이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

21.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60575

⸱

2020년 1월 29일

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.

서론

제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있지만, 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFNs), 클러스터된 정기적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPRs)이 최근에는 제브라피시 게놈2,3을직접 표적으로 하는 데 사용되고 있다. 이러한 역유전적 전략은 전방 유전학 및 높은 처리량 스크린과 함께 유전자 발현 및 기능을 연구하는 강력한 모델로 zebrafish를 확립했습니다.

유전자 기능을 연구하는 능력은 일반적으로 유전자 또는 유전자 생성물 발현의 시간적 분포에 대한 평가를 필요로 한다. 초기 발달 도중 그 같은 발현 패턴을 구상하기 위하여 일반적으로 이용되는 2개의 기술은 기업 혼성화 (ISH) 및 전체 마운트 면역성 화학 (IHC)에서 입니다. situ 혼성화는 1969년에 처음 개발되었고 유기체4에서mRNA 발현을 검출하기 위해 표지된 안티센스 RNA 프로브의 사용에 의존한다. 대조적으로, 표지된 항체는 단백질 발현을 구상하기 위하여 면역성 화학에서 이용됩니다. 검출을 위한 단백질 표지의 아이디어는 1930년대5로 거슬러 올라가고 첫번째 IHC 실험은 FITC 표지된 항체가 감염한 조직에 있는 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 이용될 때 1941년에 간행되었습니다6. ISH와 IHC는 이후 수십 년 동안 크게 진화하고 개선되었으며 현재 분자 및 진단 연구 실험실7,8,9,10,11에서일상적으로 사용됩니다. 두 기술 모두 장점과 단점이 있지만 IHC는 ISH에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 실질적으로, IHC는 ISH보다 훨씬 적은 시간이 소요되며 일반적으로 1차 항체의 비용에 따라 저렴하다. 또한, mRNA 발현은 항상 단백질 풍부도의 약 3분의 1만이 mRNA풍부도 12에의해 설명될 수 있다는 것을 마우스 및 인간에서 입증된 바와 같이 단백질 발현의 신뢰할 수 있는 메트릭이 아니다. 이러한 이유로 IHC는 가능한 경우 ISH 데이터를 확인하는 중요한 보충 자료입니다. 마지막으로, IHC는 ISH13,14및15로결정할 수 없는 세포내 및 공동 지역화 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아 및 유충 전체에서 면역조직화학에 의해 단백질을 안정적으로 검출하는 단계별 방법을 설명한다. 이 기술의 목적은 전체 배아에서 관심 있는 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 결정하는 것이다. 이 기술은 항원 특이적 1 차 항체 및 형광 태그이 붙은 이차 항체를 이용합니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직 섹션에 사용하고 형광 대신 발색 기질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 제브라피시 골격 근을 개발하는 것은 아세틸 콜린 수용체 이외에, ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현한다는 것을 보여줍니다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 소단위는 23 hpf에서 세로 근육에서 검출할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 제브라피쉬 사육 성인 및 배아와 함께 작업하는 절차는 머레이 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배아 수집 및 고정

  1. 하룻밤 동안 시스템 물로 채워진 메쉬 또는 슬롯 라이너와 탱크에 성인 제브라피쉬 혼합 섹스 쌍 또는 그룹을 배치하여 산란 탱크를 준비합니다.
  2. 불이 켜진 경우, 산란 탱크 물을 변경하여 담수계물을 제거합니다. 오전 9시에 조명이 켜진 14 h/10 h 의 밝은 어두운 주기를 사용하십시오.
  3. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려보릅니다.
  4. 이송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어 올려 수집하거나 메쉬 스트레이너에 부어.
  5. 계란을 배아 배지(예: 0.5 mg/L 메틸렌 블루의 30% 다니오 또는 E2 배아 배지)로 채워진 페트리 접시에 옮기면 접시당 배아 수가 50개로 제한됩니다.
  6. 죽었거나 분열하지 못한 계란을 제거합니다.
    참고: 죽은 배아는 불투명해지고 종종 "흐린" 것처럼 보이기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 메틸렌 블루가 배아 배지에 첨가되면 죽은 배아는 진한 파란색 모양을 취합니다.
  7. 원하는 단계에 도달할 때까지 28.5 °C에서 계란의 접시를 배양합니다. 이 실험을 위해, 배아를 23 hpf까지 올린다.
  8. 선택적) 배아를 24 hpf에서 200 μM으로 200 μM으로 옮기고 1-페닐 2-티우레아(PTU)를 배아 배지에서 옮기면 멜라닌 발생을방지16,17. 대안적으로, 표백제 배아 후 고정(선택적 섹션 5 참조).
  9. 매일 배아 배지 또는 PTU 배지를 변경하십시오.
  10. 입체 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치되지 않은 배아를 초초리오네이트. 대안적으로, 화학적으로 배아를 실온에서 몇 분 동안 배아 배지에서 1 mg/mL Pronase로 배양하여 배아를 배양한다. Pronase에서 배아를 제거하고 배아 배지로 세 번 씻으하십시오.
  11. 디코리오네이트 배아는 플라스틱에 달라붙을 것입니다. 배아 배지에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 보관하십시오. 손상을 최소화하기 위해 불에 연마 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 데코리오네이트 배아를 이동합니다.
  12. 플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 mL 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.
  13. 마이크로파이펫으로 배아 배지를 제거합니다. 각 유체 변경 후 배아를 덮을 만큼 충분한 액체만 둡니다.
  14. 화학 연기 후드에 1x 인산완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
    주의: PFA는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.
  15. 배아를 4% PFA에서 1-2시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 고정시다. 대안적으로, 배아를 4°C에서 하룻밤까지 4시간 동안 고정한다.
  16. 1x PBS + 1% 트리톤-X(PBTriton)에서 3회 5분 동안 세척하세요.
  17. 배아를 즉시 사용하거나 최대 1주동안 4°C에서 보관하십시오.
  18. 장기 보관을 위해 배아를 100% 메탄올(MeOH) 2시간 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 탈수시합니다. 배아를 MeOH에서 -20°C에서 몇 개월 동안 저장하였다.
    주의: MeOH는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.

