이 프로토콜은 초음파 화상 진찰에 의하여 형성된 종양의 정량화뿐만 아니라 마우스에 있는 KRAS 폐 종양을 유도하기 위하여 취한 단계를 기술합니다. 작은 종양은 B 선으로 초기 시간대에 시각화됩니다. 이후 시점에서 상대 종양 부피 측정은 초음파 소프트웨어의 측정 도구에 의해 달성됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
매년 160만 명의 피해자가 있는 폐암은 전 세계적으로 암의 부담에 크게 기여하고 있습니다. 폐암은 폐암 케이스의 ~ 25%를 구성하는 KRAS 종양유전자와 같은 종양 유전자에 있는 유전 변경에 의해 부분적으로 구동됩니다. KRAS 구동 폐암을 치료적으로 표적으로 하는 어려움은 부분적으로 실험실에 있는 질병의 진행을 모방할 수 있는 가난한 모형이 있기에서 유래합니다. 우리는 초음파 화상 진찰을 통해 Cre 유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모형에 있는 1 차적인 KRAS 폐 종양의 상대적인 정량화를 허용하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 폐 자렌치의 밝기 (B) 모드 획득에 의존한다. 이 모형에서 처음에 형성되는 종양은 B 선으로 구상되고 취득한 심상에 있는 B 선의 수를 계수해서 정량화될 수 있습니다. 이들은 마우스 폐의 표면에 형성된 상대적인 종양 수를 나타낼 것이다. 형성된 종양이 시간이 지남에 따라 발전함에 따라 폐 실치내의 깊은 갈라짐으로 인식됩니다. 형성된 종양의 둘레가 잘 정의되기 때문에, 상대적인 종양 부피를 계산하는 것은 종양의 길이 및 폭을 측정하고 이를 종양 캘리퍼스 측정에 사용되는 공식에 적용함으로써 달성된다. 초음파 화상 진찰은 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 수시로 이용되는 비침범성, 빠르고 사용자 친화적인 기술입니다. 비록 유물은 초음파 심상을 취득할 때 나타날 수 있더라도, 이 화상 진찰 기술은 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 화상 진찰과 같은 그밖 화상 진찰 기술에 비교된 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 더 유리하다는 것을 보여주었습니다 생물 발광 이미징 (BLI). 연구원은 마우스의 다른 단 사이 폐 종양 개시 그리고 진행을 비교해서 이 기술을 사용하여 새로운 치료 표적을 조사할 수 있습니다.
서론
전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로, 폐암은 주로 실험실에서 질병을 재현 할 수있는 관련 전임상 모델의 부족으로 인해 치료에 불응성 남아있다1. 폐암 케이스의 약 25%는 KRAS 종양유전자2에있는 돌연변이 때문이. KRAS 구동 폐암은 수시로 이 질병에 있는 추가 연구 결과의 중요성을 강조하는 치료에 나쁜 예후 및 낮은 반응과 연관됩니다2.
KRAS 폐암 유발 면역유능한 마우스에서 폐종양 성장에 대한 상대적 평가를 실시간으로 할 수 있는 방법을 최적화하였다. 우리는 KRAS G12D 종양유전자가 Cre lentiviral 벡터3,4에의해 발현될 수 있는 록스 스톱 록스 KRAS G12D(LSL-KRAS G12D) 마우스를 사용합니다. 이들 벡터는 탄산 무수드라아제 2에 의해 구동되며, 바이러스 감염이 폐포 상피세포5에서특이적으로 일어날 수 있도록 한다. 또한, 폐 종양의 개시 및 진행을 가속화하기 위해, 렌티바이러스 구조체는 또한 U6/H1 프로모터로부터 P5....
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프로토콜
동물 연구는 맥길 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행되었으며 절차는 맥길 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다 (동물 사용 프로토콜 # 2009-5754).
1. CA2Cre-shp53 렌티바이러스 티트르의 세대
참고: 다음 프로토콜은 Xia 등6에설명된 프로토콜과 동일하며 사소한 수정이 있습니다.
- 렌티 바이러스의 준비 (15cm x 10cm 요리)
- 1일째, 건강한 HEK293T 세포(10cm 접시당 7.5 x 106세포)와 덜베코의 변형된 독수리 배지 10 mL(DMEM), 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 펜/스트렙. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 배양한다.
- 칼슘 인산염 형혈 (15 접시 혼합물)에 대한 혼합물을 준비합니다. 렌티바이러스 벡터(Ca2Cre-shp53), PsPAX2 플라스미드(HIV-1 개그 및 HIV-1 폴 유전자 함유), 75 μg(5 μg/plate)의 렌티바이러스 벡터(Ca2Cre-shp53), 75 μg(5 μg/plate)를 함유하는 튜브 A를 준비합니다. 최종 농도0.15 M의 CaCl
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결과
렌티바이러스 전염성 역가를 얻어 ~2 x 10 6 TU/mL(도 1), LSL-KRAS G12D 마우스가 적절한 연령(6-8주)에 도달했을 때 Ca2Cre-shp53 렌티바이러스를 경내 주사하였다(도1). 초음파 화상 진찰은 종양의 개시시 감염의 7 주 후에 수행되었습니다(그림 3B). 이미징은 LSL-KRASG12D 마우스 모델에서 발생하는 다양한 유형의 전구체 병변을 포함하기 위해 7주에서 수행되었으며, 감염 8주 후 도4A에 나타난 바와 같이 증식에서 선종3에 이르기까지 다양하게 진행되었다. 6 주 이전에 화상 진찰은 분석3에서선종 형성 .......
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토론
우리는 초음파에 의한 Cre-유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모델에서 폐 종양 성장을 평가할 수 있는 방법을 입증한다. 이 방법은 폐 종양 성장에 대한 약리학적 억제제의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 유전 배경의 마우스 사이 폐 종양 성장을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 특수 한 계산 기술이 필요하지 않지만, 다른 마우스 그룹을 비교하는 데 사용되는 방법을 사용하는 경우 적절한 비교를 허용하기 위해 분석에 사용되는 프레임 수를 체계적으로 하는 것이 중요합니다.
LSL-KRAS G12D 마우스에서 ~2 x 106 TU/mL Ca2Cre-shp53의 내외 삽관은 감염 7 주 후에 전구체 병변의 형성으로 이끌어 냈습니다. 이러한 영도 흰색 선으로 표시 하 고 B 라인 이라고(그림 3B)12.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
렌티바이러스 Ca2Cre-shp53 벡터에 대해 박사 I. Verma에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 보건연구원(CIHR MOP 137113)에서 AEK에 대한 기금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 &무; m Acrodisc 주사기 필터 | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm 셀 컬트 플레이트 | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-웰 세포 배양 플레이트 | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 원심 필터 유닛 | Merck Millipore Ltd. | ||
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 렌티바이러스 벡터 | Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D 마우스 | JAX 마우스 | 8179 | |
| MX550S; 센터 전송: 40MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| 펜/스트렙 | 멀티셀 | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
참고문헌
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8(2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al.
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재인쇄 및 허가
