여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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방법 논문
마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
호중구는 선천적인 면역 계통의 중요한 일원이고 병원체 및 병리학적인 선동적인 반응에 대하여 호스트 방어에 있는 중추적인 역할을 합니다. 호중구는 사이토 카인과 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집 될 수 있습니다. 호중구의 압도적 인 침투는 류마티스 관절염 (RA)과 같은 무차별 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 후막 삼출액으로부터 분리된 호중구는 정의된 화학유고력제, N-포밀-메트-레-페(fMLP), 트랜스웰 또는 지그몬드 챔버 어세에서 시험관내 반응한다. 공기 파우치 실험은 생체 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 향하여 호중구의 화학요법을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 보조제 유도 관절염(AA) 마우스 모델은 RA 연구에서 자주 사용되며, 항-골수페록시다아제(MPO) 또는 항호중구 엘라스타제(NE) 항체를 이용한 관절 절편의 면역조직화학적 염색은 잘 확립된 측정 방법이다. 호중구 침투. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료를 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.
서론
호중구는 가장 풍부한 백혈구이며 인간 에서 전체 백혈구 인구의 50-70 %를차지합니다 1. 호중구는 급성 염증 중 주요 응답자 중 하나입니다. 호중구는 조직 상주세포에의해 방출된 사이토카인 및 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집될 수 있다2,3,4,이는 호중구 및 혈관 내피 세포의 표면에 세포 부착 분자 사이의 상호작용에 의해 매개되는5. 호중구는 반응성 산소 종(ROS) 및 기타 조직 손상분자3,6의방출을 통해 조직을 손상시키는 강력한 능력으로 인해 병원성 염증 반응에 대한 역할을 하는 근본적인 방어및 역할을 한다.
이전 연구는 마우스 또는 인간에게서 몇몇 호중구 격리 프로토콜을 기술했습니다. Oh et al. 인간호중구를 전혈로부터 분리시키는 밀도 구배 분리 방법을 7. 그러나, 마우스 혈액에서 충분한 호중구의 분리는 작은 혈액 양 때문....
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프로토콜
모든 실험 절차는 중국 의학 동물 관리 및 사용 위원회의 베이징 대학에 의해 검토 되고 승인되었습니다.
참고: C57BL/6 마우스 (7-8 주 령)를 사용 하였다.
1. 호중구 격리
- 후막 삼출 세포의 취득
- ddH2O. 마우스 수에 따라 필요한 부피를 계산하여 신선한 10% 프로테오오스 펩톤 용액을 준비한다.
참고: 용액의 mL(2N+1)을 미리 용해및 여과해야 하는 마우스 수를 N으로 설정합니다. - 작업 공간에 70% 에탄올을 뿌린 다. 인슐린 인젝터를 사용하여 펩톤 용액 1 mL을 그리고 거품을 배출합니다.
- 마우스 당 1 mL의 펩톤 용액의 첫 번째 복강 내 주입을 수행합니다.
- 한 손으로 헤드 다운 위치에 마우스를 잡아. 알코올에 젖은 면봉으로 주사 지점을 소독하십시오.
참고: 바람직한 주입 위치는 복부의 아래 쪽 또는 오른쪽 사분면의 측면 측면에 있습니다. - 시약을 빠르게 주입하십시오. 인슐린 인젝터로 각 마우스의 복막 구멍에 1 mL을 주입하십시오.
참고 : 바늘과 피부 사이의 각도는 장이나 다른 장기를 손상시키지 않도록 약 15-30 °여야합니다.....
- 한 손으로 헤드 다운 위치에 마우스를 잡아. 알코올에 젖은 면봉으로 주사 지점을 소독하십시오.
- ddH2O. 마우스 수에 따라 필요한 부피를 계산하여 신선한 10% 프로테오오스 펩톤 용액을 준비한다.
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결과
후막 삼출 세포는 마우스의 세척액으로부터 수집하였다. 세포는 RPMI-1640 완전한 배지의 1 mL에서 재중단되었고, 2단계(54.8%/70.2%)에 층상하였다. 불연속 밀도 구배(도1A)및 30분 동안 1,500 x g에서 원심분리(≥95%, ~1 x 107 호중구/마우스)를 하부 계면으로부터 회수하였다(도1B).
공기 파우치 실험은 생체 내에서 LPS에 의해 자극된 호중구 모집을 조사하기 위해 수행하였다(도2A). 공기 파우치 압출액내의 백혈구 서브세트를 측정하였다(도
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토론
말초 혈액7,골수 및 조직18에서 고도로 정제 된 호중구의 상세한 프로토콜은 오랫동안 사용할 수 있었습니다. 여기에서 우리는 성숙한 호중구가 추가 항염증제 및 항산화 방지 연구를 위해 불활성화남아 있는 복막 액체19에서 호중구를 분리하는 방법을 채택합니다.
