이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
몇몇 프로토콜은 인간 양수 상피 세포의 분리 및 배양에 대한 문헌에서 보고되었다(HAEC). 그러나, 이들은 양상상피가 균질한 층이라고 가정합니다. 인간 양막은 반사, 태반 및 배꼽의 세 가지 해부학 영역으로 나눌 수 있습니다. 각 지역은 병리학 적 조건에서와 같은 다른 생리적 역할을 가지고 있습니다. 여기서, 우리는 3개의 단면도에서 인간 양수 조직을 해부하고 시험관내에서 유지하는 프로토콜을 기술한다. 배양에서, 반사된 양막에서 유래된 세포는 입방체 형태를 나타내었고, 태반 및 배꼽 영역 모두에서 세포는 편평상피였다. 그럼에도 불구하고, 수득된 모든 세포는 상피 표현형을 가지며, E-카데린의 면역 검출에 의해 입증되었다. 따라서, 자리에서 태반 및 반사 된 영역은 세포 구성 요소와 분자 기능이 다르기 때문에, HAEC의 사용에 대한 생리적 영향을 가질 수 있기 때문에 시험관 내 연구에서 이러한 차이를 고려해야 할 수도 있습니다. 생물 의학 연구 및 재생 의학에서 이러한 세포의 유망한 응용 프로그램.
서론
인간 양수 상피 세포 (HAEC)는 배아 발달의 초기 단계 동안, 약 8 일 후 추론에서 발생합니다. 그들은 양막1의가장 안쪽 층에서 파생되는 상피 세포의 편평상피 세포 집단에서 발생합니다. 따라서, HAEC는 배아2의3개의 생식층으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 에피블라스트로부터 다능성 세포의 잔재로 간주된다. 지난 10년간, 다양한 연구그룹은 임신 기간 동안 양막으로부터 이들 세포를 분리하는 방법을 개발하여 시험관 내 배양 모델에서 그들의 추정 다능성 관련 특성을 특성화하였다3,4.
따라서, HAEC는 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81과 같은 인간 다능성 줄기 세포(HPSC)의 특성특성이 있음을 알 수 있다; 다능 전사 인자 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 핵심; 및 증식 마커 KI67, 그들은 자기 갱신 제안5,6,7. 더욱이, 이들 세포....
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프로토콜
이 프로토콜은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (레지스트리 번호 212250-21041). 이러한 연구에서 수행된 모든 절차는 Instituto Nacional de Perinatología, 헬싱키 선언 및 보건부의 공식 멕시코 표준에 명시된 지침의 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
- EDTA를 통해 1x PBS 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0.5 m M EDTA 스톡 500 μL을 1x PBS의 500 mL에 추가하여 0.5 mM EDTA의 최종 농도를 조사합니다.
- HAEC의 배양 매체를 준비합니다. 450 mL의 높은 포도당-DMEM을 복용, 나트륨 피루브산나트륨 5 mL (100 mM), 줄기 세포에 대한 자격을 갖춘 열 비활성 태아 소 혈청 50 mL, 불필요한 아미노산 5 mL (100x), 항생제 항 미신 (100x) 5 mL, L-글루타민 5 mL로 보충하십시오. 500 μL의 메르카포에탄올 (1,000x).
- 조직을 운반하고 처리하기위한 용기를 살균 : 수술실에서 실험실로 전체 태반을 운반하는 뚜껑이있는 스테인레스 스틸 용기, 트레이 (20cm x 30cm x 8cm) 전에 전체 태반에서 혈액을 씻고 제거....
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결과
HAEC는 양막의 3개의 해부학적 영역 각각으로부터 분리되었고 개별적으로 시험관내에서 배양하였다. 배양 48시간 후, 상피 표현형을 가진 세포는 플레이트의 표면에 부착되었지만, 배지가 변경되면 제거된 세포 파편 및 부유 세포도 포함되어있지만(도 3).
1 차 배양 (passage zero, P0)의 처리 동안, 실험 데이터 분석을 방해 할 수있는 몇 가지 합병증이 발생할 수 있습니다(도 4): 시약의 오염 또는 격리 과정 동안 박테리아의 존재를 식별시 배양을 폐기하고 다른 멤브레인을 처리하는 것이 좋습니다(도 4A); 막의 불충분 한 세척으로 인해 과도 한 적혈구(그림 4B); 플레이트에 세포의 결핍 또는 유착 없음(그림 4C);<.......
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토론
우리는 용어 막에서 HAEC를 격리하는 새로운 프로토콜을 구현했습니다. 각 막은 각 세포에서 세포를 분석하기 위해 격리되기 전에 세 가지 해부학 영역으로 분할되었다는 점에서 이전 보고서와 다릅니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 상피 세포를 분리 할 때 트립신의 활성을 방해 할 수 있기 때문에 모든 혈전을 제거하는 멤브레인의 세척입니다. 이 단계를 제대로 수행하지 못하면 과도한 적혈구와 몇 가지 부착 상피 세포가있는 1 차 배양을 얻을 수 있습니다. 세포를 파종 한 후 처음 24-48 시간에서 부착이 관찰되지 않으면 배양을 폐기하는 것이 좋습니다. 또 다른 중요한 점은 효소 소화를 위한 인큐베이션 시간입니다. 잠복기가 너무 길면, 세포 생존율이 감소할 수 있고/또는 상피 형태 대신 중간엽을 가진 세포 배양이 얻어질 수있다(도 4). 또한 막 소화가 적절한 교반으로 이루어지지 않으면 막 당 적은 수의 세포를 얻을 확률.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리의 연구는 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아 데 멕시코 (21041 및 21081) 및 CONACYT (A1-S-8450 및 252756)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 기술 지원을 위해 제시카 곤잘레스 노리스와 리디아 유리리아 파레데스 비바스에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 배양 시약 | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| 동물 무함유 재조합 인간 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 항생제-항진균 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle 배지 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | 고포도당 및 HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5M |
| 배아 줄기세포 FBS, Thermo | Fisher Scientific/Gibco 10439024 | ||
| 비필수 아미노산 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| 파라포름알데히드 | 모든 브랜드 | ||
| : 인산염 완충 식염수 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| 식염수(염화나트륨 0.9%) | , 모든 브랜드 | ||
| : 피루브산 나트륨 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100mM |
| 트립신/EDTA 0.05% | , Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| 일회용 재료 | |||
| 100 µ m 세포 스트레이너 | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100mm TC 처리 배양 접시 | Corning | 430167 | |
| 24웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트 | Corning/Costar | 3526 | |
| 6웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트 | Corning/Costar | 3516 | |
| 비발열성 멸균 원심분리기 튜브 | 모든 브랜드 | 하단 | |
| 1,000 µ의 비발열성 멸균 팁; l, 200 &마이크로; L 및 10 & 마이크로;l. | |||
| 멸균 면 거즈 | |||
| 모든 브랜드 | 5, 10 및 25mL의 멸균 혈청학 피펫 | ||
| 브랜드 | 멸균 수술용 장갑 | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| 마이크로 피펫 | |||
| 전동 피펫 필러 / 디스펜서 | |||
| 500 mL | |||
| 멸균 플라스틱 도마 | |||
| 멸균 메스, 가위, 집게, 클램프 | |||
| 멸균 스테인레스 스틸 용기 | |||
| 멸균 트레이 | |||
| 튜브 로테이터 | MaCSmix | ||
| 항체 및 키트 | 항체 ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | 세포 신호 | 전달 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | 세포 신호 | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| 염소 Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| 염소 안티 래빗 Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
참고문헌
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
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