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방법 논문

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

6.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60484

⸱

2019년 11월 26일

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.

초록

우리는 온도를 사용하여 키네신 구동, 미세 소관 기반 의 3 차원 (3D) 활성 유체의 유속을 조정하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 원하는 다른 속도에 도달하기 위해 새로운 샘플을 제조할 필요 없이 도면의 속도를 조정할 수 있습니다. 또한,이 방법은 속도의 동적 제어를 할 수 있습니다. 온도를 순환하면 유체가 주기적으로 빠르고 느리게 흐릅니다. 이 제어성은 키네신-미세소관 반응의 아레니우스 특성을 기반으로 하며, 4-8 μm/s의 제어된 평균 유속 범위를 보여줍니다. 제시된 방법은 밸브없이 채널의 유량이 국부적으로 튜닝 할 수있는 미세 유체 장치의 설계에 문을 엽니 다.

서론

활성 물질은 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환하는 능력으로 인해 기존의 수동 물질과 차별화됩니다. 그러한 능력을 가진 물질은 박테리아, 곤충, 콜로이드, 곡물 및 세포골격 필라멘트1,2,3,4,5,6,7,8,9,10과같은 살아 있거나 비생물성 존재체로 구성될 수 있다. 이러한 재질 개체는 이웃과 상호 작용합니다. 더 큰 규모에서, 그들은 난류와 같은 vortices (활성 난류) 또는 물질 흐름11,12,13,14,15,16,17,18,19,20으로스스로 구성한다. 활성 물질의 자기 조직에 대한 이해는 분자 셔틀, 광학 장치 및 병렬 계산21,22,23에서다양한 응용 으로 이어졌습니다. 응용 프로그램을 다음 단계로 끌어올리려면 자체 조직 이상의 제어가 필요합니다. 예를 들어, Palacci 등은 수동으로 제어되는 청색광에 노출되었을 때만 자체 추진되는 헤마타이트 캡슐화 콜로이드를 개발하여 살아있는 결정24의출현을 이끌었다. Morin 등은 튜닝 가능한 외부 전기장을 사용하여 Quincke 콜로이드를 압연하는 제어를 확립하여 경마장과 같은 채널25에서콜로이드 무리를 일으킵니다. 이 전작들은 응용 프로그램에서 로컬 제어의 역할을 보여주고 활성 물질의 지식 기반을 발전시고 있습니다.

이 기사에서는 키네신 구동, 미세 소관 (MT) 기반 3D 활성 유체의 제어성에 중점을 둡니다. 유체는 3개의 주요 분대로 이루어져 있습니다: MTs, 키네신 분자 모터 및 고갈제. 고갈제는 나중에 모터 클러스터에 의해 브리지되는 MT를 번들로 묶는 고갈력을 유도합니다. 이 모터는 더하기 끝에 있는 MTs를 따라 걷습니다. 한 쌍의 브리지 MTsis 반평행이면 해당 모터가 반대 방향으로 걷습니다. 그러나 모터는 클러스터에 바인딩되어 떨어져 걸을 수 없으므로 MT 쌍(인터필라멘트 슬라이딩, 그림 1A)을협조적으로 미끄러뜨습니다. 이러한 슬라이딩 역학이 축적되어, MTsto의 번들이 그들의 좌굴 불안정 지점에 도달할 때까지 연장된다(확장 번들, 도 1B)26. 깨진 번들은 고갈력에 의해 어닐링되어, 이어서 다시 연장되고 역학이 반복됩니다. 반복 역학의 과정에서 번들 움직임은 근처의 액체를 교반하여 미크론 스케일 추적기로 도핑하여 시각화 할 수있는 흐름을 유도합니다(그림 1C). 산체스 외 및 헨킨 외. 추적자의 평균 속도를 특징으로, 속도는 아데노신 삼인산의 농도를 변화시킴으로써 조정되었다는 것을 발견 (ATP), 고갈제, 모터 클러스터, 및 MTs19,27. 그러나, 이러한 튜닝성은 활성 유체 합성 이전에만 존재하였다. 합성 후, 튜닝성이 손실되고, 유체는 자신의 방식으로 자체 조직. 합성 후 활성 유체 활성을 조절하기 위해, Ross.et al.은 모터 단백질의 광 활성화 이각을 이용하여 유체 활성을 광28을사용하여 온/오프로 조절할 수 있는 방법을 보고했다. 빛 제어는 유체를 국소적으로 활성화하는 측면에서 편리하지만, 이 방법은 현미경으로 광학 경로를 수정하는 것과 함께 모터 단백질의 구조를 재설계해야 합니다. 여기서, 우리는 모터 구조를 그대로 유지하면서 현미경 수정없이 유체 흐름을 국부적으로 제어하는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.

우리의 국소적인 활성 유체 흐름을 조정하는 방법은 키네신-MT 반응이 온도29,30,31,32와함께 증가하는 것으로 보고되었기 때문에 아레니우스 법칙에 기초한다. 우리의 이전 연구는 활성 유체 흐름의 평균 속도의 온도 의존성이 아레니우스 방정식을 따랐다는 것을 보여주었다: v = exp (-A/RT), 여기서 A는 사전 지수 인자, R은 기체 상수, E는활성화 에너지, 및 T는 시스템온도(33)이다. 따라서, 유체 활성은 온도 환경에 민감하고, 시스템 온도는 모터 성능을 안정화하기 위해 일관되어야 하며, 결과적으로, 유체 유동속도(34)가된다. 이 문서에서는 모터의 온도 의존성을 사용하여 시스템 온도를 조정하여 활성 유체의 유속을 지속적으로 조정하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 온도가 제어되는 현미경 단계에 샘플을 장착한 다음 활성 유체 샘플의 준비를 시연합니다. 온도를 16°C에서 36°C로 증가시키면 평균 유속이 4~8μm/s로 빨라지며, 또한 해석성은 가역적입니다: 반복적으로 온도를 증가시키고 감소시키면 순차적으로 가속화되고 감속됩니다. 입증된 방법은 MT 글라이딩 분석법29,30,31,32와같은 주요 반응이 아레니우스 법칙을 준수하는 광범위한 시스템에 적용가능하다.

