배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Summary

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

Abstract

전사 인자는 항암 치료에 대한 좋은 표적을 만드는 다양한 다운스트림 과정에 영향을 미치는 수많은 표적 유전자의 발현을 바꿀 수 있습니다. 그러나, 직접 표적화 전사 인자는 종종 어렵고 전사 인자가 하나 이상의 성인 조직에서 필요한 경우 부작용을 일으킬 수 있다. 암세포에서 전사 인자를 비정상적으로 활성화시키는 업스트림 레귤레이터를 식별하는 것은 특히 이러한 단백질이 약물이 쉬운 경우 보다 실현 가능한 대안을 제공합니다. 여기서, 우리는 암세포에서 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하기 위해 배열된 중간 규모의 렌티바이러스 라이브러리 및 이중 루시퍼라제 기반 전사 리포터 분석기를 결합하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 기술한다. 우리의 접근은 단 하나 실험에 있는 유전자의 수백을 시험하는 빠르고, 쉽고, 저렴한 쪽을 제안합니다. 이러한 접근법의 사용을 입증하기 위해, 우리는 예관련 단백질(YAP) 및 전사 공동 활성제와 PDZ 결합 모티프(TAZ)의 여러 조절제를 포함하는 배열된 렌티바이러스 RNAi 라이브러리의 스크린을 수행하였고, 이는 하마 통로의 하류 이펙터인 2개의 전사 공동 활성제이다. 그러나, 이 접근은 거의 모든 전사 요인 또는 공동 요인의 레귤레이터를 위해 스크린하기 위하여 수정될 수 있고 또한 CRISPR/CAS9, cDNA, 또는 ORF 라이브러리를 검열하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

Introduction

이 분석의 목적은 바이러스 성 라이브러리를 사용하여 상대적으로 빠르고 저렴한 방식으로 전사 인자의 조절자를 식별하는 것입니다. 비정상적인 전사 활성은 암 및 전이^{1,2,23,34,45,6,,6}따라서 암세포에서 전사 인자를 표적으로 하는 것은 유망한 치료 접근법이다. 그러나, 전사 인자는 종종 약리학적으로^{표적화하기} 어렵고 많은 것이 성인 조직에서 정상적인 세포 기능에 요구되며^8,,9,,10. 질병을 유도하기 위하여 전사 인자를 비정상적으로 활성화하는 암 관련 통로를 표적으로 하는 것은 보다 적게 가혹한 부작용이 있을 가능성이 있는 더 실행 가능한 접근입니다. 배열된 렌티바이러스 및 레트로바이러스 RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA 또는 ORF 라이브러리의 상업적 가용성은 연구원이 단일 실험에서 수많은 유전자의 중요성을 테스트할 수 있게 합니다. 그러나 변경된 전사 활동에 대한 신뢰할 수 있는 판독이 필요합니다.

여기에서, 우리는 암세포에 있는 전사 인자를 조절하는 단백질을 확인하기 위하여 이중 luciferase 기지를 둔 전사 기자 분석및 배열된 lentiviral 도서관의 사용을 기술합니다. 이 분석에서, 표적 암 관련 유전자가 렌티바이러스 전달을 통해 포유류 암 세포로 전달되고 세포는 puromycin을 사용하여 안정된 통합을 위해 선택된다. 세포는 조사되고 있는 전사 인자에 특이적인 프로모터에 의해 구동되는 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 리포터 구조로 다음에 형질감염되고, 조사되고 있는 전사 인자에 반응하지 않는 구성활성 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라을 발현하는 제어 컨스트럭트. 우리는 YAP 및 TAZ, 하마 경로^8,,10,,11의중요한 다운 스트림 이펙터의 규제 기관에 대한 개념 증명 화면으로이 접근 방식을 보여줍니다. YAP 및 TAZ의 비정상적인 활성은 전이성^{캐스케이드(11)의} 여러 단계를 촉진하고 많은 암^{11,,12,,13에서}관찰된다. 그러나, YAP와 TAZ가 몇몇 암세포에서 비정상적으로 활성화되는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. YAP와 TAZ는 DNA를 결합하지 않고, 대신 다른 전사 인자에 의해 발기인에게 모집됩니다. 전사 인자의 TEA 도메인 (TEAD) 가족의 구성원은 YAP 및 TAZ에 대한 주요 결합 파트너이며 대부분의 YAP 및 TAZ 의존적 기능에 중요합니다. 우리의 기자 구성은 YAP/TAZ-TEAD 반응 프로모터로부터 반딧불 루시퍼라아제를 표현하고 이전 연구는 YAP-TEAD 및 TAZ-TEAD 전사 활성^2,,14,,15의변화를 충실하게 검출한다는 것을 입증하였다.

