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방법 논문

복부 대동맥류 마우스 모델에서 맥박 전파 속도, 감도 및 변형률 측정

6.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60515

⸱

2020년 2월 23일

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, University of Missouri, 2Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 3Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 복부 대동맥류의 마우스 모델에 발광 직경, 펄스 전파 속도, dtensibility 및 방사형 변형을 측정하기 위해 고주파 초음파 이미징을 사용하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

복부 대동맥류 (AAA)는 원래 크기의 1.5 배까지 최대 내발 경도 (MILD)를 초과하는 복부 대동맥의 국부적 인 팽창으로 정의됩니다. 임상 및 실험 연구는 작은 동맥류가 파열 될 수 있음을 보여 주었다, 큰 동맥류의 하위 인구는 안정적으로 남아있을 수 있지만. 따라서, 대공의 내발경 측정 외에도, 용기 벽의 구조적 특성에 대한 지식은 AAA의 안정성을 평가하는 중요한 정보를 제공할 수 있다. 대동맥 경화는 최근 혈관 벽의 초기 변화를 결정하는 신뢰할 수있는 도구로 부상했습니다. 맥박 전파 속도(PPV)와 방사형 스트레인은 대동맥 강성을 평가하는 데 매우 유용한 초음파 기반 방법입니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 온화한, PPV, 분산성 및 방사형 변형에 의해 결정된 대로 대류의 구조적 및 기능적 특성을 분석하고 이미지를 획득하고 분석하기 위해 초음파 이미징 시스템을 사용하는 포괄적 인 기술을 제공하는 것입니다.

서론

복부 대동맥류(AAA)는 원래 혈관 직경을 1.5배 인 대동맥의 영구적인 국부화 팽창을 특징으로 하는 중요한심혈관 질환을 나타낸다. AAA는 미국에서 사망의 상위 13 원인 중 순위2. AAA의 진행은 대동맥 벽과 엘라스틴 단편화의 변성에 기인하며 궁극적으로 대동맥 파열로 이어집니다. 대동맥벽의 이러한 변화는 최대 내발경(MILD)의 유의한 증가 없이 발생할 수 있으며, 따라서 MILD 만으로는 질병의 중증도를 예측하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다3. 따라서 대동맥 벽의 초기 변화를 감지하기 위해 추가 요인을 식별해야하며, 이는 조기 치료 옵션을 안내 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 펄스 전파 속도 (PPV), 감도 및 방사형 변형의 측정을 특징으로초음파 이미징을 사용하여 대동맥 기능 적 특성을 평가하기위한 실용적인 가이드를 제공하는 것입니다.

AAA를 연구하는 잘 특징지어진 실험 모형은, 먼저 Daugherty와 동료에 의해 기술된, Apoe-/- 마우스4에있는 삼투성 펌프를 통해 안지오텐신 II (AngII)의 피하 주입을 관련시킵니다. 초음파 화상 진찰을 사용하여 온화한의 정밀한 측정은 이 마우스 모형5에서AAA를 특성화하는 중요한 역할을 했습니다. AAA의 발달 도중 조직학 변경은 광범위하게 연구되었더라도, 대동맥 강성과 같은 혈관 벽의 기능적 특성의 변경은 잘 특성화되지 않았습니다. 이 프로토콜은 AAA의 시간적 진행을 연구하기위한 강력한 도구로 정교한 분석과 함께 고주파 초음파의 사용을 강조합니다. 특히, 이러한 접근법을 통해 PPV, 도면및 방사형 변형으로 측정된 용기 벽의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다.

AAA를 가진 인간 피험자에서 최근 임상 연구는, 뿐만 아니라 뮤린 엘라스타제 유도 AAA 모델에서, 대동맥 경직과 대동맥 직경 사이의 양성 상관관계를 시사한다6,7. PPV, 대동맥 강성의 지표는, 용기 벽6,8의강성의 변화를 정량화하기위한 우수한 측정으로 받아 들여진다. PPV는 혈관을 따라 두 부위에서 펄스 파형의 이동 시간을 측정하여 계산되므로 대동맥 강성의 지역적 평가를 제공합니다. 우리는 최근에 PPV에 의해 측정된 바와 같이 대동맥 강성이 증가하고, 원자력 현미경을 사용하여 결정된 세포 수준에서, 동맥류 발달9와긍정적으로 상관관계가 있음을 입증했습니다. 또한, 문헌은 대동맥 강성이 동맥류 팽창을 선행할 수 있으며 따라서 AAA10의개발 동안 선박 벽의 지역 내재 특성에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있음을 시사한다. 마찬가지로, 분력 및 변형률 측정은 동맥 적합성의 초기 변화를 측정하는 정량화 도구입니다. 건강한 동맥은 유연하고 탄력있는 반면, 강성이 증가하고 탄력이 적어지므로 탄력과 변형이 감소합니다. 여기서, 우리는 마우스에서 MILD, PPV, 분산성 및 방사형 변형을 측정하는 고주파 초음파 시스템의 사용을 위한 실용적인 가이드 및 단계별 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 특정 초음파 이미징 기기 및 첨부 된 비디오 자습서에 대한 매뉴얼에서 제공하는 기본 정보와 함께 사용되어야하는 기술적 인 접근 법을 제공합니다. 중요한 것은, 우리의 손에 설명된 화상 진찰 프로토콜은 실험적인 AAA의 발달 그리고 진행의 연구 결과에서 귀중한 것처럼 보이는 재현가능하고 정확한 데이터를 제공합니다.

