방법 논문

헬리안투스 아누스의 대규모 열화상 스크리닝에 의한 새로운 식물 증발 규제 기관 식별

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DOI:

10.3791/60535

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2020년 1월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Program in Molecular Biology, Pomona College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 화합물 라이브러리의 대규모 스크리닝에 의한 엽간 증발의 변조기를 식별하는 방법을 제공한다.

초록

생물학적 및 비생물적 응력에 대한 식물 적응은 다양한 요인에 의해 지배되며, 그 중에서도 물 결핍이나 병원균에 대한 반응으로 구내 조리개 조절이 중요한 역할을 합니다. 따라서 구내 운동을 조절하는 작은 분자를 식별하는 것은 식물이 환경에 적응하는 생리적 기초를 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 구내 운동의 조절기를 확인하기 위하여 이용된 대규모 검열 접근은 잠재적인 한계가 있습니다: 몇몇은 abscisic acid (ABA) 호르몬 신호 통로에 크게 의존합니다, 그러므로 ABA 독립적인 기계장치를 제외하, 그 외는 식물 성장 및 발달과 같은 간접, 장기 생리적인 효력의 관측에 의존합니다. 여기에 제시된 스크리닝 방법은 열 화상 진찰에 의한 그들의 증발의 직접적인 정량화와 결합된 화학제품의 도서관을 가진 식물의 대규모 처리를 허용합니다. 열 화상 진찰은 잎 표면 냉각을 통해 물의 증발이 결과적이기 때문에, 시간이 지남에 따라 구내 전도도의 변화를 조사하는 비침습적 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜에서, Helianthus annuus 묘목은 수경 재배 한 다음 뿌리 공급에 의해 처리되며, 1 차 뿌리가 절단되어 테스트중인 화학 물질로 담근다. 열 화상 진찰은 시간 지남에 따라 cotyledonary 온도 변화의 통계적인 분석에 선행하여 구내 조리개를 변조하는 생리 활성 분자의 식별을 허용합니다. 우리의 개념 증명 실험은 화학 물질이 10 분 이내에 해바라기 모종의 자백에 절단 뿌리에서 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 또한 식물을 ABA로 양수 제어로 처리하면 잎 표면 온도의 증가가 몇 분 내에 감지될 수 있습니다. 따라서 당사의 방법은 구내 조리개를 조절하는 신규 분자의 효율적이고 신속한 식별을 가능하게 합니다.

서론

식물의 응력 내성은 다양한 분자, 세포, 발달 및 생리적 특징 및 메커니즘에 의해 영향을 받는 다원성 특성1. 변동하는 환경에서 식물은 충분한 물을 유지하고 병원균 침입을 방지하면서 탄소에 대한 광합성 수요의 균형을 맞추기 위해 구내 운동을 지속적으로 조절해야합니다2; 그러나 이러한 트레이드 오프 "결정"이 이루어지는 메커니즘은 제대로이해되지 않습니다 3. 식물에 생리 활성 분자를 도입하면 생리학을 조절하고 새로운 조절 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

소분자의 대규모 스크리닝은 단기간에 수백 에서 수천 개의 분자의 생리적 효과를 시험하기 위해 항암 약물 발견 및 약리학적 분석에 사용되는 효과적인전략이다 4,5. 식물 생물학에서, 고처리량 스크리닝은 합성 분자 피라박틴6의식별뿐만 아니라 아시산(ABA)7,8의장기간 요구되는 수용체의 발견에 그 효과를 보여주었다. 그 이후, ABA 수용체의 작용제 및 길항제, 및 ABA 유도성 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있는 소분자는9,10,11, 12,13, 14,15로확인되었다. 구내 조리개를 조절할 수 있는 작은 화합물을 식별하기 위해 현재 사용할 수 있는 고처리량 스크리닝 접근법에는 몇 가지 단점이 있습니다: (i) ABA 신호 전달 경로를 중심으로 회전하는 프로토콜은 새로운 ABA 독립적 메커니즘의 식별을 방지할 수 있습니다. 및 (ii) 생체 활성 소분자의 식별에 사용되는 생체 내 전략은 주로 종자 발아 또는 묘목 성장에 대한 생리적 영향에 의존하며, 식물 증발의 조절에 의존하지 않습니다.