2. 배아 준비

  1. 실온에서 직렬 배양을 통해 배아를 재수화하십시오.
    1. 75% MeOH/25% 1x PBS로 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.
    2. 50 % MeOH / 50 % 1 x PBS로 5 분 동안 배양하십시오.
    3. 25% MeOH/75% 1x PBS를 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.
    4. 100 % PBTriton에서 5 분 동안 인큐베이션, 흔들.
  2. (선택 사항) 신선한 단백질타아제 K 원료(10 mg/mL)를 얼음에 10 μl의 단백질타아제 K 스톡(10 mg/mL)을 첨가하여 얼음 위에 신선한 단백질정제 K 작업 용액(10 μg/mL)을 준비합니다.
    1. 피야테라제 K에서 최대 30분까지 소화하여 배아를 투과시켜 배아를 투과시합니다.
      참고 : 제안 된 타이밍은 <24 hpf입니다 : 소화 없음; 24 hpf: 15 분 소화; 7 일 : 30 분 소화.
    2. PBTriton에서 배아를 헹구고 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 다시 고정하십시오.
    3. PBTriton에서 배아를 3회 3회 세척하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 5분 간 세척합니다.

3. 1 차 항체 배양

  1. 2 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)의 유무에 관계없이 이차 항체 숙주 종(예: PBTriton에서 10% 염소 혈청)과 일치하는 상업적 차단 용액 또는 혈청을 선택한다.
  2. 배아를 실온에서 1-3시간 동안 차단하거나 4°C에서 하룻밤 동안 흔들면서 차단용액으로 차단한다.
  3. 1차 항체에서 배양하여 반동하는 동안 4°C에서 하룻밤 동안 PBTriton에서 차단 용액 또는 1% 혈청으로 희석하였다. 본 실험에서, 사용된 1차 항체는 항-NMDAR1, 항-팬-AMPA 수용체, 및 항포스-히스톤 H3였으며, 각각 PBTriton에서 1% 염소 혈청에서 1:500의 최종 농도로 희석하였다.
  4. 흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 5 회 씻어 내주세요.

4. 이차 항체 배양

  1. 원발성 항체및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.
  2. 이차 항체에 배양하여 반락 용액 또는 1% 혈청을 실온(또는 4°C에서 하룻밤)에서 2시간 동안 동안 흔들어 서 배양한다.
    참고: 형광 이차 항체는 빛에 민감합니다. 우리는 1:500 염소 반대로 마우스 Alexa488를 PBTriton에 있는 1% 염소 혈청에 희석했습니다 사용했습니다.
  3. 이 모든 후속 단계에 대한 빛 차단 상자로 알루미늄 호일 또는 커버튜브를 덮습니다.
  4. 흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 세 번 씻으하십시오.
  5. 배아배지에서 2% 아가로즈의 침대 위에 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 문서화를 진행하거나 아래의 추가 처리 단계를 진행한다.