초음파 화상 진찰의 유용성을 더 설명하기 위하여는, 우리는 실험적인 AAA11를방지하기 위한 약리학 적인 접근을 이용하기 위한 우리의 자신의 연구 결과에서 취한 보기 심상 그리고 측정을 제공합니다. 구체적으로, 노치 시그널링은 혈관 발달 및염증(12)의다중 양상에 관여하는 것으로 제안되었다. 유전자 haploinsufficiency 및 약리학 적인 접근을 사용하여, 우리는 이전에 노치 억제가 혈관 상해의 사이트에 대식세포의 침투를 방지해서 마우스에 있는 AAA의 발달을 감소시킨다는 것을 입증했습니다13,14,15. 현재 기사에서는 노치 억제를 위한 약리학적 접근법을 사용하여 AAA와 관련된 대동맥 강성과 요인 사이의 관계에 초점을 맞춥니다. 이 연구 결과는 노치 억제가 AAA 진행의 척도인 대동맥 강성을 감소시킨다는 것을 보여줍니다11.

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프로토콜

마우스와 초음파 화상 진찰의 취급을 위한 프로토콜은 미주리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (동물 프로토콜 번호 8799)에 의해 승인되고 AAALAC 국제에 따라 실시되었습니다.

1. 쥐의 장비 설치 및 준비

  1. 장비 설정
    1. 초음파 기기, 초음파 젤 워머 및 가열 패드를 켭니다.
    2. 초음파 프로그램을 열고 각 마우스에 대한 연구 이름과 설명 정보를 입력합니다.
    3. 응용 프로그램을 일반 이미징으로선택합니다.
    4. 복부 이미징에 적합한 트랜스듀서를 선택합니다(그림1B,C). 이 실험에서는 MS400 트랜스듀서가 사용됩니다.
    5. 마취 이소플루란과 산소 수준이 각 실험 세션에 적합한지 확인하십시오.
    6. 초음파 동물 이미징 플랫폼을 청소하십시오.
  2. 마우스 준비
    1. 가열 패드(36.5 ~ 38.5°C)의 상단에 마우스 케이지를 놓습니다.
    2. 마우스를 꼬리 밑면으로 가볍게 잡고 산소가 채워진 이소플루란 챔버에 놓습니다.
    3. 이소플루란과 산소 흐름을 유도 챔버로 직접 지시합니다.
    4. 이소플루란 기화기를 켜고 이소플루란 레벨을 1-2% vol/vol로 설정합니다.
    5. ~ 2 분 후, 마우스의 발 패드를 꼬집어 때 철수 반사의 부재에 의해 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
    6. 다음으로, 유도 챔버 공급 지점을 끄고 마취 코 콘으로 향하는 가지를 켭니다.
    7. 유도 챔버에서 초음파 이미징 단계로 마우스를 옮기고 마취 콘을 동물의 코 위에 놓습니다.
    8. 최적의 스캔을 위해 동물 이미징 플랫폼을 오른쪽 아래 모서리로 10° 정도 기울이면됩니다(그림 1B).
    9. 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스의 두 눈에 멸균 안과 용액 한 방울을 넣습니다.
    10. 코를 마취 콘에 삽입하여 마우스를 척추 위치에 놓습니다.
    11. 전극 겔을 면봉을 사용하여 네 발 모두에 적용하고 심전도 판독을 위한 동물 이미징 플랫폼에서 구리 리드에 발을 테이프로 붙입니다(그림1C).
    12. 클리퍼를 사용하여 이미징 부위에서 모발을 면도한 다음 제모 크림을 바르서 남은 털을 제거합니다. 1분 이내에 그대로 둡니다.
    13. 젖은 종이 타월로 크림과 머리카락을 부드럽게 닦아냅니다.
    14. 호흡을 모니터링하고 심박수가 450-550 비트 /분 사이에 유지되도록하십시오. 이 수준 이하인 경우, 이소플루란 흐름을 줄이고 심박수가 회복될 때까지 기다립니다.
    15. 미리 따뜻한 초음파 젤 (37 °C)을 준비된 피부 부위에 바르고 트랜스듀서를 홀더에 부착하고 젤에 닿을 때까지 아래로 낮춥니다(그림 1C).