또한 생리 활성 분자로 식물을 치료하는 여러 가지 방법이 있지만 대부분은 구내 인적 이동에 대한 대규모 연구에 적합하지 않습니다. 간단히 말해서, 가장 일반적인 세 가지 기술은 분무 또는 침지, 뿌리 시스템의 치료 및 뿌리 관개에 의한 잎 응용 프로그램입니다. Foliar 응용 프로그램은 리프 표면에 액적의 존재가 대규모 데이터 수집을 방해하기 때문에 구내 조리개를 측정하는 가장 일반적이고 빠른 방법론과 호환되지 않습니다. 루트 관개의 주요 제한 사항은 큰 샘플 부피 요구 사항, 뿌리 구체의 요소에 의한 화합물의 잠재적 보존 및 활성 루트 섭취량에 대한 의존도입니다.

여기에서, 우리는 반드시 ABA- 또는 알려진 가뭄 반응 메커니즘을 포함하지 않는 식물 증발을 조절하고 식물의 효율적이고 신뢰할 수있는 치료를 허용하는 새로운 화합물을 식별하는 대규모 방법을 제시한다. 이 시스템에서 Helianthus annuus 식물은 수경 재배 된 모종의 기본 뿌리를 절단하고 절단 부위를 샘플 용액에 담그는 것으로 구성된 뿌리 공급 방식을 사용하여 처리됩니다. 일단 처리되면, 식물의 증발에 대한 각 화합물의 효과는 적외선 열 화상 카메라를 사용하여 측정됩니다. 잎 표면 온도의 주요 결정요인은 잎에서 증발하는 속도이기 때문에 열화상 데이터는 구내 전도도와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. 화학 처리 후 엽엽 온도의 상대적 변화는 따라서 식물 의 증발을 정량화하는 직접적인 수단을 제공한다.

H. annuus는 세계에서 5 대 오일 시드 작물 중 하나입니다16 이 식물에 직접 만든 발견 기술의 미래 전송을 용이 하 게 수 있습니다. 또한, H. annuus 묘목은 크고 평평한 코틸레톤뿐만 아니라이 프로토콜의 개발에 이상적 이었다 두꺼운 기본 뿌리를 가지고있다. 그러나, 이 방법은 다른 식물 및 다양한 화합물에 용이하게 적응될 수 있다.

이 프로토콜은 구내 폐쇄를 유발하거나 구내 개구부를 촉진할 수 있는 분자를 효과적으로 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이는 구내 전도도 및 식물 적응을 환경에 조절하는 신호를 이해하는 데 큰 영향을 미칩니다. 스트레스.

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프로토콜

1. 식물 재배

  1. 4cm 두께의 미세 한 버미쿨라이트 층을 표준 10 인치 x 20 인치 (254mm x 501mm) 식물 트레이에 구멍이 없습니다.
  2. 종자 홀더(재료 표참조)를 식물 트레이에 2cm 간격으로 놓습니다.
  3. 종자 홀더를 버미쿨라이트로 채웁니다.
  4. 해바라기 씨를 각 종자 홀더에 끝끝으로 내려 놓고 씨앗의 절반이 노출되도록 밀어 내보라고 합니다.
    참고: 해바라기 씨는 비대칭이며, 방랑이 나타나는 지점끝은 아래쪽을 가리가야 합니다. 뿌리와 줄기의 방향 전환이 종자 홀더 내에서 불가능하기 때문에 적절한 종자 배치가 중요합니다. 시드의 둥근 끝은 종자 홀더의 상단을 지나 확장되어야 합니다.
  5. 씨앗이 제자리에 있으면, 2cm 두께의 미세 한 버미쿨라이트층으로 덮습니다. 위에서 미스팅하여 물을. 표면은 한 시간 후에 젖은 상태로 유지되어야합니다. 이 경우 트레이를 뚜껑으로 덮습니다.
  6. 성장 챔버 또는 온실에서 식물을 성장. 권장 조건은 140 μmol 광자·m~m~s-1의 광세기및 22°C에서 16h 광, 20°C에서 9h 의 광주기5일 동안 이다.
    참고: 표면이 눈에 띄게 건조해지지 않는 한 급수는 필요하지 않습니다.

