이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
T 여포 도우미 (Tfh) 세포는 발아 센터 (GC) 개발 및 높은 친화도 항체의 생성에 대한 도움을 제공하는 데 전문화 된 독립적 인 CD4+ T 세포 하위 집합이다. 인플루엔자 바이러스 감염에서, 강력한 Tfh 및 GC B 세포 반응은 Tfh 관련 연구를 위한 자격을 갖춘 마우스 모형을 부여하는 효과적인 바이러스 박멸을 촉진하기 위하여 유도됩니다. 이 논문에서, 우리는 마우스에 있는 인플루엔자 바이러스 감염 도중 기본적인 Tfh 관련 면역 반응의 검출에 있는 프로토콜을 기술했습니다. 이러한 프로토콜포함: 인플루엔자 바이러스의 비강 내 접종; 폴리클론 및 항원 특이적 Tfh 세포, GC B 세포 및 혈장 세포의 유동 세포 피진 및 분석; GC의 면역 형광 검출; 혈청에서 인플루엔자 바이러스 특이적 항체의 효소-연결된 면역흡혈구 분석(ELISA). 이러한 분석체는 기본적으로 인플루엔자 바이러스 감염에서 Tfh 세포의 분화 및 기능을 정량화하여 분화 메커니즘 및 조작 전략을 해명하는 연구에 도움을 제공합니다.
서론
최근 10 년 동안, 수많은 연구는 새로 확인 된 CD4+ T 세포 서브 세트에 초점을 맞추고있다, Tfh 세포 하위 집합, 발아 센터 (GC) B 개발에 필수적인 역할에 대한. B세포 림프종 6(Bcl6)은 주로 유전자 억압자로 간주되는, Bcl6의 자궁외 발현이 Tfh 분화를 유도하기에 충분하다는 증거를 위해 Tfh 세포의 계보-정의 인자이며 Bcl6의 결핍으로 인해 Tfh 분화1,2,3이사라졌다. 다른 CD4+ T 도우미 서브세트가 염증 부위로 이동하여 이펙터 기능을 수행하는 것과 달리, Tfh 세포는 주로 비장 및 림프절의 B 세포 여포 영역에서 B 세포 도움을 제공한다. 공동 자극 분자 ICOS 및 CD40L, Tfh와 GC B 세포 사이의 상호 작용에 중요한 역할을한다. Tfh 분화 동안, ICOS는 코그네이트 B 세포로부터 필요한 신호를 전송하고 또한 B 세포 영역국소화4,5에대한 방관자 B 세포로부터 이동 신호를 수신 수용체 역할을한다. CD40L은 B 세포 증식 및 생....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물 실험은 중국 상하이의 연구소 파스퇴르 의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인 한 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.
참고: 마우스의 바이러스 감염 및 장기의 격리ABSL2 조건 하에서 수행되어야 합니다.
1. PR8 인플루엔자 바이러스의 접종과 마우스 무게기록
- ABSL2 방에서 감염을 위해 8 주 된 남성 C57BL/6 마우스를 준비하십시오.
참고: 이 프로토콜은 또한 여성 마우스를 가진 실험에 적합합니다. - PR8 바이러스의 희석: -80 °C 냉동고에서 바이러스를 꺼내 액체로 녹을 때까지 얼음에 배양하십시오. 스톡 바이러스를 철저히 희석시키고 멸균 인산염 완충식식염(PBS, 135mM NaCl, 2.7m MM KCl, 10mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4)을사전 냉각된 1.5mL 튜브로 2PFU/μL로 바이러스를 희석시켰다.
- 마우스 마취: 각 마우스의 무게를 측정하고 사용되는 펜....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
인플루엔자 바이러스 감염에서 마우스 이환율의 특성화
인플루엔자 바이러스 감염 후, 마우스는 질병으로 인해 덜 활동적이고 식욕 부진이며, 이는 심각한 체중 감소에 의해 반영되며, 마우스 이환율을 모니터링하는 데 일반적으로 사용되는증상(19). 도 1에도시된 바와 같이, PR8 바이러스 감염 마우스는 6일째에 체중 감량을 시작하여 8일째 가장 높은 손실 수준에 도달하고 10일째에 초기 수준으로 돌아왔다. 예상대로, 체중 감소는 PBS 처리된 대조군 마우스에서 의 기간 내내 모두 관찰되지 않았다. 생체 내 증상의 경우, 바이러스 감염은 배수 림프절, mLN에서 강력한 림프구 확장으로 이어집니다. 따라서, MLNs의 크기가 훨씬 큰 크기는 대조군마우스(도 1b)보.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
높은 친화성 항체를 생성하기 위한 B 세포 도움을 제공하는 전문화한 역할 때문에 Tfh 세포는 백신 설계를 위한 새로운 전략을 제공하기 위하여 분화 및 조작의 기계장치에서 광범위하게 공부되었습니다. 인플루엔자 바이러스 감염은 활발한 Tfh 및 GC B 세포 반응을 유도하여 이 연구 분야에 적합한 모델이 됩니다. 본 논문에서, 우리는 비강 내 접종에 의한 인플루엔자 바이러스 감염의 프로토콜을 기술했습니다, 유동 세포측정에 의한 Tfh 관련 반응의 평가, 면역 형광 및 ELISA. 이 assays는 Tfh 분화, GC B 발달 및 인플루엔자 바이러스 특정 항체의 검출을 용이하게 하고 연구원이 면역 반응에 있는 새로운 중요한 분자를 탐구하고 확인하는 것을 도울 것입니다.
인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 모형을 가진 연구 결과에서는, 체중 감소는 마우스 이환율의 일반적으로 이용된 표시기입니다. 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에서 예상되는 체중 변화 운동학은 마우스에서 유도된 적절한 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 흐름 세포측정 시설, ABSL2 시설 및 상하이 의 SPF 동물 시설의 직원들이 기술적 인 도움과 조언을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 중국 과학 아카데미 (XDB29030103), 중국 국립 핵심 R & D 프로그램 (2016YFA0502202), 중국 국립 자연 과학 재단 (31570886)의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
Immunostaining
의
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Tfh 세포, NP 특이적 Tfh 세포 및 Bcl-6 | |||
| 37% 포름알데히드 | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 마우스 | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | 클론:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | 클론: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | 클론:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | 클론:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | 클론:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | 클론 : MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | 클론 : 7E.17G9 |
| PD1 PE / Cy7 | Biolegend | 135216 | 클론 : 29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| IL21< / strong의 세포 내 염색> | |||
| 37% 포름알데히드 | 시그마 | F1635 | |
| 항인간 IgG | 잭슨 면역연구소 | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | 시그마 | B6542 | |
| 인간 FCc IL-21 수용체 | R& D 시스템 | ||
| 이오노마이신 | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead 고정성 아쿠아 데드 셀 염색 키트 | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B 및 형질 세포 염색 | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | 클론:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | 클론:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | 클론:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | 클론:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| ELISA를 사용한 HA 특이적 항체 역가의 분석 | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| 염소 안티 마우스 Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 염소 안티 마우스 IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 염소 안티 마우스 IgG1 (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 염소 안티 마우스 IgG2b (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 염소 안티 마우스 IgG2c (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB 기질 시약 세트 | BD Pharmingen | 555214 | |
| 조직학 | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| 묽은 Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| 일반 염소 혈청 | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold 안티페이드 시약 | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN 차단 키트 | Vector laboratories | SP-2002 |
참고문헌
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cell....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
