이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
호중구 떼는 호중구가 감염 부위를 봉인하고 조직 재구성을 촉진하는 협력 과정입니다. 떼는 세포 이동의 특징적인 패턴을 보여주는 동물 모델에서 생체 내에서 고전적으로 연구되었습니다. 그러나 생체 내 모델에는 접근 및 분석이 어려운 세포간 중재자뿐만 아니라 인간 호중구를 직접 분석할 수 없는 등 여러 가지 한계가 있습니다. 이러한 제한 때문에, 인간 호중구로 떼지어 연구하고 떼지어 다니는 동안 생성되는 분자 신호에 쉽게 접근할 수 있는 시험관 내 플랫폼이 필요합니다. 여기서, 다단계 마이크로스탬핑 공정은 생체 내 감염을 모방하여 떼지어를 자극하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성하는 데 사용된다. 생체 입자 마이크로 어레이는 호중구가 제어되고 안정적인 방식으로 무리를 유도합니다. 마이크로어레이에서 호중구는 속도가 증가하고 생물입자 클러스터 주변에 안정된 무리를 형성합니다. 추가적으로, 호중구에 의해 생성된 상온제는 분석되고 16개의 단백질은 무리의 과정을 통해 분별적으로 표현된 것으로 밝혀졌습니다. 이 시험관 내 무리 플랫폼은 재생 가능한 공간 제어 방식으로 호중구 이동 및 단백질 방출에 대한 직접적인 분석을 용이하게 합니다.
서론
혈류에서가장 풍부한 백혈구인 호중구는 1,3,2,3, 구획4,패혈증3,외상5,6,암1,7,8,각종 자가면역 질환5,9등 다양한 의료 조건에 관여할 수 있기 때문에 잠재적 진단 및 치료 표적으로 주목받고 있다. 호중구 떼는 연구5,10,11의특히 흥미로운 초점을 만드는 복잡성과다단계,엄격하게 규제 과정입니다. 무리 동안 호중구는 주변의 건강한 조직으로부터 염증 부위를분리5,<....
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프로토콜
저자는 친절하게 자신의 혈액을 기증 건강한 자원 봉사자를 인정합니다. 혈액 표본은 오하이오 주립 대학에 있는 생물 의학 과학 위원회에 의해 검토된 기관 검토 위원회 (IRB) 프로토콜 #2018H0268 에 따라 통보된 자원봉사자 동의 후에 장악되었습니다.
1. 생체 입자 마이크로 어레이의 미세 가공
- 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다.
- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 원하는 설계 증명을 생성한 다음 포토마스크 제조업체로 보내 크롬 포토마스크를 생성합니다. 여기에 사용된 설계는 150 μm 센터-센터 간격으로 원형으로 채워진 직경 30μm의 4mm x 4mm 직사각형 어레이입니다. 이 디자인은 다른 응용 프로그램에 대해 원하는대로 수정할 수 있습니다.
- 실리콘 웨이퍼에 음의 포토레지스트의 40 μm 두께의 층을 스핀 코팅합니다. 웨이퍼를 65°C에서 5분, 95°C에서 10분간 굽습니다.
- 웨이퍼를 150-160mJ/cm2(그림1A)로크롬 포토마스크를 통해 UV 광에 노출시다.
- 웨이퍼를 65°C에서 5분,....
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결과
호중구가 바이오 입자 마이크로 어레이에 추가되면, 생체 입자 클러스터와 접촉하는 호중구가 활성화되어 무리 반응을 시작합니다. 바이오입자 마이크로어레이는 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 생체입자 클러스터를 향한 호중구 이동을 추적하는 것으로 검증되었습니다(비디오S1). 개별 호중구 핵의 이동은 생물입자 클러스터로 이동함에 따라 추적됩니다. 호중구가 생체 입자 클러스터에 도달하면 핵이 클러스터의 다른 핵과 겹칩니다. 따라서, 이 방법을 사용하여 클러스터 내의 호중구를 정확하게 추적할 수 없다. 자이모산과 대장균 생체 입자 클러스터는 모두 호중구 무리의 생성을 초래합니다. 결과를 위해 그림 2B는 대장균 입자에 의해 생성된 호중구 군단의 데이터를 사용합니다. 도 3 및 도 2의 다른 .......
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토론
우리는 시험관 내 호중구 무리를 자극하기 위해 균일 한 바이오 입자 배열을 생성하는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리의 플랫폼의 체외 특성은 우리가 생체 내 무리 실험으로 발생하는 합병증을 우회 할 수 있습니다, 즉 호중구를 무리에 의해 방출 중재자를 분석 할 수있는 가난한 능력5. 또한 생체 내 모델은 일반적으로 설치류11,12,13,15,22,23, 또는 제브라피시11,12,
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 일은 오하이오 주립 대학에 있는 화학과 생물 분자 공학의 윌리엄 G. Lowrie 부 및 포괄적인 암 센터에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 이 보고서에 제시된 데이터는 오하이오 주립 대학의 캠퍼스 현미경 및 이미징 시설에서 사용할 수 있는 Imaris x64(9.3.0 비트플레인)를 사용하여 처리된 이미지에서 나왔습니다. 이 시설은 보조금 P30 CA016058, 국립 암 연구소, 베데스다, MD에 의해 부분적으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| "The Big Easy" EasySep 자석 | STEMCELL Technologies | 18001 | 호중구 분리 키트와 함께 사용하는 자석 |
| 세포 인큐베이터 | Okolab | 777057437 / 77057343 | 온도 및 CO2 제어를 위한 Okolab 케이지 인큐베이터 |
| EasySep 인간 호중구 분리 키트 | STEMCELL Technologies | 17957 | 인간 호중구 |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water before addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm 생검 펀치 | Sigma Aldrich | Z708925 | PDMS 스탬프를 절단하려면 |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | 신선한 인간 혈액에서 적혈구에서 버피 코트를 분리하기위한 적혈구 응집제 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 핵 형광 염색 |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | 1000개의 인간 단백질을 검출하기 위한 고밀도 어레이 |
| 인간 혈청 알부민(HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | 저내독소 HSA, 분리된 호중구를 위해 IMDM에서 2% 용액 |
| 준비 Iscove's Modified Dulbeccos' Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | 분리된 호중구 |
| K2-EDTA 튜브 | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | 혈액 채취 용 튜브 |
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참고문헌
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.....
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