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프로토콜

1. T의 준비

주의: 이 단계에서 우리는 소의 뇌 조직에서 수관을 정화합니다. 소 뇌는 변이체 크로이츠펠트 야콥 질환 (vCJD)35를일으킬 수 있습니다. 따라서, 뇌 폐기물 및 관련 솔루션, 병 및 파이펫 팁은 바이오 폐기물 봉투에 수거하여 기관의 규칙에 따라 생체 유해 폐기물로 폐기되어야 합니다.

  1. 소 뇌에서 튜불린을 정화 (카스놀디 등에서 수정36).
    1. 지역 도축장에서 대학 냉장실로 약 1.5kg의 신선한 소 뇌를 운반합니다. 수송 하는 동안, 인산 염 버퍼에 두뇌를 저장 (20 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 7.2) 얼음에.
      참고 : Tubulin의 최종 수율을 극대화하려면 신선한 뇌 조직에서 기능성 tubulin의 초기 양이 중요합니다. 신선한 두뇌는 더 많은 기능성 튜불린을 함유하고 있습니다. 도축장에서 가장 신선한 두뇌를 얻으려면, 우리는 가장 최근에 도살 된 소에서 뇌를 제공하기 위해 정육점을 요청하는 것이 좋습니다. 도살과 절차 시작 사이의 시간을 줄이면 더 나은 수율을 생성하기 때문에 뇌는 절차를 시작할 때 3 시간 보다 더 오래되어서는 안됩니다.
    2. 균질화하고 뇌를 명확히.
      1. 메스를 사용하여 혈관과 결합 조직을 더 작은 조각으로 자르고 손으로 뇌에서 제거하여 뇌를 청소하십시오.
        참고: 청소된 뇌는 분홍색이어야 합니다.
      2. 정제된 뇌 조직을 1킬로그램의 비중합체 완충제(DB: 50 mM2-(N-morpholino) 에탄설포닉산, 1 mMCaCl2,pH 6.6)에 담급니다.
      3. 주방 블렌더로 뇌를 균질화합니다.
      4. 10,000 x g 및 4°C에서 150분 동안 균질화된 뇌 용액을 원심분리기.
    3. 중합 MTs (첫 번째 중합).
      1. Collect and mix the supernatant with equal volumes of the following solutions at 37 °C: glycerol, high-molarity PIPES buffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM ethylene glycol-bis(β-aminoehyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid [EGTA], pH 6.9)
      2. 혼합물에 1.5 mM ATP 및 0.5 mM 구아노신 삼인산 (GTP)을 추가합니다.
      3. 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
    4. MT(첫 번째 MT 탈중합)를 중합합니다.
      1. 펠렛 MT를 151,000 x g 및 37°C에서 30분 동안 원심분리하였다.
      2. 상급을 버리고 4 °C DB의 10 mL에서 각 MT 펠릿을 다시 중단하십시오.
      3. 얼음에 30분 동안 배양합니다.
      4. MT 침전을 피하기 위해 파이펫 팁으로 5 분마다 혼합물을 교반하십시오.
        참고 : 혼합물은 MT 탈중합의 완료를 나타내는 30 분 안에 선명해야합니다.
    5. 중합 MTs (두 번째 MT 중합).
      1. 70,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 용액을 명확히하십시오.
      2. 37°C 글리세롤 및 HMPB의 동일한 부피로 상급체를 수집하고 혼합합니다.
      3. 혼합물에 1.5 mM ATP 및 0.5 mM GTP를 추가합니다.
      4. 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한다.
    6. 반복 단계 1.1.4, 브링클리 재조립 버퍼 (BRB) 80 (80 mM 파이프, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8)로 HMPB를 대체 한 다음 79,000 x g 및 30 분 동안 4 °C에서 원심 분리하여 클리어 된 혼합물을 명확히합니다.
    7. 상급을 수집합니다. 분광계로 280 nm 의 흡광도를 측정합니다. 맥주 램버트 법칙 (수관의 소멸 계수 : 1.15 (mg / mL)-1cm-1)37,38을사용하여 튜불린 농도를 결정합니다.
    8. 단백질을 -80°C에 보관하십시오.
  2. 회생 튜불린 (카스놀디 등에서 수정36).
    참고: 튜불린 순도를 향상시키기 위해 정제된 튜불린을 중합하고 다시 중합합니다.
    1. 정제된 투불린(단계 1.1.7)을 500 μM 디티오트레이톨(DTT) 및 20 μM GTP와 혼합한 다음 37°C에서 30분 의 배양물을 혼합하여 MT를 중합하였다.
    2. 펠트 는 MTs.
      1. 원심 분리기 튜브 의 바닥에 글리세롤 쿠션 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60 % v / v 글리세롤, pH 6.8)의 1 mL을로드합니다.
      2. 중합형 MT를 쿠션 위에 놓습니다.
      3. 37 °C에서 90 분 동안 172,000 x g의 원심 분리기.
    3. MT를 중합합니다.
      1. 상급 쿠션을 제거합니다.
      2. 4 °C MT 버퍼의 150 μL에서 각 MT 펠릿을 다시 일시 중단하십시오 (M2B : 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. 혼합물을 얼음에 30 분 동안 배양합니다.
      4. 5분마다 파이펫 팁으로 혼합물을 교반합니다. 혼합물은 분명해져야 합니다.
    4. 172,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 혼합물을 명확히합니다.
    5. 상급을 수집합니다. 단백질 농도를 측정합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
  3. 형광 염료39와함께 tubulin를 레이블.
    1. MTs.를 중합. 정제된 투불린(단계 1.1.7)을 500 μM DTT 및 16.7 μM GTP와 혼합하고, 37°C에서 30분 동안 혼합물을 배양한다.
    2. 펠트 는 MTs.
      1. 37°C 고pH 쿠션 1mL(0.1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v 글리세롤, pH 8.6)를 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      2. 중합된 TT를 쿠션 위에 놓습니다.
      3. 37 °C에서 50 분 동안 327,000 x g의 원심 분리기.
    3. 라벨 튜불린.
      1. 37°C 라벨링 버퍼의 700 μL로 각 MT 펠릿을 다시 일시 중단합니다(0.1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 40% v/v 글리세롤, pH 8.6).
      2. 서 스 펜 션을 혼합 10-20 멀리 빨간 형 광 염료의 초과 와 succinimidyl 에스테 르와 기능.
      3. MT가 형광 염료의 에스테 르와 반응할 수 있도록 어둠 속에서 30 분 동안 37 °C에서 혼합물을 배양.
      4. 50 mM K-글루타메이트로 현탁 염료의 에스테르를 포화시키고 37°C에서 5분 동안 배양하여 라벨링 반응을 중단한다.
    4. 라벨이 붙은 MTs: 반복 단계 1.3.2, 낮은 pH 쿠션으로 높은 pH 쿠션을 대체 (80 mM 파이프, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v 글리세롤, pH 6.8).
    5. MT를 중합합니다.
      1. 상급과 쿠션을 버리십시오.
      2. 펠렛을 4°C M2B의 700 μL로 다시 놓습니다.
      3. 얼음에 현탁액을 배양.
      4. 용액이 명확해질 때까지 파이펫 팁으로 5분마다 교반합니다.
    6. 184,000 x g 및 4 °C에서 35 분 동안 원심 분리하여 제거 된 용액을 명확히하십시오.
    7. 1.2.1-1.2.4 단계를 반복하여 표지된 튜불린 용액의 순도를 향상시킵니다.
    8. 단백질과 형광 염료의 농도를 측정합니다. 이러한 측정을 사용하여 형광 염료와 관불린의 농도 비율로 정의된 수관 농도와 표지된 수관의 분율을 결정합니다.
    9. 표지된 튜불린 용액을 -80°C에 보관하십시오.
  4. MT를 중합 (산체스 외 에서 채택19):
    1. 재활용 된 tubulin (단계 1.2.5)을 라벨이 붙은 튜불린 (단계 1.3.9)과 3 % 라벨이 붙은 튜눌린 분획을 생성하는 비율로 혼합하십시오.
    2. 8 mg/mL 튜불린 혼합물을 1 mMM DTT 및 0.6 mM guanosine-5'[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트(GMPCPP)와 37°C에서 30분 간 배양합니다.
    3. 배양 후, MTs를 6시간 동안 어둠 속에서 실온에서 어닐린.
    4. 알리쿼트 및 -80 °C에서 저장합니다.