옵션 단계

5. 표백

  1. ddH2O의 810.7 μL, 89.3 μL의 2 M KOH, 및 30% H2O2의100 μL을 추가하여 1.5 mL 튜브에서 표백제를 준비한다.
  2. 튜브를 세 번 뒤집어 혼합합니다.
  3. 배아에 표백제 용액 방향의 피펫 1 mL.
  4. 배아 튜브 캡을 열어 가스가 빠져나오도록 합니다. 벤치의 튜브를 가볍게 두드려 거품을 빼냅니다.
  5. 표백 과정을 모니터링하고 (필요한 경우 현미경을 사용) 안료가 충분히 제거 될 때 반응을 중지 (약 5 24 hpf에 대한 분 또는 72 hpf에 대한 10 분).
  6. 조심스럽게 마이크로 파이펫으로 표백 용액을 제거하고 PBTriton의 1 mL에서 배아를 세 번 헹구어.
    참고: 배아는 이 단계에서 끈적끈적합니다.
  7. 아래 문서 또는 추가 처리 단계로 진행하십시오.

6. 배아 해부 및 탈교

  1. 노른자를 제거하려면, 소량 (~200 μL 또는 배아를 완전히 덮을 만큼 충분히 제한적이지만 부유 할 수있는 곳을 제한할 만큼 제한적)을 1x PBS를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮니다.
  2. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 1개 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.
  3. 초미세 집게와 00 개의 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어 냅니다 (2014 년 Cheng et al., 2014 참조)18.
  4. 노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS를 보충하십시오.
  5. 배아가 노른자가 충분히 없을 때까지 반복합니다.

7. 슬라이드에 플랫 장착

  1. 탈열 된 배아를 플라스틱 파이펫또는 트리밍 팁으로 1 mL 마이크로 파이펫으로 충전 된 유리 슬라이드로 옮기십시오 (전단 응력 감소). 200 μL 마이크로파이펫 팁 또는 곤충 핀으로 원하는 대로 방향을 지정합니다.
  2. 김 닦음이나 종이 타월로 여분의 PBS를 제거하십시오.
  3. 슬라이드와 커버슬립에 2-3 방울의 마운팅 미디어를 추가합니다.
  4. 약 5-10분 동안 공기 건조.
  5. 뚜껑 유리를 투명한 매니큐어로 슬라이드에 밀봉합니다.
    참고 : 커버 유리의 가장자리는 완전히 매니큐어의 얇고 연속 층으로 덮여 있어야합니다.
  6. 이미징 전에 약 10분 동안 건조시키십시오.

8. 아가로즈에 장착

  1. 배아 배지에 0.5 g의 아가로스를 50 mL의 배아 배지를 마이크로파 안전 플라스크 또는 비커에 첨가하여 배아 배지에 1% 아가로스를 원하는 것보다 3배 이상 더 많이 준비한다.
  2. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 30s마다 소용돌이치는 열을 가열합니다.
  3. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 1 mL aliquots를 만드십시오. 별칭을 실온에서 보관하십시오.
  4. 가열하기 전에 캡 잠금 장치로 튜브 캡을 덮습니다.
  5. 아가로즈 튜브를 부유식 튜브 홀더에 물이 반쯤 채워진 비커에 놓습니다.
  6. 비커를 부동 튜브로 2-3분 간 또는 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌리십시오.
  7. 다듬어진 팁으로 플라스틱 파이펫 또는 200 μL 마이크로파이펫으로 배아를 브리지 슬라이드로 옮기십시오(전단 응력 감소).
  8. 곤충 핀을 사용하여 직사각형 커버 슬립에 배아를 배치하고 약 20 μL 용융 아가로스를 배아에 직접 추가합니다.
  9. 00 개의 곤충 핀을 사용하여 커버 슬립에 가장 가까운 관심 영역을 신속하게 지향하고 있습니다.
    참고: 이것은 거꾸로 된 마운트입니다.
  10. 필요에 따라 각 사용과 전자레인지 사이에 아가로즈 튜브를 온수 튜브 플로트에 되돌려 주세요.
  11. 아가로즈가 경화될 때 현미경을 이용한 이미지. 거꾸로 된 현미경에 사용하기 위해 장착 된 배아를 거꾸로 유지하십시오. 직립 현미경에 사용하기 위해 커버 슬립을 뒤집습니다 (아가로즈가 커버 슬립 아래에 있으므로)