2. 수경 시스템의 설정

  1. 수경 재배 식물에 적합한 적절한 크기의 용기를 찾으십시오. 용기의 크기는 성장 챔버 또는 온실에서 사용할 수있는 공간에 적응되어야한다. 최소 수심 15cm를 권장합니다.
  2. 증류수로 용기를 채우고 제조업체가 지정한 대로 일반 수경 재배 비료를 추가하십시오. 생성된 수경용액은 공기 및 물 펌프를 사용하여 얻을 수 있는 일정한 움직임으로 포진되어야 합니다.
  3. 수경 플로터를 준비합니다.
    1. 2cm 두께의 팽창 폴리스티렌 폼 (재료 표참조)의 시트를 컨테이너의 치수로 자른다. 시트는 조류의 성장을 제한하기 위해 용기의 표면의 대부분을 커버해야합니다. 나무 굽기 도구는 폴리스티렌 폼을 절단하는 데 효과적이며이 프로토콜에 충분히 다재 다능합니다.
      주의: 폴리스티렌 폼의 뜨거운 절단 중에 방출되는 연기 또는 증기는 심각한 건강 상의 위험요소입니다. 적절한 호흡 보호를 사용하십시오. 사용자는 또한 연기 후드에서 폼을 절단하여 환기 요구 사항을 충족 할 수 있습니다.
    2. 나무 굽기 도구를 사용하여 폴리스티렌 폼 시트에 구멍 (직경 1-2cm)을 확인합니다. 두 구멍의 중심 사이의 거리는 실험의 필요에 맞게 조정할 수 있습니다. 그러나 최소 2.5cm의 거리를 권장합니다.

3. 수경 재배 및 식물 성장에 묘목 의 전송

  1. 5일된 모종을 버미쿨라이트에서 부드럽게 꺼내서 30분 동안 물이 담긴 용기로 즉시 옮깁니다. 이 단계는 여분의 vermiculite를 제거하고 나머지 pericarps를 부드럽게합니다. 새로운 기본 루트가 표시되어야 합니다.
  2. 향후 코틸레돈의 확장을 최적화하기 위해 필요한 경우 손으로 pericarp 벽을 제거합니다.
  3. 종자 홀더 내의 모종을 폴리스티렌 폼 플로터로 옮김을 옮김. 140 μmol 광자 ·m의 광도로 식물을성장시고 ,25%의상대 습도 65% 및 22°C에서 16h 광, 20°C에서 9h 의 광주기를 2일 동안 20°C에서 성장시다.

4. 치료 전 준비

참고: 이 절차는 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) 및 10 mM MES-KOH (pH = 6.2)에서 100 μM ABA와 함께 각각 1 % (v / v) 디메틸 설산화물 (DMSO)을 포함하는 삼중 화합물 라이브러리에서 20 가지 화학 물질을 테스트하는 것입니다.