2. 키네신 클러스터 합성

참고 : 박테리아는 유비쿼터스로 존재하고 매체에서 성장하고 준비 과정을 오염 시킬 수 있습니다. 오염을 방지하기 위해, 세포 배양과의 접촉 (예를 들어, 파이펫팅)과 관련된 행동은 화염 근처에서 수행되어야합니다. 플라스크, 파이펫, 파이펫 팁, 매질 및 플레이트와 같은 공구는 사용하기 전에 오토클레이브해야 합니다.

  1. 에스케리치아 대장균40에서키네신 모터를 익스프레스.
    1. 셀을 변환합니다.
      1. K401-BCCP-H6 플라스미드의 피펫 1 μL을 관할 세포의 10 μL내로 하였다.
      2. 얼음에 5분 동안 배양합니다.
      3. 45s에 대한 42.5 °C에서 열 충격.
      4. 세포를 얼음 위에 2분 동안 배양하여 회복을 허용합니다.
      5. 항생제가없는 2XYT (5 g / L NaCl, 10g / L 효모 추출물, 16 g / L 트립톤)의 300 μL과 세포를 섞습니다.
      6. 1 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다.
        참고: 지정하지 않는 한, 인큐베이션 중에 세포 성장을 모니터링할 필요가 없습니다.
    2. 플레이트 미디어를 접종합니다.
      1. 2XYT 플레이트 (10 g / L NaCl, 5 g / L 효모 추출물, 10 g / L 트립톤, 15 g / L 한천, 100 μg / mL 암피실린, 25 μg / mL 클로람페니콜)에 세포 배양을 확산시다.
      2. 밤새 37°C에서 접시를 거꾸로 배양합니다.
    3. 액체 매체를 접종합니다.
      1. 하룻밤 접시에서, 파이펫 팁으로 하나의 고립 된 식민지를 수확.
      2. 팁을 2XYT 50mL가 들어 있는 플라스크에 꺼넣습니다.
      3. 배양하고 12-16 시간 동안 37 °C 및 200 rpm에서 배양 배지를 흔들어.
    4. 셀을 확장합니다.
      1. 2XYT의 500 mL에서 세포 배양의 2.5 mL를 혼합합니다.
      2. 37°C에서 500 mL 배양을 교양하고 3-6시간 동안 250 rpm을 교반한다.
    5. 단백질 발현을 유도합니다.
      1. 인큐베이션 동안, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 성장을 모니터링하고, 2XYT를 기준으로 사용한다. 60분마다 OD600 = 0.3에 도달할 때까지 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 0.5-0.6에 도달할 때까지 30분마다 흡광도를 측정합니다.
      2. 흡광도가 OD600 = 0.5-0.6에 도달할 때까지 세포가 자랄 수 있도록 허용
      3. 세포 배양에 24 μg/mL 비오틴과 1 mMM isopropyl β-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가합니다.
        참고: IPTG는 비오틴 카르복실 담체 단백질(BCCP) 및 6개의 히스티딘(H6)으로 태그가 지정된 키네신 모터의 단백질 발현을 유도하는 데 사용됩니다. H6 태그는 정제 공정(단계 2.2)에 사용되고, BCCP는 첨가된 비오틴 분자에 결합하여 발현된 키네신 모터를 바이오티니레이트한다.
      4. 12-20 시간 동안 20°C 및 250 rpm에서 세포 배양을 배양하고 흔든다.
    6. 5,000 x g 및 4 °C에서 원심분리하여 세포를 10 분 동안 수확하십시오. 세포 펠릿을 -80°C에 보관합니다.
  2. 키네신 모터 단백질을 정화 (Spriestersbach 외 에서 수정41):
    1. 용해 완충액 (50 mM PIPES) 동일한 부피로 세포 펠릿 (단계 2.1.6)을 일시 중단하십시오. 4 mM MgCl2,50 μM ATP, 10 mMM 2-메르카포에탄올 (βME), 20 mM imidazole, pH 7.2), 프로테아제 억제제 1 정, 페닐메틸 설포닐 불소 2 mg (PMSF) 및 리소자이므 2 mg을 추가합니다.
    2. 액체 질소 (LN) 3x에서 플래시 동결하여 세포를 용해시키고 세포 혼합물을 해동합니다.
      참고 : 용해 후, 혼합물은 점성이되어야한다.
    3. 용해 된 세포 혼합물을 230,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 명확히합니다.
