Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

요약

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

초록

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 생체 내에서 백혈구 모집 계단식 내의 생리적 및 병리생리학적 과정을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 현재 프로토콜은 마우스의 손상되지 않은 유기체 내에서 골격 근 유래 조직에서 백혈구 모집으로 이어지는 백혈구 내피 상호작용을 시각화하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 나타낸다. 이 모델은 과립구 활성화와 질병에서의 역할에 초점을 맞춘 모든 연구 분야에 적용됩니다.

우리는 방법을 안내하고 잠재적 인 함정과 기술적 인 어려움을 강조하기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험 설정 및 필수 물질, 마우스 마취, 크레마스터 근육 의 해부뿐만 아니라 기관 및 경동맥 통조림, IVM 기록 및 오프라인 분석을 다룹니다. 부착 백혈구, 롤링 플럭스(RF) 및 롤링 플럭스 분획(RFF)과 같은 데이터 형식에 대해 자세히 설명하고 적절한 응용 분야에 대해 설명합니다. 디스트로핀 결핍 mdx 마우스로부터의 대표적인 결과는 결과 섹션에 제공된다.

IVM은 생체 내 환경에서 백혈구 모집을 평가하는 강력한 도구입니다. 그러나, 예를 들어 내피 및 백혈구 기능을 delineating 유동 챔버 실험과 같은 전 생체 설정과 조합을 요구할 수 있습니다. 더욱이, 관심 있는 동물의 유전적 배경은 기준선 모집에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 제공된 프로토콜의 개별적인 미세 조정을 요구한다. 그것의 한계에도 불구하고, IVM은 살아있는 척추 동물 유기체로 시험관 내 사실 인정을 쉽게 번역하는 단상으로 봉사할 수 있습니다.

서론

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 백혈구 생물학의 필드에 있는 일반적으로 적용되는 공구입니다. 백혈구 모집은 백혈구 포획, 압연 및 내피 벽에 의한 접착에 의해 시작된 잘 정의된 사건의 연속을 따르며, 마지막으로 염증의 실제 부위로 백혈구의 이주 및 사치를^{이월한다 1.} 각 단계는 다양한 케모카인(예를 들어, IL-8/CXCL8), 수용체(예를 들어, LFA-1, Mac-1) 및 상응하는 내피 세포 접착 분자(예를 들어, ICAM-1, VCAM-1 및 E-Selectin)에 의해 매개및 조절된다^2,,3. 상이한 조절 부위의 상호작용은, 백혈구 모집의 조절인자 및 중재자가 고급 당화 말단 제품(RAGE), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), C-X-C 모티프 리간드(CXCL)1/2 및 수용체 CXCR2를 사용하여 IVM^{,4,5,6,6,,7,,}

프로토콜

동물은 IBF(인터파쿨테르 바이오메디치니쉬 포르충세인리히퉁), 하이델베르크에서 통제되고 특정 병원균이 없는 조건 하에 수용되었다. 여기에 설명된 모든 절차는 현지 IRB와 독일 바덴뷔르템베르크의 레히에룽스프라에시듐 카를스루에에 의해 승인되었습니다.

1. 마취 관리

1. 125 mg/kg 케타민과 12.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 (즉) 볼러스 주사로 마우스를 마취시다.
2. 마우스의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 상에 등쪽 재배치 위치에 마우스를 놓고 고정합니다(36.5-38°C). 흡수되지 않는 멸균 봉합사(6/0)를 사용하여 정면 치아 주위의 간단한 루프를 감고 봉합사의 접합 끝을 가열 패드에 테이프로 테이프로 보입니다. 이 고정은 호흡에 있는 방해를 피하기 위하여 입을 열어 두는 것을 목표로 합니다.
3. 디지털 발가락 핀치에 의해 마취의 적절한 깊이를 마우스를 확인 (철수는 볼 수 없습니다).
4. 충분한 마취에 도달하면 외과 준비를 진행합니다. 진행 중인 실험을 따라 30분마다 반복적으로 마취를 확인합니다.
5. 평형 생리염 용액 (PSS, 조성: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS0_4,2.0 m....

결과

제공된 프로토콜에 따라 IVM은 골격 근에서 백혈구 모집의 폭포에 대한 독특한 통찰력을 얻을 것이다. 결과 섹션에서는 IVM에서 얻은 일반적인 결과에 중점을 두고 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 강조 표시합니다.

위활력 현미경 검사법에 대한 실험 설정은 그림 1에설명되어 있습니다. cremaster 근육의 준비 및 결합 조직의 제거는 균일 한 표면으로 집중된 현미경 이미지를 얻기 위해 중요합니다. 과잉 결합 조직은 결국 IVM을 수행할 때 흐릿한 현미경 이미지(보충 비디오 1)로이어집니다. 도 2는 IVM을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 현미경 이미지를 나타낸다. 첫째, 직경이 20-40 μm 사이여야하는 모세관 후 매블은 두 개의 작은 혈관의 합류로 식별됩니다. 부착물 및 롤링 백혈구만 시각화할 수 있으며, 순환 백혈구는 녹화된 비디오의 슬.......

토론

방법으로서 IVM은 다른 기관에서 다른 세포 유형을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며 광범위하게 기술되고^{논의된 19.} 이 연구의 주요 목적은 cremaster 근육에서 IVM을 설정하고 수행하는 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법을 연습하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 계획 및 표준화는 기술을 마스터하는 핵심 요소입니다. 무엇보다도 이 기술은 혈역학 및 미세 혈관 파라미터에 매우 의존하며, 이를 면밀히 모니터링하고 제어해야 합니다. 이와 같이, 그룹 간의 다른 혈역학 오해의 소지가 결과 얻을 것 이다.

생리적 및 병리학적 상태를 연구하는 역할에도 불구하고, IVM 만으로는 염증에서 백혈구 모집에 대한 특정 세포 유형의 개별 적인 기여를 완전히 해명하지 않을 수 있습니다. 이를 위해, 다른 상보적인 방법은 IVM과 결합될 수 있다. 예를 들어, 유동 챔버 실험과 같은 생체 내 외 방법은 내피.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Material
Ketanest S	Pfizer Pharma GmbH	PZN: 08509909	마취. 일반 / IUPAC 이름 : ketamine
Xylazine	CP-Pharma GmbH	기사 번호 : 1205	마취. 제네릭 / IUPAC 이름: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution	B. Braun Melsungen	PZN 02737756	수술 준비. 일반 / IUPAC 이름: sodium chloride
주사기 바늘 Omnican F	B. Braun Melsungen	REF 9161502	수술 준비
봉합사 6/0 USP	Resorba	REF 4217	수술 준비
폴리에틸렌 튜브 #10	BD GmbH	공급 업체 번호 427401	수술 준비
폴리에틸렌 튜브 #90	BD GmbH	공급 업체 번호 427421	수술 준비
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	CAS 번호 989-38-8	백혈구 염색. 일반 / IUPAC 이름: 에틸 2-[3-(에틸아미노)-6-에틸이미노-2,7-디메틸잔텐-9-일]벤조에이트
<강한>설치 장비
수직 현미경	올림푸스	BX51W1	현미경
40배 대물렌즈	Zeiss	Achroplan 40 × /0.80 W	현미경
ImSpector 소프트웨어	Lavision Biotec GmbH	ver. 4.0.469	소프트웨어
ImageJ	National Institute of Health, USA	ver. 1.51j8	소프트웨어