  1. 처리 준비가 충분한 식물이 있는지 확인하십시오. 치료를 위해 준비 된 식물은 완전히 코틸을 전개 할 만큼 충분히 성숙해야하지만, 측면 뿌리 증식이 최소화 될 만큼 충분히 젊어야합니다. 표준 스크리닝을 수행하려면 69 개의 식물이 필요합니다.
  2. -80°C 냉동고에서 작은 화합물을 함유하는 96웰 플레이트를 제거한다. 실온에서 해동합니다.
  3. 10 mM MES-KOH 버퍼의 80 mL을 1 M KOH로 6.2의 pH로 조정하십시오.
  4. 라벨 캡이없는 2 mL 마이크로 튜브. 1% (v/v) DMSO를 함유하는 음성 대조군 처리(10 mM MES-KOH(pH=6.2)를 위해 적어도 6개의 튜브를 준비한다. ABA 처리를 위해 3개의 튜브를 사용하십시오(10mM MES-KOH pH = 6.2에서 100 μM ABA), 양성 대조군). 나머지 60개의 튜브를 사용하여 삼중 화학 물질의 20가지 효과를 분석합니다.
  5. 각 화학물질(DMSO에서 10 mM)의 10 μL을 적절하게 표지된 3개의 튜브 각각에 전달합니다. 10 mM ABA의 파이펫 10 μL은 6개의 대조군 튜브에 3개의 튜브 및 10 μL의 DMSO로 DMSO에 용해되었다.
    주의: 본질적으로, 일부 화합물 심각한 건강 영향을 일으킬 수 있습니다 및 사용자가 적절 한 보호 조치를 취해야 합니다.
  6. 69개의 튜브 각각에 10 mM MES-KOH(pH = 6.2)의 990 μL을 추가합니다. MES 버퍼를 MES 버퍼와 혼합하기에 충분한 힘으로 MES 버퍼를 분배하지만 화학 물질과 MES 버퍼가 튜브에서 분출하는 너무 많은 힘을 사용하지 않도록 주의하십시오. 또는, 낮은 속도로 소용돌이.

5. 열화상 카메라 설치

  1. 복사 스탠드에 열화상 카메라를 장착합니다. 모든 케이블을 랩톱에 연결합니다.
    참고 : 기록은 온도 조건 (20 ° C ~ 25 ° C), 습도 (50 % ~ 70 %) 하에서 수행됩니다. 및 광질 (110 ~ 140 μmol 광자 ·m-2·s-1)식물을 재배하는 데 사용되는 것과 유사하다.
  2. 카메라를 켜고 노트북을 켜고 열 화상 진찰 분석 소프트웨어를 엽니다.
    참고: 기록에 대한 후속 지침은 사용된 특정 소프트웨어에 적용됩니다(재료 표참조).
  3. 녹음/녹화 설정을 조정합니다.
    1. 중앙 창 상단의 레코드 빨간색 단추 위로 마우스를 누를 수 있습니다. 드롭다운 메뉴가 나타납니다. 렌치 아이콘 레코드 설정을클릭합니다.
    2. 적절한 레코드 모드 및 옵션을 선택합니다. 주기적으로 한 프레임씩 캡처하고 수동 정지를 사용할 수 있는 레코드 옵션입니다. 소프트웨어가 비디오를 저장할 파일 대상을 기록합니다. 레코드 설정 창을 닫습니다.

6. 식물 준비 및 치료

  1. 화학 물질이 들어있는 캡이 없는 튜브를 튜브 랙에 놓습니다. 양자택일로, 폴리스티렌 폼 시트는 사용자 정의 튜브 랙을 만들기 위해 단계 2.3에 설명 된 바와 같이 나무 굽기 도구로 절단 및 찌를 수 있습니다. 각 구멍의 직경은 단단히 유지하기 위해 캡리스 튜브의 외부 직경에 매우 가깝습니다.
    참고: 카메라의 시야는 캡이 없는 튜브를 제자리에 두는 방법을 결정할 때 고려해야 할 제한 요소입니다.
  2. 위치 관련바이어스(17)를고려하여 랙내의 양성 및 음성 제어 튜브뿐만 아니라 실험 튜브를 고르게 분배한다.
  3. 수경 재배 식물 옆에 다음 재료를 준비 : 미세 해부 가위, 물과 얕은 접시, 섬세한 작업 와이프, 다른 화학 물질을 포함하는 69 캡이없는 튜브.
  4. 각 식물을 치료할 수 있도록 다음 단계를 반복합니다. 해바라기 새싹은 항상 씨앗 홀더에 남아 있습니다.
    1. 조심스럽게 씨앗 홀더를 들어 올리고 물을 포함하는 얕은 접시에 뿌리를 빠르게 담급강합니다.
    2. 캐비테이션을 방지하기 위해 수중 의 기본 루트를 잘라. 절단은 종자 홀더의 가장 기초 끝 아래 0.8-1cm 발생해야합니다.
    3. 갓 자른 식물을 화학 물질을 포함하는 튜브 중 하나에 삽입하십시오.
    4. 코일레에 물 방울이 있으면 섬세한 작업 으로 부드럽게 건조시고 닦으십시오.
      참고: 이 네 단계는 역학 연구의 불일치를 방지하기 위해 가능한 한 빨리(10분 이하) 수행해야 합니다.
  5. 열화상 카메라 아래에서 식물을 이동하고 모든 플랜트가 카메라 시야 내에 있는지 확인합니다. 필요에 따라 카메라 높이와 랙 위치를 조정합니다.