당사의 접근 방식은 신속하고 중간 처리량이며 스크리닝 시설, 자동화 된 로봇 또는 풀링 된 라이브러리의 깊은 시퀀싱이 필요하지 않습니다. 비용은 상대적으로 낮으며 상업적으로 이용 가능한 라이브러리가 많이 있습니다. 필요한 장비와 시약은 또한 대부분의 실험실에서 상대적으로 표준입니다. 루시퍼라제 기반 리포터가 존재하거나 생성되는 경우 거의 모든 전사 계수의 조절자를 스크리브하는 데 사용할 수 있다. 우리는 암세포에 있는 shRNAs를 스크린하기 위하여 이 접근을 이용합니다, 그러나 적당한 효율성으로 형질전환될 수 있는 어떤 세포주든지 배열된 도서관의 어떤 모형든지로 이용될 수 있었습니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜의 회로도 요약은 그림 1에나와 있습니다.

1. 렌티 바이러스 벡터 라이브러리 준비

참고 : 시연 된 화면은 96 웰 플레이트에서 글리세롤 주식으로 구입 한 배열 된 shRNA 라이브러리를 사용했지만 라이브러리는 후보 목록을 기반으로 수동으로 조립 할 수도 있습니다. 적절한 컨트롤을 고려하고 라이브러리에 포함해야 합니다. 이는 비표적대조군 shRNA(shNTC), 조사중인 전사 인자를 표적으로 하는 대조군 shRNA를 포함하며, 가능하다면, 반딧불 루시퍼라아제를 표적으로 하는 shRNA를 포함한다.

1. 1.3 mL의 루리아 국물 (LB) (1 % 바토 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 1 % NaCl, pH 7.5)을 100 μg / mL의 암피실린을 함유 한 96 웰 딥 웰 플레이트의 각 우물에 추가하십시오. 글리세롤 스톡 2 μL로 각 우물을 접종하고 225 rpm에서 일정한 교반으로 밤새 37 °C에서 성장합니다.
2. 각 세균 배양을 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 21,000 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 박테리아를 펠렛한다.
3. 제조자의 프로토콜에 따라 세균 미니 준비 키트를 사용하여 각 벡터를 정화합니다.
4. 분광광도계를 사용하여 각 벡터의 농도를 결정합니다.
5. 플라스미드를 -20°C에 보관합니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

2. 배열 된 렌티 바이러스 라이브러리의 포장

참고 : 감염 된 세포의 포장, 감염 및 후속 배양을 포함하여 렌티 바이러스와 관련된 모든 작업은 엄격하게 제도적 생물 안전 규칙 및 규정을 따라야합니다.

1. 완전한 성장 배지(Dulbecco의 변형 된 이글 배지(DMEM)를 사용하여 4mMM L-글루타민을 함유하는 293FT 세포를 확장, 4,500 mg/L 포도당과 나트륨 피루브산, 10% 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 100 단위 / mL, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 항생제 및 2 mM L-글루타민으로 보충.
2. 1.4단계에서 라이브러리의 각 벡터에 대해, 1 x 10⁵ 293FT 셀을 가진 1개의 24웰 시드를 시드한다.
   참고: 3단계로 진행하기 전에 대조군 바이러스 벡터의 일부 추가 웰을 패키징하고 바이러스의 적기를 테스트하는 데 사용하는 것이 좋습니다(아래 참조).
3. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 24시간 동안 배양합니다.
   참고: 이전에^설명한 렌티바이러스 포장에 대한 일반적인 프로토콜은 이 프로토콜에 대해 24개의 웰로 축소되었습니다. 렌티바이러스 포장에는 psPAX2를 사용하고 VSVG를 코트 단백질로 사용합니다. 에스트로픽 바이러스가 필요한 경우 VSVG 대신 Eco를 제공하는 벡터를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표적 세포의 30%-70% 감염 효율을 제공하는 바이러스 성 적기를 달성하도록 최적화되는 것이 좋습니다(토론 참조). 사용된 모든 벡터 목록은 보충 표 1을 참조하십시오.
4. 아래에 설명된 바와 같이 단계 1.4로부터 각 바이러스 벡터에 대한 형질감염 혼합물을 설정한다. 각 형질감염은 바이러스 벡터의 250 ng, psPAX2의 125 ng, VSVG의 125 ng, 형질감염 시약 1의 1.25 μL 및 23.75 μL의 형질전환 버퍼를 포함해야 한다(재료 표참조).
   1. 각 렌티바이러스 벡터를 뉴클레아제없는 물로 50 ng/μL로 희석한 다음 5 μL (250 ng)을 96웰 PCR 플레이트의 우물로 옮니다.
   2. "X"가 총 형질 감염 수와 파이펫 팅 중 부피 손실을 고려한 몇 가지 추가 형질 전환 버퍼의 1.25 μL * X형형질 시약 1 및 23.75 μL * X를 혼합하여 형질감염 슈퍼 믹스를 만듭니다.
   3. 5 분 동안 실온에서 형질 전환 슈퍼 믹스를 배양.
   4. 2.4.3 단계에서 트랜스펙션 슈퍼 믹스 튜브에 psPAX2 및 125 ng * X의 125 ng * X를 추가하고 부드럽게 위아래로 파이펫을 섞습니다. 2.4.5단계로 빠르게 진행합니다.
   5. 즉시 단계 2.4.4에서 PCR 스트립의 각 튜브로 혼합물을 알리쿼트한 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여 25 μL의 혼합물을 단계 2.4.1로부터 바이러스 벡터를 함유하는 각각의 웰내로 이송한다.
   6. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
   7. 2.4.6단계에서 각 96웰로부터 30 μL을 2.3단계에서 293개의 FT 셀을 함유하는 24웰의 웰로 이송한다.
5. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 24시간 동안 배양한 다음 24웰 플레이트의 모든 웰에서 500 μL의 신선한 완전 성장 매체로 미디어를 교체합니다. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 배양하여 다른 24시간 동안 배양합니다.
6. 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 각각의 웰및 aliquot 220 μL (3 단계에서 1 감염에 충분하고 약간의 추가 부피)에서 바이러스 상급체를 2 개의 96 웰로 수집합니다. 이들은 배열 된 바이러스 상판 플레이트입니다.
7. 배열된 바이러스 상층 판을 -80°C에 보관한다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 또한 3단계로 진행하기 전에 감염될 세포에 패키징된 추가 제어 바이러스(위 참조)를 테스트하는 것이 좋습니다. 이는 적시자가 적어도 30% 감염 효율을 달성하기에 충분한지 확인하기 위한 것이다.