    4. 상한을 수집하고 중력 열을 통해 흐르고 10 mL의 용해 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
      참고: 키네신 K401-BCCP-H6와 같은 H6 태그가 있는 단백질은 열에 남아 있어야 합니다.
    5. 5 mL의 용출 완충액으로 태그된 단백질을 용출(50 mM PIPES, 4 mMMgCl2,50 μM ATP, 500 mM 이미다졸, pH 7.2). 1 mL 분획에서 순차적으로 흐름을 수집합니다. 단백질 함유 분획을 결정하려면 각 분획의 3 μL을 트리페닐메탄 염료 100 μL과 혼합합니다. 단백질 함유 분획은 파란색으로 바뀝니다. 이러한 분획을 결합하고 5배씩 lysis 버퍼로 희석합니다.
    6. 단백질 용액을 농축하십시오.
      1. 용액을 원심 필터 튜브에 적재합니다.
      2. 3,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.
      3. 튜브를 부드럽게 흔들고 용액 부피가 <3 mL이 될 때까지 다시 원심 분리기를 합니다.
    7. 분광계 (소멸 계수 : 0.549 (mg / mL)-1cm-1)42,43로단백질 농도를 측정합니다. 단백질을 1 mg/mL로 희석하고 35% w/v 자당을 첨가하십시오.
    8. -80 °C에서 보관하십시오.
  3. 전기 동공 겔로 키네신 농도를 측정합니다 (Taylor et al.44에서변형).
    참고 : 전기 동아용 젤로 키네신 농도를 측정하기 위해, tubulin은 분광계(그림 2A)36을통해 높은 순도와 측정 가능한 농도 때문에 이상적인 농도 사다리입니다.
    1. 0.25, 0.5, 0.75, 1.00 및 1.25 mg/mL의 농도로 튜불린 샘플을 준비합니다. 각 튜불린 시료와 키네신 시료(단계 2.2.8)의 15 μL을 5 μL의 샘플 버퍼(200 mM Tris-HCl, 8% 나트륨 도데실 황산염(SDS), 400 mM DTT, 0.2% 브로모페놀 블루, 40% 글리세롤, pH 6.8및 90°C의 분수로 별도로 혼합합니다.
    2. 전기 동극을 준비하십시오.
      1. 전기 동공 젤을 젤 상자에 잠급기.
      2. 실행 버퍼로 상자를 채웁니다 (50 mM MOPS, 50 mM Tris 염기, 0.1 % SDS, 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA), pH 7.7).
        참고: 버퍼 수준이 젤의 상단 개구부 위에 있는지 확인합니다.
    3. 단백질 표준 사다리, 튜불린 샘플 및 키네신 샘플 10 μL을 별도의 우물에 넣고 젤 전체에 200V를 45분 동안 적용합니다.
    4. 젤 염색.
      1. 끓인 (약 95 °C) 얼룩 액 A (0.5 g / 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산, 25 % 이소 프로판올)를 5 분 동안 배양하고 젤을 탈온화 (DI) 물로 헹구고.
      2. 얼룩 용액 B (0.05 g / L 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산, 10 % 이소 프로판 올), C (0.02 g / L 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산), 및 D (10 % v / v 아세트산)를 순차적으로 반복하십시오. 밤새 DI 물에 겔을 인큐베이션하고 바위.
    5. 젤을 스캔합니다. 젤 이미지를 그레이스케일 이미지로 변환한 다음 흑백 반전 및 대비 향상을 통해 검정 색 배경에서 밝은 단백질 밴드를 표시합니다.
    6. 픽셀 값을 합산하여 각 밴드의 밝기를 측정합니다. 선형 맞춤 C = aB + b를적용하면 B는 튜불린 밴드의 밝기이고 C는 해당 농도이고 a와 b는 피팅 매개변수입니다. 키네신 밴드 Bk의 밝기를 이용하여 키네신 Ck의 농도를 결정하여 선형 방정식을 계산한다: Ck = aBk + b.
  4. 키네신 모터를 클러스터합니다.
    1. 1.5 μM 키네신(단계 2.2.8)을 120 μM DTT 및 120 nM 스트렙타비딘과 혼합합니다. 얼음에 30분 동안 배양합니다.
    2. -80 °C에서 보관하십시오.

