여기에 에스트로겐 효과의 검출을위한 제브라피시 배아 Tg (vtg1 : mCherry)의 사용을위한 자세한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 물고기의 전파와 배아의 치료를 커버하고 내분비 방해 화합물 (EDC)에 의해 유도 된 형광 신호의 검출, 문서화 및 평가를 강조한다.
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방법 논문
Tg를 사용 하 여 (Vtg1:mcherry) 제브라피시 배아 내 분 비 방해 화합물의 에스트로겐 효과 테스트
이 논문에서
요약
초록
많은 내 분 비 방해 화합물 (EDC) 환경에, 특히 에스트로겐 물질. 이러한 물질의 검출은 화학적 다양성으로 인해 어렵습니다. 따라서 에스트로겐 효과에 민감한 바이오 모니터/바이오 지표 유기체와 같은 점점 더 많은 효과 검출 방법이 사용됩니다. 이러한 생체 모니터링 유기체는 여러 물고기 모델을 포함한다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 Tg(vtg1: mCherry) 형질전환선을 생체 모니터링 유기체로서 사용하는 것을 다루며, EDC에 의해 유도된 형광 신호의 검출, 문서화 및 평가에 중점을 두고 물고기의 전파 및 배아 의 치료를 포함한다. 이 작업의 목적은 에스트로겐 효과를 검출하기 위해 Tg (vtg1 : mCherry) 형질 전환선 배아의 사용의 데모입니다. 이 작품은 2개의 에스트로겐성 물질, α 및 β 제아롤레놀을 시험해서 에스트로겐성 효과의 검출을 위한 형질제 제브라피시 배아 Tg(vtg1: mCherry)의 사용을 문서화합니다. 설명된 프로토콜은 분석 설계를 위한 기초일 뿐입니다. 시험 방법은 테스트 끝점 및 샘플에 따라 다양할 수 있다. 더욱이, 다른 분석 방법과 결합하여 형질전환선의 향후 사용을 용이하게 할 수 있다.
서론
우리 환경에서 가장 유해 물질 중 하나 인 내분비 방해 화합물 (EDC)의 상당수가 있습니다. 이들은 주로 천연 자원에서 물을 오염 하는 에스트로겐 화합물. 그룹에 속하는 물질의 화학적 다양성은 검출을 위해 다른 분석 방법이 필요하기 때문에 존재에 대한 테스트를 어렵게 만듭니다. 그들의 화학 구조에 따라 물질이 실제로 에스트로겐으로 작용할 수 있는지 여부를 결정하는 것은 매우 어렵습니다. 또한, 이러한 물질은 환경에 있는 순수한 형태로 결코 존재하지 않습니다, 그래서 그들의 효력은 그밖 화합물에 의해 영향을 받을 수 있습니다, 너무1. 이러한 문제점은 에스트로겐 효과를 보이는 바이오모니터/바이오지표 유기체의 사용과 같은 효과검출 방법에 의해 해결될 수 있다2,,3,,4,,5.
최근에는 다양한 세포주6 및 효모 기반 시험 시스템2,,3이
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프로토콜
동물 의정서는 헝가리 동물 복지법에 따라 승인되었으며 치료된 개인이 무료 수유 단계에 이르기 전에 모든 연구가 완료되었습니다.
1. 배아 수확 및 치료
- Tg(vtg1:mCherry) 얼룩말피를 25.5 ± 0.5°C, pH = 7±0.2, 525 ± 50 μS/m, 산소 수준 ≥80% 포화, 14h 광 및 10h 암흑 사이클에서 유지하십시오.
- 결합 탱크에 시스템 물을 채우고 계란을 수확하기 전에 오후를 짝짓기위해 물고기를 설정합니다.
- 수컷과 암컷 물고기를 탱크에 넣고 칸막이의 도움으로 분리합니다.
- 다음날 아침에 조명이 켜지면서 탱크에서 디바이더를 제거합니다. 15-20분마다 짝짓기 탱크에서 계란을 확인하십시오.
- 차 스트레이너 또는 조밀하게 짠 미세 메쉬를 사용하여 모든 배아를 수확하고 E3 버퍼 (염화 나트륨 5mM, 염화 0.17 mM 칼륨, 0.33 mM 칼슘 염화칼슘, 0.33 mM 황산염) 또는 깨끗한 시스템 물하나 큰 페트리 접시에 결합합니다.