2. 복부 대인의 초음파 화상 진찰

  1. 트랜스듀서를 수평으로 배치합니다(즉, 마우스의 중간선에 수직).
  2. 초음파 젤을 부드럽게하고 면봉의 나무 막대기를 사용하여 거품을 제거합니다.
  3. 트랜스듀서를 내리고 겔을 만진 후 다이어프램 아래에 0.5-1 cm를 놓습니다. 이제 이미지를 관찰하기 시작합니다.
  4. 짧은 축 뷰에서 복부 대강을 시각화합니다(그림1C).
    참고: B 모드는 해부학적으로 대류를 찾고 트랜스듀서를 배치하는 기본 및 가장 효과적인 모드입니다. 복부 대동맥은 짧은 축에서 색상 도플러 및 파워 도플러 모드를 사용하여 맥동 유량의 존재에 의해 확인된다 (즉, 대동맥의 원주 단면). 동물 스테이지와 트랜스듀서의 미세 조작기를 조정하여 대동맥의 단면을 이미지 중앙으로 가져옵니다.
  5. 트랜스듀서를 시계 방향으로 90° 부드럽게 회전하고 x축 마이크로 매니퓰레이터 노브를 천천히 조정하여 대동맥을 긴 축 뷰(대동맥의 세로 부분)에서 시각화합니다.
    참고: 대부분의 경우 위장관 가스는 이미지를 방해할 수 있으며 대하는 대관이 선명한 장거리 축 시야를 허용하기 위해 최적의 각도에 있지 않을 수 있습니다. 허용되는 긴 축 뷰가 얻을 때까지 트랜스듀서의 각도를 천천히 그리고 수평으로 조정합니다. 문제가 지속되면 트랜스듀서를 높이고 트랜스듀서 아래의 기포를 확인하고 동물 단계의 기울기 각도를 약간 조정하고 젤을 다시 적용한 다음 모든 단계를 다시 반복합니다.
  6. 포커스 영역과 초점 깊이 토글을 사용하여 대불 영역에서 초점 영역과 깊이를 각각 설정합니다. 대강벽의 최적의 대비를 달성하기 위해 대강물의 내강을 어둡게 하기 위해 시간 이득 보정 슬라이더를 수동으로 조정합니다.
  7. y축 조작기를 조정하여 우수한 장간막과 오른쪽 신장 동맥의 분기 점을 시각화합니다. 오른쪽 신장 동맥을 랜드마크로 사용하여 대동맥의 이미지를 캡처합니다(그림2A).
  8. 수월 대장에서 B 모드 이미지의 최소 100프레임을 기록합니다.
  9. Cinestore를 눌러 B 모드 이미지를 저장합니다.
  10. 악기 키보드의 M 모드 버튼을 눌러 M 모드 레코딩을 활성화합니다. 커서 볼을 굴려 노란색 표시선을 선명한 용기 벽 이미지가 있는 일반 대동맥 섹션또는 동맥류의 최대 직경이 관찰되는 섹션으로 가져옵니다.
  11. SV/게이트 토글을 누르고 커서 볼을 조정하여 용기 벽이 측정 브래킷에 포함되도록 합니다. 업데이트를 눌러 M 모드 측정을 기록하고 cinestore를 눌러 캡처합니다(그림2A, B).
    참고: 동맥류의 최대 직경은 대동맥의 최적의 장거리 보기와 동일한 이미징 평면에 없을 수 있습니다. 각 M 모드 측정에 대해 x축 조작기 노브를 약간 조정하여 각 섹션의 MILD가 캡처되도록 합니다.
  12. ECG 게이트 킬로헤르츠 시각화(EKV) 이미지를 얻으려면 B 모드 버튼을 눌러 B 모드 레코딩으로 돌아갑니다.
    참고: 이미지가 선명하지 않은 경우 x축 조작기를 조정하여 단면 길이(예: > 6mm)에 걸쳐 루멘의 상부 벽의 가장 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.
  13. 키보드의 물리 설정 버튼을 누르고 호흡 게이팅을선택합니다. 게이팅 지연 및 창을 수동으로 조정하여 호흡파의 평평한 부분 동안에만 데이터를 기록합니다. 기록 섹션은 호흡 파의 추적에 컬러 블록으로 표시됩니다.
    참고: 호흡 게이팅을 조정하지 않으면 호흡 중 동물의 정상적인 움직임으로 인해 EKV 이미지가 흐려집니다.
  14. EKV 버튼을 눌러 EKV 모드를 활성화합니다. 적절한 메뉴에서 표준 해상도 및 프레임 속도 3000 이상을선택합니다. EKV 이미지를기록하려면 진행을 선택합니다. cinestore를 눌러 이미지를 저장합니다. EKV 모드 이미지를 사용하여 펄스 전파 속도(PPV), 분산성 및 방사형 변형률을 측정합니다.
    참고: 호흡에 비정상적인 변동이 있거나, 동물이 너무 빠르게 발신중이거나, 프레임 속도 설정이 너무 높으면 EKV 기록이 실패할 수 있습니다. 이 경우 프레임 속도를 낮게 설정하고 동물의 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 프레임 속도를 3000으로 설정하는 것은 일반적으로 마우스와 쥐 모두에 적합합니다.