9. 브리지 슬라이드에 장착

  1. 브리지 슬라이드를 만들기 위해 접착제 사각형 은 슈퍼 접착제의 작은 점을 사용하여 유리 슬라이드에 립을 덮습니다.
    참고: 커버슬립 사이에 는 최소 5mm 너비의 트로프가 있어야 합니다. 2개의 #1 커버립은 전형적으로 24-48 hpf 배아에 적합하고 3개의 커버립은 72 hpf를 위해 필요할 지도 모릅니다.
  2. 1-2개의 탈종된 배아를 플라스틱 파이펫으로 다리미끄럼또는 트리밍팁으로 200 μL 마이크로파이펫으로 옮기십시오(전단 응력 감소).
  3. 김 닦음이나 종이 타월로 여분의 액체를 제거하십시오.
  4. 배아에 직접 ≥80% 글리세롤 한 방울을 추가합니다.
  5. 직사각형 커버 유리로 덮습니다. 글리세롤의 물방울은 커버 유리를 만져야합니다.
  6. 배아의 측면에 글리세롤의 여백으로 배아를 완전히 덮기 위하여 필요에 따라 커버 유리와 슬라이드 사이 공간에 더 많은 글리세롤을 추가하십시오.
  7. 직사각형 커버 유리를 부드럽게 밀어 배아를 이미징을 위해 제자리로 굴리십시오.

10화 DAB 염색

참고: 이 섹션은 위의 4.2단계 이후 시작하여 4단계의 나머지 부분을 대체합니다.

  1. 배아를 반옥시다제-이차 항체로 차단 용액에 배합하여 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어.
  2. PBTriton에서 실온에서 10 분 동안 세 번 씻으소서.
  3. 배아를 배양 판 또는 우울증 슬라이드로 전사 파이펫으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을
  4. ddH2O와 0.3% 과산화수소 의 50 μL을 1% DAB(3,3'diaminobenzidine)의 50 μL을 혼합하고 PBS로 1 mL로 가져온다.
    주의: DAB는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 DAB 오염 된 액체 및 고형물을 지정된 장소에서 폐기하십시오.
  5. 위에서 준비한 DAB 용액으로 HRP 염색 배아를 덮고 현미경으로 색 발달(전형적으로 1-5분)을 모니터링합니다.
  6. 원하는 색상 발달 수준에 도달한 후 PBS에서 배아를 간단히 헹구어 보시고 자합니다.
  7. 배아를 고정하기 전에 1.5 mL 튜브로 다시 옮김을 옮김시.
  8. 실온에서 4% PFA에서 15-20분 동안 배아를 다시 고정시.
  9. PBTriton에서 배아를 3회 5분 동안 세척합니다.
  10. 설명서를 진행합니다.

11. 슬라이드에 장착된 염색 단면 조직을 위한 수정된 프로토콜

  1. 파프 펜으로 염색할 조직을 둘러싸는다.
  2. 슬라이드를 습한 챔버로 옮김으로 옮김.
  3. 슬라이드에 직접 1mL의 PBS를 추가합니다.
  4. 실온에서 7분 동안 배양하여 임베딩 배지를 제거합니다.
  5. 슬라이드를 반전하여 PBS를 붓습니다.
  6. TNT 버퍼의 최대 1 mL에서 1 분 재수화 (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).
  7. 실온에서 1시간 동안 최대 1mL의 차단 용액(상업용 또는 10% 혈청 + 2% BSA)을 차단합니다.
  8. 1% 혈청 또는 차단 용액을 4°C에서 희석한 1차 항체에서 하룻밤 동안 배양한다.
  9. 실온에서 TNT 버퍼의 최대 1mL에서 5회 세척하십시오.
  10. 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 이차 항체로 배양합니다. 챔버를 호일로 덮거나 어두운 뚜껑을 사용하십시오.
  11. 실온에서 TNT로 5회 세척하십시오. 마지막 세척을 붓습니다.
  12. 장착 매체와 커버 슬립 2-3 방울로 마운트합니다. 5-10 분 앉아 보자.
  13. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 유리를 슬라이드에 밀봉합니다. 이미징 전에 완전히 건조시키십시오.

12. 문서

  1. 랩 노트북에 전체 프로시저 및 편차를 기록합니다.
  2. 1차 항체의 농도, 이름, 카탈로그 번호, 제조사 및 로트 수를 기록한다.
  3. 적절하게 장착된 샘플을 현미경 단계에 놓습니다. 관심 지역을 찾습니다.
  4. 비교적 밝은 예제를 선택합니다. 카메라 노출과 게인을 설정하여 신호가 포화되지 않고 충분히 밝아지않도록 합니다.
  5. 실험용 항체 표지 배아와 대조군 항체(예: IgG) 배아를 비교할 때 동일한 노출 설정을 사용하여 동일한 관심 영역의 염색 강도를 비교합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

전체 마운트 면역히스토화학은 항체를 사용하여 손상되지 않은 동물에서 단백질 발현의 공간 패턴을 검출합니다. 면역히스토화학의 기본 워크플로우(그림 1에묘사됨)는 제브라피시 사육, 배아 사육, 배아 사육 및 준비, 비특이적 항원 차단, 항원 특이적 1차 항체를 사용하여 관심 있는 단백질을 표적으로 하고, 표지된 이차 항체로 1차 항체를 검출하고, 시편을 장착하고, 발현을 문서화하는 것을 포함한다.