우리는 공기 파우치 실험을 사용하여 생체 내에서 호중구의 LPS 유도 침윤을 탐구했습니다. 이 방법은 생체 내에서 일반적인 염증 환경에서 세포 침투를 직접 측정하는 잠재적인 방법으로 제안되었다.
공기 파우치 분석은 장기 비특이적 방식으로 호중구의 기능을 입증하고 백혈구 모집 캐스케이드의 여러 단계를 제거한다는 점은 주목할 만합니다. 특정 장기에 호중구 모집은 상이한 장기 특성, 접착 분자 및 케모카인에 의존할 수 있기 때문에, 장기 특이적 조건에서 호.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81430099 및 31500704), 국제 협력 및 교환 프로젝트 (교부수 번호 2014DFA32950), 그리고 중국 의학 대학의 연구 프로그램에 의해 지원되었다 ( 부여 번호 BUCM-2019-JCRC006 및 2019-JYB-TD013).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 패스트 그린 솔루션 | Solarbio | 8348b | 한 바이알에 있는 20mg의 패스트 그레인 FCF를 다른 100mL 비커에 전달합니다. 비커에 H2O 20mL를 넣고 교반하여 염색을 용해시켜 0.1% 패스트 그린 용액을 만들고 Nalgene PES 75mm 필터 |
| 0.1% Safranin O 염색 용액 | Solarbio | 8348a | 바이알에 있는 20mg의 사프라닌 O 염색을 100ml 비커에 전달합니다. 비커에 H2O 20mL를 넣고 교반하여 염색을 용해시켜 0.1% 사프라닌 O 염색 용액을 만들고 Nalgene PES 75mm 필터 |
| 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산 용액(EDTA), pH 8.0 | 시그마 | 324506 | 멸균 |
| 100% 에탄올 | 베이징 화학 공장 | ||
| 사용하여 여과합니다.15mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Falcon | 14-959-53A | |
| 23G x 1 1/4" 바늘 | BD | 305120 | |
| 26G x 3/8" 바늘 | BD | 305110 | |
| 3% 소 혈청 알부민(BSA) | 10mL PBS에 0.3g BSA | ||
| 용해 3% H2O2 | 1mL 30% H2O2를 9mL 메탄올 | ||
| 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 키트 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30G x 1/2" 니들 | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5mL 주사기 | BD | Z683574 | |
| 50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% 에탄올 | 믹스 500 mL 100% 에탄올과 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | 믹스 2.74 mL SIP와 2.26 mL 1× PBS, 정지 상태 | ||
| 70% 에탄올 | 믹스 700 mL 100% 에탄올과 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | 믹스 3.51 mL SIP와 1.49 mL 1× PBS, 정지 | ||
| 80% 에탄올 | 800mL 100% 에탄올과 200mL dH2O | ||
| 95% 에탄올 | 혼합 950mL 100% 에탄올과 50mL dH2O | ||
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| 투과화 버퍼 | 믹스 100 μ L Triton X-100 1 L dH2O를 사용하여 0.01% Triton X-100 | ||
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 90 % ddH 2 < / sub>O와 10 % (v / v) 10 회 혼합; PBS, 오토클레이브 | ||
| 인산염 완충액 식염수(PBS), 10× | 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·를 용해합니다. 2H2O, 200mL ddH2O에서 0.48g KHsub>2PO(무수) ddH2/subO 조정, pH 7.4 조정, 오토클레이브 | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| 프로테오스 펩톤 | 옥소이드 | 1865317 | |
| 회수 버퍼 | 18mL 회수 버퍼 A와 82mL 회수 버퍼 B를 혼합하고, 1000mL에 dH2O를 추가하고, pH를 6.0으로 조정합니다 | ||
| 회수 버퍼 A IHC | 스톡 4.2g 구연산(C6H5O7· 200 mL dH2>O에 H2 | ||
| 용 검색 버퍼 B 스톡 | 5.88 g 구연산 삼나트륨 이수화물(C6H5Na3O7· 200 mL dH2sub>0) 중 2H<>sub2 | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 배지 | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 배지 | 에는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충됩니다. | ||
| Shu Rui U40 일회용 멸균 인슐린 주사 바늘 1 mL | BD | 328421 | |
| 슬라이드 | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| 솔루션 | |||
| 재고 Isotonic Percoll (SIP) | percoll 90% (v/v)와 10% (v/v) 10×를 혼합; PBS, 20분 동안 가만히 서 있습니다 | ||
| 에어 파우치 분석 | |||
참고문헌
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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