3. 이미징 후 단계

  1. 따뜻한 물로 적시고 종이 타월로 마우스의 복부 부위에서 초음파 젤을 부드럽게 닦으십시오.
  2. 마우스를 홈 케이지에 다시 놓고 가열 패드에 놓습니다.
  3. 이소플루란 기계를 끄고 동물 이미징 플랫폼을 청소하고 젖은 물티슈로 트랜스듀서를 청소하십시오.
  4. 초음파 스캔 중에 수집된 이미지 데이터를 하드 드라이브로 전송합니다.
  5. 초음파 기기를 끕니다.
  6. 마우스가 마취에서 회복되고 경고가 나면 가열 패드를 제거하고 케이지를 동물 하우징 랙으로 되돌린다.

4. 복부 대동맥 이미지 분석

  1. MILD를 측정하는 M 모드 이미지 분석
    1. 초음파 프로그램을 열고 각 마우스에 대한 연구 이름과 설명 정보를 입력합니다.
    2. 분석 소프트웨어에서 초음파 데이터를 열고 M 모드 이미지를 열고 하트 비트를 일시 중지합니다.
    3. 측정값을 클릭합니다.
    4. 드롭다운 옵션에서 혈관 패키지를 선택합니다. 깊이를 클릭하고 내부 벽에서 벽으로 이어지는 대동맥 루멘을 가로질러 선을그립니다(그림 2C,D).
      참고 : 일관성을 위해 대반이 최대로 확장 될 때 심장 주기의 수축기 단계에서 측정을 수행해야합니다. 세 개의 서로 다른 하트비트에 걸쳐 세 개의 선을 그려 서 MILD의 정확하고 평균적인 측정을 얻을 수 있습니다. AAA에서, 측정은 대물의 최대 팽창에서 취합니다. 또한 장 운동성의 간섭을 피하고 이미지 선명도를 보장하기 위해 이미지를 수집하기 전에 동물을 4-6 시간 빨리 하는 것이 좋습니다.
  2. 펄스 전파 속도 분석(PPV)
    1. EKV 이미지를 열고 하트비트를 일시 중지합니다.
    2. 이름 아이콘을 클릭하여 분석 소프트웨어(예: Vevo Vac)에서 새 창을 엽니다.
    3. PPV 옵션(그림 3D의화살표)을 클릭합니다. 대극장의 이미지와 함께 작은 창이 더 나타납니다.
    4. 상부 용기 벽을 클릭하고 포인터를 약 4mm 동안 드래그하여 사각형 상자를 그립니다.
      참고: 모든 이미지에 대해 상자 길이를 일관되게 유지합니다(~4mm). 사용자는 상자를 정렬하고 라인을 선택한 다음 분석중인 용기의 새로운 위치로 드래그하여 펄스 파의 가장 적절하고 명확한 굴곡을 얻어 직사각형 상자를 조정할 수 있습니다. 사각형의 데이터 세로 선이 표시되고 ROI의 왼쪽(위쪽 이미지) 및 오른쪽(아래 이미지)으로 식별됩니다. 펄스파의 변곡점을 더 잘 시각화하기 위해 그림 3과같이 상부 벽에만 그리기 상자에 유용할 수 있습니다. 소프트웨어는 자동으로 PPV (m / s)를 계산합니다. 그러나 펄스 파에 정확한 변곡점을 설정하기 위해 보라색 선을 수동으로 조정하는 것이 좋으며 PPV는 그에 따라 변경됩니다.
    5. 마지막으로 수락 명령을 선택하여 PPV 값을 저장합니다. 수치와 데이터를 데이터 저장소 드라이브로 내보냅니다.
  3. 분산성 및 방사형 변형에 대한 분석
    1. EKV 이미지를 열고 하트비트를 일시 중지합니다.
    2. 소프트웨어 아이콘을 클릭합니다. 소프트웨어가 새 창을 엽니다.
    3. 추적 새 ROI를 클릭하고 선박의 양쪽 벽에 직사각형 상자를 그립니다. 소프트웨어는 자동으로 선박의 상부 및 하부 벽을 추적합니다. 사용자는 녹색 점(그림 4A, B)을클릭하여 벽에 정렬하는 추적을 조정할 수 있습니다.
    4. 이제 추적을 수락합니다. 소프트웨어는 선택한 ROI에서 의 부전성(1/Mpa)을 계산합니다.
    5. 방사형 변형률 측정의 경우 왼쪽 상단의 메뉴 막대에서 적절한 변형 옵션을 선택합니다. 방사형 변형 및 접선 변형에 대한 이미지가 열립니다.
    6. 방사형 변형률(%) 값 얻기 커브의 피크에서 커서를 이동합니다. 데이터를 이미지 또는 비디오 형식으로 내보냅니다(그림4A, B).