- 배아를 25.5 ± 0.5 °C로 설정된 인큐베이터에 놓습니다.
- 1-1.5 h 후, 제거 하 고 제거 하 고 제거 하 고 제거 하 고 제거 또는 부적절하....
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결과
이 원고에 제시된 실험에서, Tg (vtg1:mCherry) 제브라피시 배아에 5 일 동안 수정에서 시작하는 5 개의 농도에서 두 개의 에스트로겐 성 물질의 효과를 테스트하였다. 우리는 물질 때문에 노출 시간의 끝에 의해 물고기의 간에서 형광 신호가 나타났는지 여부와 두 물질의 에스트로겐성에 차이가 있었는지 여부를 조사했습니다. 결과는 형광 영상과 통합 밀도 값에 기초하여 평가되었다. 일반적으로, 두 물질 모두 개인이 살아남은 시험 농도에서 노출 시간이 끝날 때까지 트랜스진의 발현을 유도한다. 처리되지 않은 대조군 물고기의 경우 형광 신호가 보이지 않았습니다.
α-ZOL의 경우, 가장 높은 시험 농도(8 μM)에서 모든 개인이 사망하므로 이 경우 형광 신호를 검사할 수 없었습니다. 낮은 농도(0.5 μM-4 μM)에서 배아의 간에서 강한 형광 신호가 관찰되었다(도4A). 형광 강도와 형광 영역의 크기(p&.......
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토론
에스트로겐 효과에 대 한 바이오 모니터/생물 지표의 사용은 독성 연구에서 확산 되었습니다. 생체 내 모델은 시험외 검사와 달리 세포 또는 수용체의 반응에 대한 정보를 제공할 뿐만 아니라 유기체내의 복잡한 공정에 대한 조사를 허용하기 때문에 뛰어난 역할을 한다. 에스트로겐 효과를 연구하기위한 여러 형질 전환 선은 제브라피시에서 생산되었으며, 그 중 하나는 Tg (vtg1:mCherry) 이러한 연구에 사용되었습니다. 여기서 설명된 방법은 순수하고 활성적인 성분에서 생체내에서 에스트로겐 활성을 검출하기 위해 이 선의 배아 를 시험하기 위한 프로토콜을 보여 준다.
라인의 남성과 배아는 또한 에스트로겐 효과를 검출하는 데 적합하지만, 배아는 그들의 유용성을 촉진하는 몇 가지 장점이 있습니다. 특히, 신체는 투명하므로 간내형 신호를 쉽게 관찰할 수 있다. 제브라피쉬 간은 수정 후 6시간(hpf 6hpf)을 개발하기 시작하고 50시간(50hpf) 후에 작동하기 시작합니다. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국가 연구 개발 및 혁신 기금 (NKFIA)에서 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 (NKFIH)에 의해 지원되었다; 보조금 계약: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 프로젝트는 유럽 연합 (EU)이 공동 조달하고, 주제 우수 프로그램 NKFIH-831-10/2019 Szent István 대학의 혁신 및 기술 부문수상.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24 웰 조직 배양 플레이트 | Jet Biofil | TCP011024 | |
| 칼슘 - 염화 칼슘 (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 소프트웨어 | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ 소프트웨어 | 미국 국립보건원(National Institutes of Health, USA | ) 공공 액세스 소프트웨어, 다운로드 가능: | |
| http://imagej.nih.gov/ Leica Application Suite X 보정 소프트웨어 | Leica Microsystems GmbH. | 우리는 실험에서 설명한 소프트버를 사용했지만 모든 사진 소프트웨어는 | |
| Leica M205 FA 실체현미경, Leica DFC 7000T 카메라 | Leica Microsystems GmbH | 우리는 실험에 설명된 장비를 사용했지만 모든 형광 실체 현미경이 | |
| 마그네슘-황산염(MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd | 20342-0-27-38 | |
| m체리 필터 | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-셀룰로오스 | 시그마 Aldrich Ltd. | ||
| Microloader 피펫 팁 | Eppendorf GmbH. | ||
| 파스퇴르 피펫 | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| 페트리 디쉬 | 제트 Biofil | TCD000060 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| 트리케인-메탄설포네이트(MS-222) | 시그마 알드리치 | E10521 |
참고문헌
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....
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재인쇄 및 허가
