이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
몇몇 프로토콜은 인간 양수 상피 세포의 분리 및 배양에 대한 문헌에서 보고되었다(HAEC). 그러나, 이들은 양상상피가 균질한 층이라고 가정합니다. 인간 양막은 반사, 태반 및 배꼽의 세 가지 해부학 영역으로 나눌 수 있습니다. 각 지역은 병리학 적 조건에서와 같은 다른 생리적 역할을 가지고 있습니다. 여기서, 우리는 3개의 단면도에서 인간 양수 조직을 해부하고 시험관내에서 유지하는 프로토콜을 기술한다. 배양에서, 반사된 양막에서 유래된 세포는 입방체 형태를 나타내었고, 태반 및 배꼽 영역 모두에서 세포는 편평상피였다. 그럼에도 불구하고, 수득된 모든 세포는 상피 표현형을 가지며, E-카데린의 면역 검출에 의해 입증되었다. 따라서, 자리에서 태반 및 반사 된 영역은 세포 구성 요소와 분자 기능이 다르기 때문에, HAEC의 사용에 대한 생리적 영향을 가질 수 있기 때문에 시험관 내 연구에서 이러한 차이를 고려해야 할 수도 있습니다. 생물 의학 연구 및 재생 의학에서 이러한 세포의 유망한 응용 프로그램.
서론
인간 양수 상피 세포 (HAEC)는 배아 발달의 초기 단계 동안, 약 8 일 후 추론에서 발생합니다. 그들은 양막1의가장 안쪽 층에서 파생되는 상피 세포의 편평상피 세포 집단에서 발생합니다. 따라서, HAEC는 배아2의3개의 생식층으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 에피블라스트로부터 다능성 세포의 잔재로 간주된다. 지난 10년간, 다양한 연구그룹은 임신 기간 동안 양막으로부터 이들 세포를 분리하는 방법을 개발하여 시험관 내 배양 모델에서 그들의 추정 다능성 관련 특성을 특성화하였다3,4.
따라서, HAEC는 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81과 같은 인간 다능성 줄기 세포(HPSC)의 특성특성이 있음을 알 수 있다; 다능 전사 인자 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 핵심; 및 증식 마커 KI67, 그들은 자기 갱신 제안5,6,7. 더욱이, 이들 세포는 인간 질병의 동물 모델뿐만 아니라 3개의 생식층(ectoderm, mesoderm, 및내배엽)의계보 특이적 마커에 대해 양성 세포를 얻기 위해 분화 프로토콜을 사용하여 도전해 왔다. 마지막으로, HAEC는 HPSC5,9와같은 상피 성질을 유지한다는 것을 입증하는 E-cadherin을 표현합니다.
그들의 배아 기원 에서, HAEC는 항염증 및 항균 분자의분비10,11,성장 인자 및 사이토카인 방출12,면역 결핍 마우스로 이식될 때 기형종의 형성이 없고, HPSC2와대조적으로 면역 결핍 마우스로 이식될 때, 그리고 HLA 를 발현하기 때문에 면역 학적 내성, 그리고 면역 학적 내성을 표현하기 때문에 면역 학적 내성, 및 면역 학적 내성과 같은 다른 임상 응용 프로그램에 적합하게하는 다른 본질적 특성을 가지고 있습니다. 이식13.
그러나, 이전 보고는 인간 양막이 해부학적으로 생리적으로 세 가지 영역으로 나눌 수 있다는 것을 고려하지 않고 균질한 막이라고 가정했습니다: 태반 (데시두아 기저를덮는 양막), 탯줄 (탯줄을 감싸는 부분), 및 반영 (태반에 부착되지 않은 막의 나머지 부분)14. 양수의 태반 및 반사 부위는 형태, 미토콘드리아 활성, 반응성 산소 종15의검출, miRNA 발현16,및 신호 경로(17)의 활성화에서 차이를 나타낸다. 이 결과는 인간 양박이 상이체 또는 시험관 내 모델에서 수행된 추가 연구를 위해 고려되어야 하는 다른 기능을 가진 이기종 인구에 의해 통합된다는 것을 건의합니다. 다른 실험실은 전체 막에서 HAEC의 격리를 위한 프로토콜을 설계하는 동안, 우리의 실험실은 다른 해부학 적인 지구에서 세포를 격리하고, 배양하고, 특성화하는 프로토콜을 설치했습니다.
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프로토콜
이 프로토콜은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (레지스트리 번호 212250-21041). 이러한 연구에서 수행된 모든 절차는 Instituto Nacional de Perinatología, 헬싱키 선언 및 보건부의 공식 멕시코 표준에 명시된 지침의 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
- EDTA를 통해 1x PBS 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0.5 m M EDTA 스톡 500 μL을 1x PBS의 500 mL에 추가하여 0.5 mM EDTA의 최종 농도를 조사합니다.
