혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Yong Wang; Ding Zhang; Fang Zhou; Meijun Zhou; Qiujie Li; Jingyu Chen; Jun Yang

doi:10.3791/60498

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방법 논문

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

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DOI:

10.3791/60498

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2020년 5월 28일

Yong Wang^*¹ , Ding Zhang^*² , Fang Zhou² , Meijun Zhou² , Qiujie Li¹ , Jingyu Chen³ , Jun Yang¹^,²

¹Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, ²Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, ³Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.

초록

혈관 발달은 특정 유전자의 순차적 발현에 의해 결정되며, 이는 상이한 발달 단계 동안 제브라피시의 실화 혼성 분석실험에서 수행함으로써 연구될 수 있다. 유전 출혈성 모두랑성 말단확장증 (HHT)의 발달 도중 혈관 형성에 있는 endoglin (eng)의 역할을 조사하기 위하여는, zebrafish에 있는 eng의 모르폴리노 중재한 표적 녹다운은 그것의 측두식 및 관련 기능을 공부하기 위하여 이용됩니다. 여기서, 제브라피시 배아에서 의 eng 및 그 하류 유전자의 분석을 위해 위시(WISH)의 전체 마운트가 채용된다. 또한, 튜브 형성 은 HHT 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 에서 수행 -분화 내피 세포 (iPSC-ECs; eng 돌연변이와 함께). 전체 양을 사용하는 특정 신호 증폭 시스템 인 시투 하이브리드화 – WISH는 기존 방법에 비해 더 높은 해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 더 나은 신호를 얻기 위해, 포스트 픽스레이션 시간은 프로브 혼성화 후 30분으로 조정된다. 형광 염색은 제브라피시 배아에 민감하지 않기 때문에, 여기에서 염색하는 디아미노베지딘(DAB)으로 대체된다. 이 프로토콜에서, eng 돌연변이를 포함하는 HHT 환자 유래 iPSC 라인은 내피 세포로 분화된다. 37°C에서 30분 동안 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅한 후, iPSC-EC는 웰내로 단층으로 시드되고 3시간 동안 37°C에서 유지된다. 그런 다음, 튜브 길이와 가지의 수는 현미경 이미지를 사용하여 계산된다. 따라서, 이러한 개선된 WISH 프로토콜을 통해, 감소된 eng 발현이 제브라피시 배아에서 내피 전구 형성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이것은 HHT를 가진 환자에게서 파생된 iPSC-EC를 사용하여 관 대형 검역에 의해 추가확인됩니다. 이러한 해약은 초기 혈관 발달에서 eng에 대한 역할을 확인한다.

서론

eng (CD105)에 단 하나 돌연변이는 HHT를 가진 환자에서 보고되었습니다. 돌연변이는 증가된 EC 증식 및 감소된 유동 매개 EC 신장^1,^,^2로이어집니다. 또한 이전에 는 ENG 결핍이 제브라피시^3에서내피 마커 발현(즉, kdrl, cdh5, hey2)을감소시킨다고 보고되었다. Endoglin,주로 내피 세포에서 발현, 막 막 당단백질 및 성장 인자 β (TGF-β) 가족 구성원을 변형시키기위한 공동 수용체로서의 기능. 그것은 ECs ^4를향해 줄기 세포 분화를 유도하기 위하여 Id1 발현을 포함하여 다운스트림 유전자를 통제하기 위하여 세포 표면에 BMP9 결합을 지시합니다. 따라서, eng 유전자는 혈관 발생 및 인간 혈관 질환^5,^,^6에서중요한 역할을 한다. 우리는 이전에 eng 돌연변이를 품고 HHT 환자에게서 취득한 iPSCs 파생된 ECs의 분석에 선행된 zeb....