7. 녹음

  1. Ctrl + Alt + A를눌러 카메라를 코일레돈의 표면에 초점을 맞춥니다.
  2. 빨간색 단추 위로 마우스를 클릭하고 동영상 녹화 옵션을 클릭합니다. 레코딩을 확인하는 새 창이 열립니다.
  3. 1-2시간 후에 녹화를 중지합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

8. 데이터 수집

  1. 파일로 이동 | 오픈 | 올바른 을 찾아보십시오. SEQ 파일을 열고 엽니다.
  2. 동영상 재생을 중지합니다.
  3. 주 창의 왼쪽에서 측정 커서 ROI(3x3 픽셀) 아이콘추가를 클릭합니다. ROI는 관심 지역을 의미합니다.
  4. 첫 번째 식물의 코틸레돈의 중앙에 마우스를 놓고 한 번 왼쪽 클릭합니다. 커서 1이 제자리에 있습니다. 절차를 반복하여 첫 번째 식물의 두 번째 코틸레온에 라벨을 붙입니다. 레이블의 순서에 유의해야 합니다.
  5. 절차를 반복합니다. 모든 식물은 두 개의 커서로 표시해야합니다.
  6. ROIs 편집 아이콘을 클릭합니다. 메인 창에서 왼쪽 을 클릭하고 왼쪽 상단 모서리를 길게 누린 다음 오른쪽 아래 모서리로 스크롤하여 모든 ROI를 선택합니다.
  7. 통계 뷰어 아이콘 위에 마우스를 놓고 시간 플롯을선택합니다. 새 창이 열립니다.
  8. 영화를 실행합니다. 그래프가 데이터로 채워집니다.
  9. 이 창에서 오른쪽 상단 모서리에 있는 이중 화살표를 클릭하여 새 메뉴를 엽니다.
  10. 저장 아이콘을 클릭합니다. 플롯(.csv)에 X 및 Y 값으로저장합니다. 데이터를 내보낸 후 소프트웨어를 닫습니다.

9. 데이터 분석

  1. 데이터 분석 소프트웨어(예: Microsoft Excel)를 사용하여 .csv 파일을 엽니다. 세 개의 첫 번째 열(A ~ C)은 프레임 번호, 절대 시간 및 상대 시간에 대한 정보를 제공합니다. 나머지 컬럼은 시간이 지남에 따라 각 ROI의 온도를 제공합니다.
  2. 사용할 통계 도구의 특성을 결정합니다. 이 결정은 실험 설계를 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다.
    참고: 이 예제에서는 모집단 평균 및 모집단 표준 편차를 기준으로 각 샘플에 대해 표준 점수 또는 z 점수가 계산됩니다. 각 샘플에 대해 p-값은 z 점수에서 계산됩니다. 이 방법은 양성 및 음성 대조군을 확인할 뿐만 아니라 새로운 화합물의 식별을 더 테스트할 수 있게 한다.

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결과

붉은 염료 B (0.8 kDa)를 사용한 실험은 10 분 이내에 해바라기 모종의 자락에 절단 된 뿌리를 통해 눈에 띄게 흡수 되는 화학 물질의 능력을 보여줍니다(그림 1).