- HAEC의 배양 매체를 준비합니다. 450 mL의 높은 포도당-DMEM을 복용, 나트륨 피루브산나트륨 5 mL (100 mM), 줄기 세포에 대한 자격을 갖춘 열 비활성 태아 소 혈청 50 mL, 불필요한 아미노산 5 mL (100x), 항생제 항 미신 (100x) 5 mL, L-글루타민 5 mL로 보충하십시오. 500 μL의 메르카포에탄올 (1,000x).
- 조직을 운반하고 처리하기위한 용기를 살균 : 수술실에서 실험실로 전체 태반을 운반하는 뚜껑이있는 스테인레스 스틸 용기, 트레이 (20cm x 30cm x 8cm) 전에 전체 태반에서 혈액을 씻고 제거하십시오. 양막의 해부, 및 양막을 세 영역으로 분리하는 플라스틱 도마.
- 수술 기구(메스, 가위, 집게 및 클램프), 500 mL 비커, 면 거즈 및 식염수 용액을 살균합니다.
2. 태반 조직 얻기
참고 : 양막은 활성 노동의 증거없이, 그리고 감염의 미생물 학적 특성없이, 제왕 절개 배달의 표시하에, 전체 기간 임신 (37-40 주)에서 여성에서 얻어졌다. 완전한 격리 및 배양 절차는 멸균 조건하에서 생체 보안 캐비닛 내에서 수행되었습니다.
- 수술실에서 탯줄을 고정하여 조직의 나머지 부분으로의 혈류를 방지합니다. 멸균 용기에 고정 된 탯줄로 태반 전체를 수집하십시오.
- 용기에 식염수 500mL를 추가하여 태반에 수분을 공급합니다.
- 용기를 닫고 실온에서 실험실로 조직을 운반하십시오.
- 생체 보안 캐비닛 안에 태반이있는 용기를 넣습니다.
참고 : 해부가 태반을 수집 한 후 15 분 이내에 수행되지 않는 경우, 처리 될 때까지 얼음에 태반과 용기를 저장합니다. 태반을 얻고 해부의 시작 사이 경과 시간의 1 시간 이상을 피하십시오.
3. 양막의 영역당 기계적 분리
참고 : 절차는 멸균 조건과 실온에서 생체 보안 캐비닛 내에서 수행해야합니다.
- 용기에서 태반 전체를 제거하고 탯줄이 위쪽을 향하여 트레이에 놓습니다.
- 멸균 면 거즈를 사용하여 태반을 덮는 융상 양막 표면에서 혈전을 청소하십시오.
- 막의 세 가지 영역을 식별: 탯줄을 둘러싸는 탯줄, 데시두아 기저를 덮는 태반 양막, 및 태반에 부착되지 않은 양막의 나머지 부분인 반사 된 영역(그림 1).
- 배꼽 양막 영역을 해부(그림 2A).
- 해부 집게를 사용하여 태반과 탯줄의 접합을 덮는 양막 부분을 잡습니다.
- 메스로, 코와 를 분리 스트레칭하는 동안 코드를 둘러싸는 영역을 해부.
- 분리된 조직을 100 mL의 식염수 로 표지된 비커에 적착시.
- 태반 양축하 부위를 해부(그림 2B).
- 멸균 면 거즈로 태반을 덮는 융상 양막 표면에서 혈전을 제거하십시오.
- 해부 집게와 태반과 반사 된 영역 사이의 경계에 막을 개최.
- 태반의 둘레를 메스로 잘라냅니다.
- 태반에서 어떤 혈관을 절단하지 않도록주의, 융자에서 태반 양막을 분리합니다.
- 분리된 조직을 식염수 300 mL로 다른 표지된 비커에 놓습니다.
- 태반에 부착되지 않은 양막의 나머지 부분(즉, 반사된 부분)을 융자로부터 분리한다(도2C).
- 300 mL의 식염수 용액으로 다른 라벨이 붙은 비커에서 반사 된 영역을 수집합니다.
참고: 해부 중에 식염수 용액을 지속적으로 첨가하여 조직이 건조해지는 것을 방지하십시오.
- 300 mL의 식염수 용액으로 다른 라벨이 붙은 비커에서 반사 된 영역을 수집합니다.
4. 멤브레인 세척
참고 : 절차는 실온에서 멸균 조건하에서 생체 보안 캐비닛 내에서 수행되어야합니다.
- 각 멤브레인 영역의 식염수 용액을 별도로 폐기하십시오.
- 배꼽 부위에 신선한 식염수 100mL를 추가합니다.
- 태반과 반사 부위에 신선한 식염수 300mL를 각각 추가합니다.
