방법 논문

살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화

DOI:

10.3791/60567

⸱

2020년 1월 12일

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

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여기서, 우리는 NF-θB를 발현하는 세포주에서 활성화된 B 세포(NF-θB)의 핵 인자 카파-라이트 체인 인핸서를 빠르고 쉽게 측정하는 프로토콜을 제시한다:루시퍼라아제 리포터 구성, 세포 용해물 내 발광의 측정을 통해. 추가적으로, 유전자 발현은 살모넬라 티피무리움에 감염된 세포로부터 분리된 RT-qPCR을 통해 결정된다.

초록

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dimeric 전사 인자 NF-θB는 다양한 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도함으로써 염증 경로를 포함한 많은 세포 반응 경로를 조절한다. NF-θB는 B 세포 억제제, 알파(IθBα)에서 카파광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 억제 단백질 핵 인자에 의해 세포졸에서 세포적으로 발현되고 격리된다. NF-θB의 활성화는 IθBα의 분해를 요구하며, 이는 NF-θB에 핵 국소화 신호를 노출시키고 핵으로의 인신매매를 촉진한다. 일단 핵에서, NF-θB는 그들의 발현을 촉진하기 위해 인터류키핀 6(IL-6) 및 IL-23과 같은 NF-θB 표적 유전자의 운동 영역에 결합한다.

NF-θB의 활성화는 전사 또는 번역과 독립적으로 발생합니다. 따라서, NF-θB의 활성화 상태는 핵에서 특별히 NF-θθ를 정량화하거나, NF-θB 표적 유전자의 발현을 정량화함으로써 측정되어야 한다. 이 프로토콜에서, NF-θB로 안정적으로 형질감염된 세포는 시험관내 조직 배양 기술을 사용하여 NF-θB 활성화를 위해 분석된다. 이 세포는 NF-θB를 활성화하기 위하여 살모넬라 티피무륨에 감염되고, 이는 핵으로 트래픽및 루시퍼라아제라아제의 프로모터 지구에 있는 θB 사이트에 결합하여, 그것의 발현을 유도합니다. 세포는 루시퍼라아제 분석 시스템으로 분석하고 분석한다. 세포에 의해 생성된 루시퍼라아제의 양은 플레이트 리더에 의해 검출되는 발광 신호의 강도와 상관관계가 있습니다. 이 절차에 의해 생성된 발광 신호는 다양한 조건 하에서 NF-θB 활성화를 평가하는 빠르고 매우 민감한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 발현을 나타내는 상대적인 mRNA 수준을 검출하기 위해 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)을 이용한다.

서론

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단백질의 핵 인자-θB (NF-θB) 가족은 다양한 생물학적 경로에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 전사 활성제이다. NF-θB의 활성화는 표적 유전자의 전사를 유도하며, 그 중 많은 것이 면역 및 염증 반응, 세포 증식, 스트레스 반응 및 암진행에중요하다1,2. NF-θB는 병원체 클리어런스를 위한 초기 염증 결과를 중재하는 데 필수적인 역할을 합니다. NF-θB 활성화에 의해 매개되는 많은 생물학적 과정을 감안할 때, 신호의 중단은 건강과 질병에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. NF-θB 신호에 있는 기능 돌연변이의 손실은 몇몇 면역 결핍 표현형에서 연관되는 반면, 기능 돌연변이의 이득은 B 세포 림프종 및 유방암을 포함하여 암의 몇몇 모형과 연관됩니다3. 부가적으로, 많은 병원체는독성 인자4,5,6,7의발현을 통해 NF-θ의 활성화 상태를 직접 조절하는 것으로 나타났다.

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프로토콜

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1. 세포 통과 및 파종

  1. 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 독수리 매체(DMEM)의 10 mL를 함유하는 75 cm2 플라스크에서 HeLa 57A 세포를 유지합니다.
  2. 흡기 세포 배양 배지및 0.05% 트립신-EDTA 용액의 1 mL로 세척한다. 트립신을 흡인하고 추가로 1 mL로 교체하십시오. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 4-5분 동안 놓고 세포가 플라스크에서 분리되도록 합니다.
  3. 9 mL의 세포 배양 배지를 추가하고 플라스크의 바닥을 몇 번 부드럽게 씻어 세포를 빼내고 균일 한 현탁액을 형성합니다.
  4. HeLa 57A 세포를 신선한 매체에 1:6 또는 1:8로 희석시키고 씨앗을 새 플라스크에 넣습니다. 통로 세포는 90% confluent 또는 매 3 일마다 및 최소 25% conflue에서 세포를 유지할 때.
  5. 세포 자극 하루 전에, HeLa 57A 세포를 시도하고 성장 매체의 10 mL에서 중단. 혈세포계를 사용하여 현탁액의 세포를 카운트하고 성장 매체를 사용하여 50 mL 원엽 튜브에서 2.5 x 105 세포 /mL의 최종 농도로 세포를 희석시다.
  6. 250....