식물을 ABA로 치료할 때, 잎 온도의 증가는 몇 분 안에 해바라기 코틸레톤에서 검출됩니다. 잎 온도의 이 증가는 구내 조리개 및 구내 전도도의 감소와 관련이 있습니다. 증가된 잎 온도는 처리 후 15분 후에 10 μM ABA(p값 = 0.02)와 5 μM ABA(p값 = 0.003)로 20분 관찰된다(그림2). 전반적으로, 이러한 결과는 열 화상 진찰에 의한 잎 온도의 측정이 구내 조리개와 전도도를 측정하기위한 좋은 프록시임을 보여줍니다.

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토론

주어진 날에 시험될 수 있는 화합물의 수는 대부분 (i) 식물을 성장시키고 스크린을 수행할 수 있는 환경 제어 공간에 의존하며, (ii) 프로토콜의 6단계에 관여할 수 있는 개인의 수에 의존한다. 통계적 치료 후 결과의 해석을 통합하기 위해 세 가지 실험 복제를 사용하는 것이 좋습니다. 일반적인 하루에, 1 ~2 개인 을 스크리니브 수 있습니다 60 예를 들어 테스트 하 여 어려움 없이 삼중 화합물 [60 화학 물질 + 6 부정적인 (DMSO) 컨트롤 + 3 긍정적인 (ABA) 컨트롤] 아침, 정오와 오후에.

이 방법은 완전히 발달 된 코틸레온이있는 건강한 모종에 의존합니다. 이미징이 위에서 발생하기 때문에 이상적인 모종은 가능한 한 많은 정보를 수집하기 위해 hypocotyl과 코일 블레이드 사이의 90 °의 각도를 보여주어야합니다. 이 각도는 주로 빛에 의해 조절되므로 성장 조건을 조정하여 최적화해야합니다. 우리의 결과는 화학 물질이 cotyledons에 도달하는 것을 약 1...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 포모나 대학 창업 기금과 허쉬 연구 개시 보조금 기금 (FJ에)뿐만 아니라 스텔라 여름 연구 보조 프로그램 (KG)을 통해 포모나 대학 분자 생물학 프로그램에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가 없는 1020 플라스틱 성장 트레이,표준 10 x 20인치 트레이,
2.0mL 마이크로튜브, 뚜껑 없음, Genesee Scientific22-283NC
앱시스산(ABA)Sigma-AldrichA1049
에어 펌프액티브 아쿠아AAPA7.8L, 2 아웃렛, 3W, 7.8 L/min
에어스톤
화합물 라이브러리MicroSource DiscoveryNatural Product Collection
Creative Versa-Tool(장작 연소 도구)Nasco9724549
Dimethylsulfoxide(DMSO), 식물 세포 배양 테스트Sigma-AldrichD4540
드워프 태양 흑점 해바라기씨Outsidepride.com
Erythrosin BSigma-Aldrich200964
수경법 비료 세트 (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)일반 수경법GL51GH1421.31.11
Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼Kimberly-Clark Professional34155
노트북Dell
MES 수화물Sigma-AldrichM2933
미세 해부 가위
Microsoft ExcelMicrosoft
수산화칼륨(KOH)Sigma-AldrichP5958
ResearchIR 소프트웨어FLIR
R-Tech 경질 폴리스티렌 폼 보드Insulfoam
SeedholdersAraponicsN/A
Super Tub (플라스틱 유틸리티 욕조)MaccourtST3608에 사용되는 36 x 24 x 8인치 욕조
FLIRFLIR-T62101
SunSunHW-304B Pro 캐니스터 필터
배수구, , , 수경법 T450sc LWIR(장파 적외선) 휴대용 열화상 카메라 노트북 질석 정수 필터에 연결하는 데 필요한 충전 케이블 및 USB 케이블이 함께 제공됩니다.

참고문헌

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  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
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  17. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
  18. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
  19. Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).

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