Method Article

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

DOI:

10.3791/60577

⸱

May 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Technical Chemistry, Gottfried-Wilhelm-Leibniz Universität Hannover

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 단백질 A 열을 사용하여 세포 수확 및 단백질 정량화에 선행된 자동화된 마이크로 bioreactor에 있는 실험의 디자인을 실행하는 상세한 절차를 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원하는 제품의 수율을 높이기 위해 바이오 공정의 최적화는 바이오 제약 산업에서 중요합니다. 이것은 변형 률 선택과 생물 공정 매개 변수를 개발하여 달성 할 수 있습니다. 이 목적을 위해 사용 된 쉐이크 플라스크. 그러나, 그들은 pH 및 용존 산소 (DO)와 같은 공정 파라미터를 제어 할 수있는 능력이 부족합니다. 이러한 한계는 자동화된 마이크로 바이오리액터의 도움으로 극복될 수 있다. 이러한 생물 반응기는 더 큰 규모로 재배를 모방합니다. 이 시스템의 주요 장점 중 하나는 소프트웨어에 실험 설계(DOE)를 통합하는 것입니다. 이러한 통합을 통해 여러 공정 파라미터를 동시에 변경할 수 있는 설계를 수립할 수 있습니다. 중요한 공정 파라미터와 최적의 바이오 공정 조건을 소프트웨어 내에서 분석할 수 있습니다. 여기에 제시된 작업의 초점은 재배 실행 내에서 DOE의 소프트웨어 및 통합에서 프로세스 설계와 관련된 단계를 사용자에게 소개하는 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

글로벌 바이오 의약품 시장은 2018년에 2,500억 달러 이상의 가치를 지니고 있으며 지속적으로1개사업을 확장하고 있습니다. 제약 회사들은 작은 분자 약물을 생산하는 것에서 재조합 단백질과 같은 생명 공학적으로 생산된 치료제로 옮겨가고 있습니다. 이들 만이 1,500억 달러 이상의 수익을 책임지고있습니다. 포유류 세포는 이제 이러한 약제학적 재조합 단백질의 생산에 광범위하게 사용된다. 현재 포유류 세포에 의해 생산된 68개의 승인된 제품 중 57개는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)에 의해 생산된다2. CHO 세포는 특히 번역 후 수정을 필요로 하는 재조합 단백질의 생산에 사용됩니다. 이들 세포는 현탁액에서 성장함에 따라 바람직하며, 이에 따라 화학적으로 정의된 배지3,,4. CHO 세포를 사용하는 또 다른 장점은 생성물의 글리칸 구조가 인간 단일클론 항체(mAb)의 글리칸 구조와 유사하고 유전자 증폭5로 인한 재조합 단백질 수율 및 특이적 생산성을 초래한다는것이다.

재....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 사전 배양 절차

참고: 1 x 107 세포/mL의 가능한 세포 농도를 가진 재조합 CHO DG44 세포가 이 프로토콜에 사용된다.

  1. 1.2 mL의 세포를 함유하는 바이알을 실온으로 해동시키고 즉시 10 mL의 차가운 종자 배지를 함유하는 15 mL 원추형 원심분리관으로 세포 현탁액을 옮김을 옮김.
  2. 원심분리기 튜브를 190 x g 및 실온에서 5분간 원심분리하고 상온을 버린다.
  3. 종자 배지의 150 mL을 500 mL 쉐이크 플라스크에서 36.8°C로 예열한다.
  4. 미리 데운 종자 배지의 10 mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 세포를 쉐이크 플라스크로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮니다.
  5. 플라스크에서 샘플의 1 mL을 사용하여 세포 카운터를 사용하여 초기 VCC 및 생존 가능성을 측정합니다.
    참고: 생존력은 성공적인 재배를 위해 해동 후 70 % 이상이어야합니다.
  6. 36.8°C및 7.5%CO2에서 궤도 셰이커(셰이커 직경 19 mm)에 쉐이크 플라스크를 120 rpm의 흔들림률로 배양합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 수행된 재배에 대한 개요는 그림 2에제시되어 있습니다.