- 혈액 잔류물을 제거하기 위해 집게를 해부하는 도움으로 막을 저어.
- 식염수 용액을 폐기합니다.
- 멤브레인이 반투명 할 때까지 적어도 3 배의 세안과 동요를 반복하십시오.
- 세척으로 제거되지 않은 혈전을 멸균 거즈로 청소하기 위해 보드에 멤브레인을 놓고 확장하십시오.
참고: 그들의 존재는 트립신 기능 및 후속 세포 배양의 생존에 영향을 미치기 때문에 가능한 한 많은 적혈구를 제거하는 것이 매우 중요합니다.
5. 다른 지역에서 막의 효소 소화
참고 : 절차는 멸균 조건하에서 생체 보안 캐비닛 내에서 수행되어야합니다.
- 반사된 영역과 태반 영역을 두개 또는 세 개의 조각으로 자른다.
- 탯줄 영역을 잘라내지 마십시오.
- 각 영역의 조각을 원심분리기 튜브에 놓습니다. 반사 및 태반 부위에 0.5% 트립신/EDTA 의 20 mL을 추가하고 배꼽 부위에 0.5% 트립신/EDTA의 5 mL을 각각 추가합니다.
참고: 트립신 용액에 완전히 몰입해야 하기 때문에 반사된 부위와 태반 영역을 더 작은 조각으로 자르는 것이 중요합니다. - 원심 분리기 튜브를 가볍게 흔들어 30초 동안 트립신을 버리십시오.
- 추가 30 새로운 0.5% 트립신/EDTA의 새로운 0.5% 트립신/EDTA 의 반사 및 태반 지역에 및 15 mL의 새로운 0.5% 트립신/EDTA의 새로운 0.5% 트립신/EDTA, 각각.
- 튜브를 인큐베이터 내부의 회전자에 넣습니다.
- 37 °C에서 40 분 동안 회전 (20 rpm)으로 배양하십시오.
참고: 튜브 회전을 사용할 수 없는 경우 10분마다 튜브를 가볍게 흔들어 주세요. - 각 지역의 트립신/셀 솔루션을 새로운 원심분리기 튜브로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 효소를 비활성화하기 위해 튜브 당 37 °C에서 미리 따뜻해진 HAEC 매체의 2배 부피를 추가합니다.
- 첫 번째 소화를 얼음에 보관하십시오.
- 두 번째 소화 기간 동안 5.6-5.8 단계를 반복합니다.
- 각 영역에 대해, 해부 집게를 사용하여 양막 부분의 한쪽 끝을 잡고, 다른 쌍으로 이전 잠복기 동안 완전히 벗겨지지 않은 상피 세포의 행을 제거하기 위해 조직을 따라 짜내.
- 두 번째 소화를 다른 원심 분리기 튜브 세트로 수집하고 HAEC 용지의 2배 부피로 비활성화합니다.
- 소화된 멤브레인을 생물학적 위험 용기에 버리십시오.
6. HAEC의 격리
참고 : 절차는 멸균 조건하에서 생체 보안 캐비닛 내에서 수행되어야합니다.
- 원심분리기 는 4 °C에서 10 분 동안 200 x g의 모든 튜브를.
- 상온액을 버리고 각 펠릿을 분해하기 위해 튜브 및 파이펫당 미리 따뜻해진 HAEC 매질 10 mL(37°C)를 부드럽게 첨가합니다.
- 각 막 영역에 대한 개별 튜브에 두 소화의 세포 현탁액을 결합.
- 100 μm 셀 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하여 세포외 매트릭스 파편을 제거하고 단일 세포를 얻습니다.
- 미세 원심 분리튜브에 90 μL의 트라이판 블루로 3개의 알리쿼트를 준비합니다.
- 막 부위당 각 세포 현탁액의 10 μL을 미세 원심 분리튜브에 넣고 섞습니다.
- 광야 현미경으로 혈세포계로 세포를 세습니다.
7. 해경문화
- 3°F의 밀도에서 3×104 세포/cm2의 밀도에서 별도로 HAEC를 종자하고, 인간 표피 성장 인자(EGF)의 10 ng/mL로 보충하였다.
- 면역 화학 분석을 위해 시험관 내 또는 24 웰 플레이트에서 세포를 100 mm 플레이트에 시드합니다.
- 가습 된 인큐베이터에서 노르목 조건 (5 %CO2)에서37 °C에서 접시를 배양하십시오.
- 매일 EGF를 추가하고 3 일마다 매체를 변경합니다.
참고 : 세포는 4-6 일 후에 수렴됩니다. - 종래의 면역포도화학, 세포 선별 분석, 저온 보존, RNA 및 단백질 추출을 위해 세포를 사용하거나, 또는 통로를 계속한다.
