제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

요약

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.

서론

제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다^1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있....

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 제브라피쉬 사육 성인 및 배아와 함께 작업하는 절차는 머레이 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배아 수집 및 고정

1. 하룻밤 동안 시스템 물로 채워진 메쉬 또는 슬롯 라이너와 탱크에 성인 제브라피쉬 혼합 섹스 쌍 또는 그룹을 배치하여 산란 탱크를 준비합니다.
2. 불이 켜진 경우, 산란 탱크 물을 변경하여 담수계물을 제거합니다. 오전 9시에 조명이 켜진 14 h/10 h 의 밝은 어두운 주기를 사용하십시오.
3. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려보릅니다.
4. 이송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어 올려 수집하거나 메쉬 스트레이너에 부어.
5. 계란을 배아 배지(예: 0.5 mg/L 메틸렌 블루의 30% 다니오 또는 E2 배아 배지)로 채워진 페트리 접시에 옮기면 접시당 배아 수가 50개로 제한됩니다.
6. 죽었거나 분열하지 못한 계란을 제거합니다.
   참고: 죽은 배아는 불투명해지고 종종 "흐린" 것처럼 보이기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 메틸렌 블루가 배아 배지에 첨가되면 죽은 배아는 진한 파란색 모양을 취합니다.
7. 원하는 단계에 도달할 때까지 28.5 °C에서 계란의 접시를 배양....

결과

전체 마운트 면역히스토화학은 항체를 사용하여 손상되지 않은 동물에서 단백질 발현의 공간 패턴을 검출합니다. 면역히스토화학의 기본 워크플로우(그림 1에묘사됨)는 제브라피시 사육, 배아 사육, 배아 사육 및 준비, 비특이적 항원 차단, 항원 특이적 1차 항체를 사용하여 관심 있는 단백질을 표적으로 하고, 표지된 이차 항체로 1차 항체를 검출하고, 시편을 장착하고, 발현을 문서화하는 것을 포함한다.

전체 마운트 면역 히스토화학은 제브라피시 발달 중 공간 및 시간 단백질 발현을 연구하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 19 hpf 이전에 시작하여 갭 접합에 의해 매개된 자발적인 수축을 나타낸다 - 운동 뉴런 접촉 전^19. zebrafish 신경 근육 접합, 다른 척.......

토론

면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습니다. 제브라피시의 IHC는 암^24,대사질환^25,신경질환^26,그리고 인간의 건강과 의외로 많은 다른 분야에 대한 이해를 증진시키는 데 필수적이다. IHC의 한 가지 주요 장점은 절차가 ISH와 같은 다른 기술에 비해 상대적으로 짧고 기술적으로 까다롭지 않다는 것입니다. 그러나, 표본의 나이, 표적으로 되는 항원 및 항체에 근거를 둔 최적화를 요구하는 수많은 단계가 있습니다.

이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	피셔 사이언티픽	BP160-100
알루미늄 호일, 헤비 듀티	커클랜드		어떤 브랜드든 대체될 수 있습니다:
Anti-NMDA 항체	Millipore Sigma	MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), 클론 RR002	Millipore Sigma	05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)	Millipore Sigma
MABN832 소 혈청 알부민(BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
질산칼슘 [Ca(NO3)2]	Sigma Aldrich	C4955
원심분리기 튜브, 1.5mL	Axygen	MCT150C
투명 매니큐어	Sally Hanson		모든 매니큐어 또는 경화제는 대체할 수 있습니다.
우울증 (오목한) 슬라이드	전자 Miscroscopy Sciences	71878-01
Diaminobenzidine	Thermo Scientific	1855920
Embryo medium, Danieau, 30 %			17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES.
배아 배지, E2			7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L 메틸렌 블루
플로팅 튜브 홀더	Thermo Scientific	59744015
형광 복합 현미경	Leica Biosystems	DMi8
형광 실체현미경	Leica Biosystems	M165-FC
유리 커버 슬립 18mm x 18mm	Corning	284518
유리 커버 슬립 22mm x 60mm	Thermo Scientific	22-050-222
유리 슬라이드	Fisher Scientific	12-544-4
글리세롤	Fisher Scientific	BP229-1
염소 안티 마우스 IgG Alexa 488	Invitrogen	A11001
HEPES 솔루션	Sigma Aldrich	H0887
뚜껑이 있는 습한 챔버	Simport	M920-2
과산화수소, 30%	Fisher Scientific	H325-500
면역 팝 펜	Vector labs	H-4000
곤충 핀, 크기 00	스톨팅	5213323
황산 마그네슘 (MgSO4 · 7H2O)	Sigma Aldrich	63138
메쉬 스트레이너	Oneida		모든 브랜드로 대체될 수 있습니다.
메탄올	Sigma Aldrich	34860
메틸렌 블루	Sigma Aldrich	M9140
마이크로 튜브 캡 잠금	장치 Research Products International	145062
전자 레인지	Toastmaster
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I8765
Normal goat serum	Millipore Sigma	S02L1ML
Nutating mixer	Fisher Scientific	88-861-044
파라 포름 알데히드	Fisher Scientific	04042-500
파스퇴르 피펫	Fisher Scientific	13-678-20C
PBTriton			1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount 마운팅 매체	Fisher Chemical	SP15-500
페트리 접시(유리)	Pyrex	3160100
페트리 접시(플라스틱)	Fisher Scientific	FB0875713
1-페닐 2-티오우레아	아크로스 유기물	207250250
인산염 완충 식염수(PBS), 10x, pH 7.4	Gibco	70011-044
인산염 완충 식염수(PBS),	dH2O 염화칼륨(KCl)에 희석된 10x 스톡으로 만든 1x
	Aldrich	P9333
수산화칼륨(KOH)	Fisher	P250-500
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)시	그마 알드리치	P5655
프로나제	시그마 알드리치	10165921001
단백질분해효소 K	인비트로젠	AM2544
염화나트륨 (NaCl)	시그마 알드리치	S7653
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)	Sigma Aldrich	S7907
산란 탱크, 뚜껑 및 인서트 포함	Aquaneering	ZHCT100
SuperBlock PBS	Thermo Scientific	37515
Superfrost + 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-15
Superglue gel	3M Scotch
TNT			100mM 트리스, pH 8.0; 150mM 염화나트륨; 0.1% 트윈20; dH2O
전사 피펫	Fisher	13-711-7M
트리클로로아세트산(Cl3CCOOH)	시그마 Aldrich	T6399
Tris Base,	Fisher Scientific	S374-500
TritonX-100	Sigma Aldrich	T9284
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500	으로 제작
초미립자 집게	Fisher Scientific	16-100-121
물, 초순수/이중 증류	Fisher Scientific	W2-20

1xSigma, , , ,