3. 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드 및 커버슬립 준비 (Lau 등45에서수정)

  1. 새 유리 슬라이드와 유리 커버슬립을 해당 용기에 적재합니다. 슬라이드와 커버슬립을 DI 물에 1% v/v 세제에 담근 다음 전자레인지에서 끓입니다.
  2. 슬라이드와 커버슬립을 5분 동안 초음파 처리한 다음 DI 물로 헹구어 세제를 제거합니다.
  3. 5분 동안 에탄올에 슬라이드와 커버립을 담그고 초음파 처리합니다.
  4. 100 mM의 수산화 칼륨 (KOH)에서 슬라이드와 커버 립을 5 분 동안 침수하고 초음파 처리하십시오.
  5. 슬라이드와 커버슬립을 실란 용액(1% 아세트산 및 0.5% 3-(트리메톡시실릴)에서 에탄올로 15분 동안 인큐베이션한 다음 DI 물로 헹구십시오.
  6. 아크릴아미드 용액에 슬라이드와 커버립을 배양 (2% w / w 아크릴아미드, 0.7 mg / mL 암모늄 황산염, 및 0.0035 % v / v / v TEtramethylethylenediamine DI 물) ≥ 3 시간.
  7. 슬라이드와 커버립을 아크릴아미드 용액에 보관합니다.

4. 키네신 구동, MT 기반 활성 유체 준비

  1. 활성 유체를 준비합니다 (산체스 외19에서수정).
    참고: 다음 단계는 예제 스톡을 사용하여 활성 유체의 100 μL을 준비하는 과정을 보여 줍니다. 최종 부피는 확장 가능하며, 각 성분의 최종 농도가 유지되는 한 예제 스톡의 농도를 조정할 수 있습니다.
    1. 16.7 μL의 8 mg/mL MTs(단계 1.4.4)를 6.7 μL의 1.8 μL의 키네신 모터 클러스터(단계 2.4.2)와 고염 M2B(M2B + 3.9 mM MgCl2)에서500 mM DTT의 1.1 μL을 혼합합니다.
    2. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 w / w 7 %의 11.4 μL을 추가하여 번들 MTs.
    3. 50 mM ATP의 2.8 μL을 추가하여 키네신 모터를 활성화합니다.
    4. 2.8 μL의 스톡 피루바테 키나아제/젖산 탈수소효소(PK/LDH) 및 200 mM 인스페놀 파이루바트(PEP)의 13.3 μL을 첨가하여 ATP 농도를 유지합니다.
    5. 20 mM 트롤록스 10 μL, 3.5 mg/mL 카랄라제 1.1 μL, 20 mg/mL 포도당 산화아제 1.1 μL, 300 mg/mL 포도당의 1.1 μL을 추가하여 광표백 효과를 줄입니다.
    6. 0.025% v/v 트레이서 입자의 1.6 μL을 추가하여 유체의 움직임을 추적합니다.
    7. 고염 M2B를 첨가하여 총 부피가 100 μL입니다.
      참고: 4.1.1-4.1.6 단계의 혼합 주문은 상호 교환이 가능합니다. 그러나 ATP, MT 및 모터가 혼합되면 모터는 ATP를 소모하기 시작하고 MT를 따라 밟습니다. 제한된 연료(ATP 및 PEP)로 인해 샘플이 유한수명으로 활성화되므로 실험을 신속하게 시작해야 합니다. 최종 활성 유체에는 1.3 mg/mL MT, 120 nM 키네신 모터 클러스터, 5.5 mM DTT, 0.8% w/w PEG, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM 트록스, 0.038 mg/mL 카탈라제, 0.22 mg/mL 포도당 산화제, 3.3 mg/mL 포도당, 0.0004% v/v 콜로이드.
  2. 흐름 채널에서 샘플을 준비 (찬드라카르 등에서 수정46):
    1. 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드와 커버슬립(3.7단계)을 DI 물로 헹구십시오. 가압 공기로 안경을 말립니다. 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.
    2. 3mm 너비와 유리 커버 슬립 (20mm)과 동일한 길이로 왁스 필름 두 스트립을 잘라냅니다. 슬라이드와 커버슬립 사이에 스트립을 채널 스페이서로 삽입합니다.
    3. 왁스 필름에 유리를 부착하여 80°C 핫 플레이트에 유리 왁스 복합체를 놓고 왁스를 녹입니다. 녹는 동안 피펫 팁으로 커버슬립을 부드럽게 눌러 왁스 필름을 유리 표면에 균일하게 부착합니다. 접착 후 유리 복합체를 실온으로 식힙니다.
    4. 활성 유체(단계 4.1)를 유동 채널에 로드합니다. UV 접착제로 채널을 밀봉합니다.