8. 해경 통로
- HAEC 배지를 제거하고 PBS/EDTA 0.01M 용액으로 2x 세척합니다.
- 37°C에서 15분 동안 PBS/EDTA 0.01M 용액으로 배양합니다.
- PBS/EDTA를 제거하고 0.5% 트립신/EDTA의 1.5 mL를 추가합니다.
- 37 °C에서 5-8 분 동안 배양하십시오.
- HAEC 매체의 2개의 부양으로 효소를 비활성화합니다.
- 혼합 용액과 원심 분리기를 200 x g에서5 분 동안 수집합니다.
- 세포를 계산하고 다음 구절을 계속하거나 추가 분석을 위해 세포를 사용합니다.
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결과
HAEC는 양막의 3개의 해부학적 영역 각각으로부터 분리되었고 개별적으로 시험관내에서 배양하였다. 배양 48시간 후, 상피 표현형을 가진 세포는 플레이트의 표면에 부착되었지만, 배지가 변경되면 제거된 세포 파편 및 부유 세포도 포함되어있지만(도 3).
1 차 배양 (passage zero, P0)의 처리 동안, 실험 데이터 분석을 방해 할 수있는 몇 가지 합병증이 발생할 수 있습니다(도 4): 시약의 오염 또는 격리 과정 동안 박테리아의 존재를 식별시 배양을 폐기하고 다른 멤브레인을 처리하는 것이 좋습니다(도 4A); 막의 불충분 한 세척으로 인해 과도 한 적혈구(그림 4B); 플레이트에 세포의 결핍 또는 유착 없음(그림 4C);<...
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토론
우리는 용어 막에서 HAEC를 격리하는 새로운 프로토콜을 구현했습니다. 각 막은 각 세포에서 세포를 분석하기 위해 격리되기 전에 세 가지 해부학 영역으로 분할되었다는 점에서 이전 보고서와 다릅니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 상피 세포를 분리 할 때 트립신의 활성을 방해 할 수 있기 때문에 모든 혈전을 제거하는 멤브레인의 세척입니다. 이 단계를 제대로 수행하지 못하면 과도한 적혈구와 몇 가지 부착 상피 세포가있는 1 차 배양을 얻을 수 있습니다. 세포를 파종 한 후 처음 24-48 시간에서 부착이 관찰되지 않으면 배양을 폐기하는 것이 좋습니다. 또 다른 중요한 점은 효소 소화를 위한 인큐베이션 시간입니다. 잠복기가 너무 길면, 세포 생존율이 감소할 수 있고/또는 상피 형태 대신 중간엽을 가진 세포 배양이 얻어질 수있다(도 4). 또한 막 소화가 적절한 교반으로 이루어지지 않으면 막 당 적은 수의 세포를 얻을 확률...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리의 연구는 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아 데 멕시코 (21041 및 21081) 및 CONACYT (A1-S-8450 및 252756)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 기술 지원을 위해 제시카 곤잘레스 노리스와 리디아 유리리아 파레데스 비바스에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 배양 시약 | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| 동물 무함유 재조합 인간 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 항생제-항진균 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle 배지 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | 고포도당 및 HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5M |
| 배아 줄기세포 FBS, Thermo | Fisher Scientific/Gibco 10439024 | ||
| 비필수 아미노산 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| 파라포름알데히드 | 모든 브랜드 | ||
| : 인산염 완충 식염수 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| 식염수(염화나트륨 0.9%) | , 모든 브랜드 | ||
| : 피루브산 나트륨 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100mM |
| 트립신/EDTA 0.05% | , Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| 일회용 재료 | |||
| 100 µ m 세포 스트레이너 | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100mm TC 처리 배양 접시 | Corning | 430167 | |
| 24웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트 | Corning/Costar | 3526 | |
| 6웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트 | Corning/Costar | 3516 | |
| 비발열성 멸균 원심분리기 튜브 | 모든 브랜드 | 하단 | |
| 1,000 µ의 비발열성 멸균 팁; l, 200 &마이크로; L 및 10 & 마이크로;l. | |||
| 멸균 면 거즈 | |||
| 모든 브랜드 | 5, 10 및 25mL의 멸균 혈청학 피펫 | ||
| 브랜드 | 멸균 수술용 장갑 | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| 마이크로 피펫 | |||
| 전동 피펫 필러 / 디스펜서 | |||
| 500 mL | |||
| 멸균 플라스틱 도마 | |||
| 멸균 메스, 가위, 집게, 클램프 | |||
| 멸균 스테인레스 스틸 용기 | |||
| 멸균 트레이 | |||
| 튜브 로테이터 | MaCSmix | ||
| 항체 및 키트 | 항체 ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | 세포 신호 | 전달 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | 세포 신호 | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| 염소 Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| 염소 안티 래빗 Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
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