030 | DNA 정제 키트. 1.1.2.3에서 사용됩니다. |
| LED가 있는 Multitron Pro 인큐베이터 | Infors 백색 | LED 조명이 있는 HT-Shaking 인큐베이터. 4.1.4에서 사용됩니다. | |
| MyTaq DNA 중합효소 | Bioline | BIO-21108 | , 7.1에 사용됨. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | 는 2.3.3에서 사용되었습니다. |
| One Shot TOP10 화학적 역량 E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | 2.1.1에서 사용됩니다. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 용액(10X 농축액) | VWR International | K813 | 4.3.2에 사용됩니다. |
| Q5High-fidelity DNA 중합효소 | New England Biolabs | M0491S | 는 1.1.2.1에 사용되었습니다. |
| 그림 4에서 사용되는 | 빠르하 짐 1개 kb DNA 사다리 | New England Biolabs | N0468S |
| 스크류 캡 튜브 (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | 3.6.3에 사용 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | 2.1.3에 사용. |
| Sterilin Clear Microtiter 둥근 바닥 96웰 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | 4.3.1에 사용됩니다. |
| 표 2에 사용된 | T4 DNA 리가제 | Thermo Fisher Scientific | EL0011 |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | 비드 밀. 5.2에서 사용됩니다. |
참고문헌
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering m....
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