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결과

마우스로부터의 정상 및 동맥류 복부 대동맥의 대표적인 M모드 이미지는 각각 도 2A 및 도 2B에나타내고 있다. 상복부 대동맥은 오른쪽 신장 동맥 과 우수한 장간막 동맥 옆에 있는 그것의 위치에 의해 확인됩니다(그림 2A). 수축기 심장 주기의 세 가지 상이한 심장 박동에서, 정상 및 동맥류 대동맥의 계산에 사용되는 대표적인 이미지는 각각 도 2C,D에 나타내고 있다. 대동맥류가 발달한 상황에서, 발광 직경은 최대 팽창 의 영역에서 루멘의 두 안쪽 가장자리 사이에 수직 노란색 선을 그려서 결정된다(그림 2B). 정확...

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토론

초음파 이미징은 PPV, distensibility 및 방사형 변형의 측정을 통해 대강의 기능적 특성을 결정하는 강력한 기술을 제공합니다. 이 측정은 AAA의 마우스 모형을 공부하기 위한 특히 유익하고 생체 내 접근은 대동맥 병리학의 시간적 발달을 이해하는 것이 잠재적으로 중요한 세로 데이터의 수집을 허용합니다. 구체적으로, 생체내 대동맥강성의 측정은 EKV 데이터를 분석하여 PPV, 난성 및 방사형 변형에 의해 복부 대동맥에서 국소적으로 결정되며 AAA 불안정성16에대한 독립적인 위험 인자로 간주된다. 이러한 프로토콜에 설명된 기술은 비교적 간단하며 한 마우스에서 이미지 세트를 가져오는 데 8-10분밖에 걸리지 않습니다. 모든 이미지는 잘 정의되고 일관된 랜드마크를 사용하여 재현 가능하고 정밀한 데이터를 생성하는 단일 작업자가 수집하는 것이 바람직합니다.

이러한 도구의 적용에 대한 기술 전문 지식이 필요한 잠재적인 요인이 있습니다. 예...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 R01HL124155 (CPH)와 미주리 대학의 연구소에서 CPH에 자금을 지원했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Angiotensin IISigmaA9525
Apoe-/- 마우스The Jackon labfigure-materials-1
ClippersWAHL1854
면봉Q-tips
DAPTSigmaD5942
제모 크림NairLL9038
전극 크림Sigma17-05
젤 워머Thermasonic (Parker)82-03 (LED)
가열 패드StrykerT / pump Professional
IsofluraneVetOneFluriso TM
Isoflurane 기화기VisualsonicsVS4244
안과 연고Lacri-lube
삼투 펌프Alzet모델 2004
산소 탱크,공기 가스
트랜스듀서Visualsonics,MS-400 또는 MS550D
초음파 젤ParkerAquasonic, 투명
초음파 이미징 시스템,Visualsonics,Vevo 2100
Vevo Vasc, 소프트웨어비주얼소닉
윤활 , , , , , ,

참고문헌

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