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결과

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여기서 설명된 분석은 HeLa 세포의 라인으로 안정적으로 형질이 되는 NF-θB 의존성 루시퍼라제 리포터를 사용하여 전사 인자 NF-θB의 활성화에 초점을 맞추고 있다. 활성화된 NF-θB는 단백질 염증성 사이토카인 IL6 및 IL23을포함하는 표적 유전자의 σB 결합 부위를 결합하는 핵으로 전이한다. NF-θB 활성화에 대한 일반적인 개요는 그림 1에설명되어 있습니다. 그람 음성 박테리아 살모넬라 장테리카 혈청바르 티피무리움은 NF-θB의 활성제 및 IL6의 후속 발현으로서 본 연구에서사용되었다(도 2). 병인 발생에 필요한 주요 독성 인자 중 하나는 S를허용하는 타입 III 분비 시스템-1 (T3SS-1)입니다. 티피무륨은 세포를 감염시키고 NF-θB 활성화를 유도한다. T3SS-1.......

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토론

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설명된 프로토콜의 주요 기여는 세포에서 NF-θB 활성화를 검출하는 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 이는 NF-θB 활성화에 영향을 미치는 다중 자극 조건 또는 약물의 높은 처리량 분석을 허용한다는 것입니다. 여기서, 우리는 살모넬라-감염된HeLa 세포에서 NF-θB 활성화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 세포는 NF-θB 활성화에 세균성 감염의 충격을 공부하기 위하여 뿐만 아니라 그밖 병원체를 가진 감염을 위해 이용될 수 있습니다. 또한, HeLa 57A 세포에서의 NF-θB 의존성 루시퍼라제 활성화는 NF-θB 활성화로 이어지는 신호 경로의 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 48 웰 플레이트에서 HeLa 57A 세포를 시드하지만, 이러한 실험은 실험 당 더 많은 샘플을 허용하기 위해 96- 심지어 384 웰 플레이트까지 확장 될 수있다. HeLa 57A 세포는 β-gal 측정을 사용하여 세포 수 및 생존가능성에 대한 내부 대조군으로 측정될 수 있는 LacZ를 구성하여 발현한다.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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Keestra-Gounder 실험실에 있는 연구는 수상 번호 R21AI122092의 밑에 NIH의 NIAID및 상 번호 1-18-JDF-035의 밑에 미국 당뇨병 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
접착 필름VWR International60941-070
클로로포름피셔 생물 시약C298-500
DMEMThermo Fisher11665092
DNAse 처리 키트Qiagen79254
dNTP PromegaU1511
에탄올피셔 생물 시약BP2818100분자 등급
FBSSigma-AldrichF0926
HeLa 57A 세포참조 # 15
대용량 cDNA 역전사 키트응용 Biosystems4368814
이소프로판올피셔 바이오시약BP26181
카나마이신피셔 바이오시약BP906-5
LB 한천피셔 생물 시약BP1425-500
용원 육수Fisher 생물 시약BP1426-500
MgCl2Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000Thermo Scientific분광 광도계
PromegaE1501세포 용해 완충액 및 루시페린 기질
랜덤 헥사머Thermo ScientificSO142
실시간 GAPDH 포워드 프라이머5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
실시간 GAPDH 리버스 프라이머5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
실시간 IL-23 포워드 프라이머5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
리얼타임 IL-23 리버스 프라이머5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
실시간 IL-6 포워드 프라이머5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
실시간 IL-6 리버스 프라이머5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'Reverse
TranscriptaseApplied Biosystems4308228
RNAse inhibitorThermo ScientificEO0381
RT 버퍼PromegaA3561
SL1344Ref # 17
SL1344 Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039Ref # 18
SL1344 Δ sopE 및 델타; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039Ref # 18
SYBR greenApplied Biosystems43091552x mastermix
Tri-reagent분자 연구 센터TR 118구아니딘 티오시아네이
트 트립신 -EDTA써모 피셔253000540.05% 트립신-EDTA
초순수피셔 바이오시약
PCR용 BP248450웰 플레이트VWR International89218-294384웰 플레이트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
  2. Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8....

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