figure-results-1
도 2: 배양스테이션에서 pH 및 교반기 속도 프로파일을 시험하기 위한 실험 조건의 개략적 표현. 그림은 또한 선박을 배치하는 올바른 레이아웃을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자동화된 마이크로 바이오리액터의 세포 성장은 다용도 생물반응기와 비교할 수 있다. 그림

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수율을 높이기 위한 공정의 최적화는 바이오 제약 산업에서 매우 중요합니다. 쉐이크 플라스크는 잠재적으로 균주의 스크리닝에 사용될 수 있다; 그러나 pH 및 DO와 같은 공정 파라미터의 모니터링은 플라스크에서 사용할 수 없습니다. 마이크로 바이오리액터는 공정을 지속적으로 모니터링하고 제어할 수 있다는 장점이 있습니다. 마이크로 바이오리액터의 이러한 제어 루프는 또한 더 큰 규모의 것과 유사한 조건을 제공하므로 더 큰 규모의 생물 반응기와 비교할 수 있는 결과를 제공합니다. 마이크로 바이오리액터의 또 다른 장점은 시간과 노동력면에서 벤치 탑 바이오리액터와 비교할 때 동일한 시간 프레임 내에서 더 낮은 비용으로 테스트할 수 있는 광범위한조건(12,,13)이다. 크기가 작을수록 기판의 양이 감소하고 병렬 작업에 대한 공간 요구 사항이 감소하여 운영 비용이 절감되는 측면에서도 유리합니다. 그러나, 용기의 비용은 벤치 탑 다용도 바이오.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 분데스장관 퓌르 빌둥 und Forschung (BMBF), 교육 및 연구의 연방 정부, 독일, 그리고 사르토리우스 스테딤 생명 공학 GmbH의 바이오 프로세싱 팀에 감사드립니다, 독일, 그들의 지원에 대한.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL 일회용 피펫 팁, 멸균Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0040
200 mM L-글루타민Corning, Merck25-005-CV
24 웰 딥 웰 플레이트Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0038
5 mL 일회용 피펫 팁, 멸균Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0039
ambr 15 automated microbioreactor systemSartorius Stedim Biotech GmbH001-2804
ambr 15 세포 배양 24 일회용 생물 반응기 - SpargedSartorius Stedim Biotech GmbH001-1B86
소포제 C 에멀젼Sigma-Aldrich, MerckA8011
보틀 탑 멸균 필터Corning, MerckCLS4314740.1 μ m 기공 크기
CEDEX 세제 (3% 뮤코솔)Roche Innovatis AG05-650-658-001
세포 계수기Roche Innovatis AG05-650-216-001CEDEX HiRes
CHO DG44 cell lineCellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)Sigma-Aldrich, MerckCR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)Sigma-Aldrich, MerckCR80026
CHOKO 생산 매체Sigma-Aldrich, MerckCR80027
CHOKO 재고 배양 MeiumSigma-Aldrich, MerckCR80028
Chromaster 고압 액체 크로마토그래피 시스템VWR International
원추형 원심분리기 튜브Corning, MerckSIAL0790
EthanolMerck
글리신Carl Roth56-40-6
HPLC 바이알VWR InternationalSUPLSU860181
PBSSigma-Aldrich, MerckP4417
단백질 A 컬럼Thermo Fisher Scientific1502226POROS™ 1.7  mL
염화나트륨Sigma-Aldrich, Merck7647-14-5
인산나트륨 이염기성 무수Sigma-Aldrich, Merck7558-79-4
Trypan BlueVWR InternationalVWRVK940
YSIYSI Inc2900DYSI 2900 Select
1070179026

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
  2. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Micro BioreactorDesign of ExperimentChinese Hamster OvaryProcess OptimizationBioprocess ParametersDOE SoftwareCell CultureStirring RPMDissolved OxygenpH Control

Related Articles