5. 제어 샘플 온도

  1. 온도 제어 설정을 구축 (Lowensohn 외 및 우 등47,48,49의설계에서 수정).
    1. 알루미늄 냉각 블록을 준비합니다.
      1. 약 30mm × 30mm × 5mm의 치수로 알루미늄 판을 밀링하십시오.
      2. 플레이트(그림 3A)를통해 내부 채널을 드릴링하고 채널 끝에 호스 피팅을 설치합니다.
      3. 각 피팅을 워터 튜브에 연결합니다.
      4. 한 튜브를 물 저장고의 수조 펌프에 연결하고 다른 튜브를 저수지로 확장합니다.
        참고 : 펌프는 약 실온에서 블록 온도를 유지하기 위해 알루미늄 내부 채널을 통해 저수지 물을 순환합니다.
    2. 열전 냉각기(TEC)와 써모센서를 온도 컨트롤러에 연결합니다. USB 포트를 사용하여 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다(그림3B).
    3. 온도 컨트롤러를 직접 전류(DC) 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 전기 콘센트에 연결하여 컨트롤러를 켭니다.
    4. 컨트롤러 제조업체 의 가이드에 따라 TEC의 초기 설정을 수행합니다. TEC 출력을 테스트합니다. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어를 통해 온도 컨트롤러를 제어하여 열센서 데이터 기록및 온도 컨트롤러의 조작을 쉽게 할 수 있습니다.
    5. TEC의 가열 및 냉각 측면을 식별합니다.
    6. 열 페이스트를 사용하여 TEC의 냉각 면을 냉각 블록(단계 5.1.1)에 부착합니다.
    7. 열 페이스트를 사용하여 TEC의 가열 면에 사파이어 디스크를 부착합니다.
    8. 설정이 완료되었습니다. 사파이어 표면과 써모센서는 시료에 접촉하여 온도 및 목표 온도에 따라 시료를 냉각및 가열할 수 있습니다.
      참고: TEC 및 냉각 블록에는 밝은 필드 현미경 검사법을 사용하여 샘플을 이미징하기 위한 중앙 구멍이 정렬된 것이좋습니다(그림 3C).
  2. 온도 제어 설정을 사용하여 샘플 온도33을제어합니다.
    1. 샘플을 설정에 장착합니다.
      1. 활성 유체 샘플(4.2.4단계)을 슬라이드 면이 표면에 닿는 사파이어 표면에 놓습니다.
      2. 용지 테이프로 유리 슬라이드를 고정합니다.
      3. 구리 테이프를 사용하여 써모 센서를 커버슬립 표면에 부착합니다.
    2. 커버슬립 면이 목표를 향하도록 현미경 스테이지에 설치를 장착합니다. 예를 들어, 거꾸로 된 현미경에서 커버슬립 면은 아래를 향해야 합니다. 해당하는 경우 종이 테이프와 현미경 스테이지 바늘 클램프로 설정을 고정하십시오.
      참고: 제시된 온도 단계는 반전되거나 똑바로 서 있는 일반적인 현미경으로 작동해야 합니다. 실험 중에 온도 단계가 이동되지 않도록 하려면 테이프로 온도 단계를 현미경 단계로 고정하는 것이 가장 좋습니다.
    3. 샘플 온도를 제어합니다.
      1. 온도 컨트롤러와 어항 펌프를 켭니다.
      2. 제조업체 의 가이드에 따라 목표 온도를 설정하고 온도 제어를 활성화합니다. 컨트롤러는 열센서에 의해 평가된 대로 목표 온도및 샘플 온도에 따라 가열 또는 냉각 전력을 조정합니다.
    4. 샘플 온도를 기록합니다.
      1. 실험 중 열센서 온도 데이터를 기록하려면 제조업체 의 가이드를 따르십시오.
        참고: 이제 샘플 온도는 컨트롤러에 의해 제어되고 컴퓨터에 의해 기록되어야합니다(그림3D).

6. 활성 유체 활성을 특성화 (헨킨 외 및 우 외20,27에의해 방법에서 수정)

참고: 이전 섹션은 활성 유체 샘플(섹션 1-4)을 준비하고 온도를 제어하는 데 사용됩니다(섹션 5). 활성 유체 활동을 제어하기 위해 온도사용을 입증하려면 유체 거동을 관찰하고, 활동을 분석하고, 온도에 대한 반응을 특성화합니다.