전체 마운트 면역 히스토화학은 제브라피시 발달 중 공간 및 시간 단백질 발현을 연구하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 19 hpf 이전에 시작하여 갭 접합에 의해 매개된 자발적인 수축을 나타낸다 - 운동 뉴런 접촉 전19. zebrafish 신경 근육 접합, 다른 척...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습니다. 제브라피시의 IHC는 암24,대사질환25,신경질환26,그리고 인간의 건강과 의외로 많은 다른 분야에 대한 이해를 증진시키는 데 필수적이다. IHC의 한 가지 주요 장점은 절차가 ISH와 같은 다른 기술에 비해 상대적으로 짧고 기술적으로 까다롭지 않다는 것입니다. 그러나, 표본의 나이, 표적으로 되는 항원 및 항체에 근거를 둔 최적화를 요구하는 수많은 단계가 있습니다.

이...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 정보가 없습니다.

감사의 글

NIH 보조금 8P20GM103436 14.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로스피셔 사이언티픽BP160-100
알루미늄 호일, 헤비 듀티커클랜드어떤 브랜드든 대체될 수 있습니다:
Anti-NMDA 항체Millipore SigmaMAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), 클론 RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)Millipore Sigma
MABN832 소 혈청 알부민(BSA)Fisher ScientificBP1600-100
질산칼슘 [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
원심분리기 튜브, 1.5mLAxygenMCT150C
투명 매니큐어Sally Hanson모든 매니큐어 또는 경화제는 대체할 수 있습니다.
우울증 (오목한) 슬라이드전자 Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
Embryo medium, Danieau, 30 %17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES.
배아 배지, E27.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L 메틸렌 블루
플로팅 튜브 홀더Thermo Scientific59744015
형광 복합 현미경Leica BiosystemsDMi8
형광 실체현미경Leica BiosystemsM165-FC
유리 커버 슬립 18mm x 18mmCorning284518
유리 커버 슬립 22mm x 60mmThermo Scientific22-050-222
유리 슬라이드Fisher Scientific12-544-4
글리세롤Fisher ScientificBP229-1
염소 안티 마우스 IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES 솔루션Sigma AldrichH0887
뚜껑이 있는 습한 챔버SimportM920-2
과산화수소, 30%Fisher ScientificH325-500
면역 팝 펜Vector labsH-4000
곤충 핀, 크기 00스톨팅5213323
황산 마그네슘 (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
메쉬 스트레이너Oneida모든 브랜드로 대체될 수 있습니다.
메탄올Sigma Aldrich34860
메틸렌 블루Sigma AldrichM9140
마이크로 튜브 캡 잠금장치 Research Products International145062
전자 레인지Toastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Normal goat serumMillipore SigmaS02L1ML
Nutating mixerFisher Scientific88-861-044
파라 포름 알데히드Fisher Scientific04042-500
파스퇴르 피펫Fisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount 마운팅 매체Fisher ChemicalSP15-500
페트리 접시(유리)Pyrex3160100
페트리 접시(플라스틱)Fisher ScientificFB0875713
1-페닐 2-티오우레아아크로스 유기물207250250
인산염 완충 식염수(PBS), 10x, pH 7.4Gibco70011-044
인산염 완충 식염수(PBS),dH2O 염화칼륨(KCl)에 희석된 10x 스톡으로 만든 1x
AldrichP9333
수산화칼륨(KOH)FisherP250-500
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)시그마 알드리치P5655
프로나제시그마 알드리치10165921001
단백질분해효소 K인비트로젠AM2544
염화나트륨 (NaCl)시그마 알드리치S7653
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
산란 탱크, 뚜껑 및 인서트 포함AquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
Superglue gel3M Scotch
TNT100mM 트리스, pH 8.0; 150mM 염화나트륨; 0.1% 트윈20; dH2O
전사 피펫Fisher13-711-7M
트리클로로아세트산(Cl3CCOOH)시그마 AldrichT6399
Tris Base,Fisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500으로 제작
초미립자 집게Fisher Scientific16-100-121
물, 초순수/이중 증류Fisher ScientificW2-20
1xSigma, , , ,

참고문헌

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

단백질 발현공초점 현미경 검사항체 염색조직 고정블로킹 용액2차 항체마운팅 전략형광 검출
제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.