그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.
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방법 논문
아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리
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이 논문에서
요약
초록
이 방법은 그람 음성 박테리아의 봉투를 총, 내부 및 외부 멤브레인 (OM) 분획으로 분할하여 작동하고 이중 층의 순도를 평가하기 위해 분석으로 결론을 내립니다. OM은 외부 리플렛 내 리풀리고당(LOS) 및 리포폴리당류(LPS)의 존재로 인해 내부 멤브레인에 비해 전체 밀도가 증가합니다. LOS 및 LPS 분자는 지질-A 디사카롤리피드 및 코어-올리고당 치환제으로 구성된 유사한 구조를 가지는 양과병성 글리콜리피피이다. 그러나, 오직 LPS 분자만이 O-다당류 또는 O 항원으로 알려진 제3 소단위로 장식된다. 존재하는 글리콜리파이드의 종류와 양은 유기체의 OM 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 다양한 글리콜리파이드 함량을 가진 박테리아의 막이 우리의 기술을 사용하여 유사하게 분리될 수 있는지 시험했습니다. LPS 생산 유기체의 경우, 살모넬라 테네리카 혈청염 혈청염 및 대장균,막을 쉽게 분리하고 LPS O-항원 모이어티는 이중층 분할에 영향을 미치지 않았다. 아신토박터 바우마니는 LOS 분자를 생산, 이는 O 항원 결핍 LPS 분자와 유사한 질량을 갖는다; 그러나, 이 세균의 막은 처음에 분리될 수 없었습니다. 우리는 A. baumannii의 OM이 장내 세균과보다 밀도가 낮기 때문에 자당 그라데이션을 조정하고 막을 분리했다고 추론했습니다. 따라서 이 기술은 다른 유기체와 함께 사용하기 위해 조정 및 수정될 수 있습니다.
서론
그람 음성 박테리아는 주변 공간과 펩티도글리칸 세포벽1에의해 분리되는 2개의 막을 일으킵니다. 내부 막 (IM) 사이토솔을 감싸고 인지질의 대칭 이중층이다. 펩티도글리칸은 터고 압력으로부터 보호하고 세포 형상을 가진 박테리아를 제공하며, 지단백질2,,3에의해 외부 막(OM)에 부착된다. OM은 주변을 둘러싸고 있으며 주로 비대칭입니다. 내부 리플렛은 인지질로 구성되며 외부 리플리피드(LOS) 또는 리포폴리당당(LPS)4,,5로구성된다. 외부 리플렛에서 LOS/LPS 분자의 지질 비대칭 및 생화학은 그 환경의 위험으로부터 박테리아를 보호하는 세포 표면에 장벽특성을부여한다6,7.
LPS 분자는 3개의 성분으로 구성됩니다: 지질 A 이시카롤리피드, 코어 올리고당, 및 O-다당류 또는 O 항원. 지질 A는 곱한 비실화 된 디실로리피드입니다. 코어 올리고당은 거친 LPS 또는 R-LPS로 알려진 1....
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프로토콜
1. 멤브레인 추출을 위한 일반 시약 및 매체 준비
- 세균 성장 매체: 철저하게 세척하고 오토클레이브한 2 L 플라스크에서 국물 1L을 준비하고 살균합니다.
- 일반 재서스펜션 버퍼(1M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): H2O. 5M HCl로 pH를 7.5로 조정하는 30mL에 6.05g의 트리스 베이스를 용해하여 초순수 H2O로 최종 부피를 50mL로 조정합니다.
- divalent 양이온 킬레이션 용액 (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL)의 마스터 스톡 : 18.6 g의 디틸렌 테트라 아세테이트 2H2O ~ 80 mLH2O. 격렬하게 저어주고 NaOH로 pH를 8.0으로 조정합니다. 초순수H2O로 최종 볼륨을 100mL로 조정합니다.
참고: EDTA의 디소듐 염은 NaOH의 첨가에 의해 용액의 pH가 ~8.0으로 조정될 때까지 용해되지 않을 것이다. - 삼투성 완충제 A (0.5 M 자당, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): 자당의 무게 171.15 g및 1 L 실린더로 옮긴다. 1M 트리스 pH 7.5의 10 mL를 추가합니다. 4 °C에서 초순수 H2....
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결과
이 기술은 그람 음성 박테리아에 대한 EM 및 OM을 분리하는 효과적인 수단을 제공합니다. 전체 절차의 개요가 도시되어있습니다(그림 1). 일반적으로, 배지의 1L에서 0.6-0.8의 OD600으로 배양물의 정상화, 또는 6.0 및 8.0 x10 11 세균 세포 사이에서 수확하는 것은 후속 분리를 위해 적절한 양의 막 물질이 수집되도록 할 것이다.
박테리아를 용해시키고 용해액을 초원심분리하면 끈적끈적한 갈색 총막 펠릿이 초원심분리관 의 바닥에 보입니다. 불연속 자당 밀도 구배를 통해 멤브레인을 긁어 내고 균질화하고 초원심분리한 후, IM 및 OM은 도시된 바와 같이 분리되어야한다(도 2). 우리는 20%/53%/73%(w/v) 자당 밀도 그라데이션이 A. baumannii의봉투를 분할하기에 충분하지 않은 반면, 20%/.......
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토론
이 방법은 세균성 생리학 및 병인에 있는 세포 봉투의 역할을 이해에 있는 연구원을 돕기 위하여 계속할 것입니다. 순차적 초원심분리 단계에 이어 정제된 총, 내부 및 OM 분획을 얻을 수 있다. 이러한 멤브레인은 세포 단백질 국소화 및 기능, 주변을 가로지르는 수송 및 인신매매, 다양한 환경 조건 하에서 개별 이중층의 조성과 관련된 가설을 시험하기 위해 단독으로 분석될 수 있다. LOS/LPS 및 OM 단백질과 같은 병인에서 개별 OM 성분의 개입을 탐구하는 생물학적 연구는 이 기술에 의해 수집된 분리된 막 분획을 사용하여 동물 및 세포 모델에서도 수행될 수 있습니다.
우리의 절차는 장내 세균과, 특히 S와 함께 사용하도록 최적화되었습니다. 타이피무리움은 가변 사슬 길이의 O 항원을 포함하는 LPS 분자를 생성합니다. 이 프로토콜은 또한 O 항원을 합성하는 유전 능력을 잃은 모형 박테리아, 대장균 K-12를 위해 작동합니다. 야생형 및 O항원 결핍 .......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 작품은 P20GM10344 및 R01AI139248에 의해 Z. D. Dalebroux에 수여되었다.
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재료
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| 고온 캡이 있는 1L Pyrex 미디어 보관 병 | VWR | 10416-312 | |
| 2,000mL 삼각 플라스크, 좁은 입 | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% 미니 PROTEAN 프리캐스트 단백질 겔, 12 | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli 샘플 완충액 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce 조직 균질화기(유리 유봉 2개 포함 | VWR | 71000-518 | |
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참고문헌
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).<....
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