  1. 추적자를 모니터링합니다.
    1. 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 사용하여 일정한 간격Δt로 샘플을 이미지화하여 트레이서 입자의 움직임을 포착합니다.
      참고: 추적자 이동을 추적할 수 있도록 Δt를 선택해야 합니다. 100s와 같은 큰 Δt 값은 추적 궤적을 잃게 되는 반면 0.1s와 같은 짧은 Δt 값은 추적 알고리즘이 프레임 간의 추적자 이동을 감지하지 못하게 합니다. 작업 Δt는 프레임 사이의 추적자 변위를 ~9픽셀 이내로 허용해야 합니다. 4x 대물렌즈를 사용하여 10 μm/s로 움직이는 이미징 트레이서의 경우 Δt는 1-5s로 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 이미지를 TIFF 파일로 저장하고 프레임 번호를 기반으로 파일이름을 지정하고 별도의 폴더에 저장합니다. 이러한 프로세스는 제공된 MATLAB 스크립트(6.2.2단계)로 획득한 이미지를 올바르게 분석할 수 있도록 하는 데 필요합니다.
  2. Ouellette 등50,51에의해 개발 된 추적 소프트웨어를 채택 추적 추적 :
    1. 스탠포드 대학 (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml)의 환경 복잡성 연구소에서 추적 소프트웨어를 다운로드하십시오. 각 MATLAB 파일이 동일한 폴더에 있는지 확인합니다.
    2. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 추적자를 추적 particle_tracking합니다. 스크립트는 추적자 이미지 (단계 6.1)를 읽고 Ouellette 등50,51의소프트웨어를 사용하여 추적자 움직임을 추적합니다. 1) 이미지 배경을 나타내는 1) background.tif, 2) 각 프레임의 파티클 궤적및 속도를 포함하는 Tracking.mat의 두 파일을 출력합니다(그림4A).
  3. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 추적기 평균 속도를 분석합니다. 스크립트는 추적 파일(Tracking.mat)을 읽고 추적자 대 시간의 평균 속도를 출력하고 지정된 평균 창(그림 4B)33을사용하여 평균 평균 속도를 출력합니다.
  4. 시간 평균 평균 속도를 기록합니다.
  5. 10-40°C에서 실험(4단계, 5.2단계 및 6.1-6.4단계)을 반복하여 시간 평균 평균 속도를 측정합니다. 기록된 평균 속도를 사용하여 평균 속도 대 온도를 플로팅합니다(그림4C)33.

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결과

키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 준비하려면 키네신과 MT가 모두 필요합니다. MT는 소 뇌로부터 정제된 표지된 tubulins(단계 1.3 및 1.4)로부터 중합되었고(단계 1.1, 도 2A),순도 향상을 위해 재활용(단계 1.2, 도 2B). 키네신 운동 단백질은 대장균(단계 2.1 및 2.2단계, 도 2B)41,52에서발현 및 정제하였다. 제조된 키네신 스톡의 농도는 주요 밴드 밝기와 재활용 된 튜불린의 밝기를 공지된 농도와 비교하여 SDS 겔로 측정하였다(단계 2.3, 도 2B

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토론

장소에서 활성 물질을 제어하는 것은 활성 물질의 지시 자기 조직에 문을 엽니 다4,5,24,28,54. 본 기사에서는, 시스템29,30,31의아레니우스 특성에 기초하여, 온도를 이용하여 키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 동위내로 제어하는 프로토콜을 제시한다. 시스템은 단백질 기반이기 때문에 실험 전반에 걸쳐 단백질 기능을 유지하는 것이 프로토콜을 성공적으로 적용하는 데 중요합니다. 시스템의 주요 단백질은 MTs와 키네신 클러스터입니다. 전자는 16 °C 이하의 중합체화되고...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

플라스미드 K401-BCCP-H6는 즈보니미르 도딕 박사의 선물이었습니다. 이 연구는 우스터 폴리 테크닉 대학에서 박사 쿤 타 우의 창업 기금에 의해 지원되었다. 우리는 튜불린을 정화하고 라벨링하고 활성 유체를 합성하는 프로토콜에 대한 Zvonimir Dogic 박사에게 감사드립니다. 우리는 단백질 발현 및 정제에 대한 그의 전문 지식에 대한 마크 리딜라 박사에게 감사드립니다. 윌리엄 벤자민 로저 박사님이 온도 조절 스테이지를 구축할 수 있도록 도와주신 것에 대해 감사드립니다. 당사는 생물학적 물질 시설(BMF)의 사용에 대해 Brandeis MRSEC(NSF-MRSEC-1420382)를 인정합니다. 우리는 연약한 물질에베이트 외의 수치를 적응하기위한 화학의 왕립 학회를 인정33.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(&플러스mn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, 사파이어 창Edmund Optics43-637사파이어 디스크
3M 1181 구리 테이프 - 1/2 IN 너비 X 18 YD 길이 - 2.6 MIL 총 두께 - 27551R.S. HUGHES054007-27551구리 테이프
아세트산Sigma-AldrichA6283
아크릴아미드 용액 (40%/전기영동), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
아데노신 5'-트리포스페이트 디칼륨 염 수화물Sigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS 에스테르(숙시니미딜 에스테르)Thermo Fisher ScientificA20006원적외선 형광 염료. Alexa 647은 미세소관(1.3.3.2)과 혼합하기 전에 디메틸설폭사이드(DMSO)에 미리 현탁할 수 있습니다.
Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛Sigma-AldrichUFC801024원심 필터 튜브. 컷오프 분자량: 10kDa
과황산암모늄, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
암피실린 나트륨염(결정성 분말), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760암피실린
방진 테이블Nikon63-7590S
Avanti J-E 원심분리기Beckman Coulter369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
양동이-플라스틱 흰색 - 2 갤런Bon84-715물 양동이
염화칼슘Sigma-Aldrich746495CaCl2
소 간에서 카탈라제Sigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x 공기 대물렌즈
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP 필터 큐브
CH-109-1.4-1.5TE 기술CH-109-1.4-1.5열전 냉각기(TEC)
클로람페니콜, 98%, ACROSOrganics Fisher ScientificC0378
냉각 블록N/AN/A맞춤형 밀링 알루미늄
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400트리페닐메탄 염료
D-(+)-글루코스시그마-알드리치G7528
디메틸설폭사이드(ACS 인증), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-디티오트레이톨, 99%, 생화학용, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 방열판 화합물Dow1446622Thermal
paste ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05에탄올
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산시그마-알드리치E3889EGTA
에틸렌디아민테트라아세트산시그마-알드리치798681EDTA
Fisher BioReagents 미생물학 매체 첨가제: TryptoneFisher ScientificBP1421트립톤
Fisher BioReagents 미생물학 매체 첨가제: 효모 추출물Fisher ScientificBP1422효모 추출물
Fluorebrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µ mPolysciences18861추적자 입자
Aspergillus niger의 포도당 산화효소Sigma-AldrichG2133
글리세롤Sigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5'[ (&알파;,&베타;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power의 18 게이지(True American Wire Ga), 100피트, 99.9% 좌초 무산소 구리 OFC, 자동차, 오디오, 홈 시어터용 레드/블랙 2 도체 본딩 지퍼 코드 전원/스피커 전기 케이블아마존B07428NBCW
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물시그마-알드리치G8877GTP
Hellmanex III시그마-알드리치Z805939세제
HEPES 나트륨 염 (백색 분말), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
고성능 블렌더 기계AIMORESAS-UP1250블렌더
His GraviTrapGE 헬스케어11003399중력 기둥
이미다졸시그마-알드리치I5513
IPTG시그마-알드리치I6758이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드
이소프로필 알코올 99%Pharmco by Greenfield Global231000099이소프로판올
JA-10 로터Beckman Coulter369687
L-글루탐산 칼륨염 일수화물Sigma-AldrichG1501K-글루타메이트
라이소자임Sigma-AldrichL6876
마그네슘 클로라이드 육수화물Sigma-AldrichM2670MgCl2• 6H2O
MES 나트륨 염시그마-알드리치M50572-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨 염
MOPS시그마-알드리치M12543-(N-모르폴리노)프로판설폰산
MP-3022TE 기술MP-3022열전대
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 99%, 아크로스 오가닉스피셔 사이언티픽AC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS 분광 광도계Thermo Fisher ScientificE112352분광계
Nikon Ti2-E Nikon 도립 현미경NikonMEA54000
Norland 광학 접착제 81Norland 제품NOA81UV 접착제
Novex Sharp Pre-stained Protein StandardThermo Fisher ScientificLC5800단백질 표준 사다리
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 젤, 1.5mm, 10웰Thermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS 젤
Optima L-90K 초원심분리기Beckman Coulter365672
Parafilm PM996 랩, 4" 와이드; 125 Ft/RollCole-ParmerEW-06720-40왁스 필름
Pe 300 울트라 일루미네이션 시스템 싱글 밴드, 3mm 라이트 가이드 제어 포드 전원 공급 장치NikonPE-300-UT-L-SB-40쿨 LED 조명기
페닐메탄설포닐 플루오라이드시그마-알드리치78830PMSF
포스포에놀피루브산 모노칼륨염, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie(Bradford) 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23200
Pierce 프로테아제 억제제 미니 정제Thermo Fisher ScientificA32953
파이프: 시그마 - 알드리치P67571,4- 피페 라진 디에 탄 술폰산
플루 로닉 F-127시그마 - 알드리치P2443
폴리 (에틸렌 글리콜)시그마 - 알드리치81300PEG. 평균 분자량 20,000 Da
수산화칼륨 (펠릿/인증 ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W 전원 공급 장치(115VAC)ThermoFisher ScientificPS0300젤 박스의 DC 전원 공급 장치
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4A온도 조절기
의 DC 전원 공급 장치토끼 근육의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소Sigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard 분수 펌프, 시간당 296갤런AmazonB005JWA612어항 펌프
Rosetta 2(DE3)pLysS 유능한 세포 - NovagenMillipore Sigma71403유능한 세포
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W 조리대 전자 레인지, 0.9 입방 피트, 스테인리스 스틸AmazonB01MT6JZMR물을 끓이기 위한 전자레인지
염화나트륨(결정질/인증 ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
도데실황산나트륨시그마-알드리치L3771SDS
인산나트륨 일염기성 시그마-알드리치S8282NaH2PO4
스트렙타비딘 단백질Thermo Fisher Scientific21122
설탕시그마-알드리치S7903
TC-720TE 기술TC-720온도 컨트롤러
트리스 베이스, 분자 생물학 등급 - CAS 77-86-1 - Calbiochem시그마-알드리치648310트리스-HCL
유형 45 Ti 로터Beckman Coulter339160
유형 70 Ti 로터Beckman Coulter
Type 70.1 Ti 로터Beckman Coulter342184
VWR 범용 실험실 라벨링 테이프VWR89097-916종이 테이프
VWR 마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1 1/2VWR48366-227유리 커버 슬립
VWR 일반 및 젖빛 마이크로 슬라이드, 프리미엄VWR75799-268유리 슬라이드
XCell SureLock 미니 셀ThermoFisher ScientificEI0001젤 상자
ZYLA 5.5 USB3.0 카메라NikonZYLA5.5-USB3흑백 CCD 카메라
선 닭 달걀 흰자위의 337922

참고문헌

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