3. 스크린을 위한 세포의 감염

참고 : 인간 흑색종 세포 (A375)는이 접근법을 입증하는 데 사용되었지만,이 방법은 렌티 바이러스로 감염되는 모든 부착 세포에 적용 될 수 있습니다. 그러나, 세포 배양 및 도금 조건은 각 세포주별로 최적화되어야 한다(토론 참조).

1. 완전한 성장 매체에 감염되는 세포를 확장한다.
2. 종자 24-웰 플레이트와 1 x 10⁵ 세포를 0.5 ml의 완전한 성장 매체당. 시드는 각 바이러스 벡터에 대해 잘 테스트(대조군 포함)하고 3.7단계에서 약물 선택을 위한 대조군역할을 할 감염되지 않을 여분의 웰을 포함한다.
3. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 24시간 동안 배양합니다.
4. 3.2단계에서 각각 의기류로부터 상이한 바이러스성 상상류를 다음과 같이 동결배열된 렌티바이러스 상수체로 각각 잘 감염시켰다.
   1. 20 μg/mL 폴리브렌을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오.
   2. 2.7단계에서 상온으로 배열된 렌티바이러스 라이브러리 과민제를 해동한다.
   3. 3.2단계로부터 24웰 플레이트로부터 성장 매체를 흡인하고 즉시 각 웰에 200 μL의 폴리브레인 함유 성장 매체를 첨가한다.
   4. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 단계 3.4.2에서 24 웰에 각 96 웰에서 바이러스 상류의 200 μL을 전송 3.4.3.
5. 24-48 h에 대해 5%_CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다.
   참고: 몇몇 세포주 shRNA를 표현하고 puromycin 저항하기 위하여 24 시간 이상 요구할 수 있습니다. 여기서 사용되는 바이러스 벡터는 3'UTR의 puroR에서 miR30-기반 shRNA를 이용한 터보-GFP-IRES-puroR를제공한다(도 1). 감염 효율 및 puromycin 저항 성 유전자 및 shRNA의 발현은 녹색 형광 단백질에 의해 모니터링되었다.
6. 2.5 μg/mL 푸로마이신을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오.
   참고 : puromycin의 선택 농도는 세포주에 따라 다릅니다. 각 세포주마다 항생제 사살 곡선을 투여하여 스크린 에 앞서 분석하는 것이 좋습니다.
7. 각 웰로부터 매폐를 흡인하고 500 μL의 푸로마이신 함유 완전 성장 매체로 교체한다.
   참고 : 또한 puromycin 선택이 완료되도록 후속 단계에서 사용할 수있는 제어 비 감염 잘에 puromycin을 추가해야합니다.
8. 48 시간 동안 5 %_CO2로 37 °C에서 세포를 배양하십시오.
   참고 : 48 h를 선택하는 것이 가장 좋습니다, 그래서 도금 밀도와 바이러스 성가기는 세포가 48 시간 이전에 과잉 되지 않도록 최적화되어야한다.
9. 감염된 세포가 형광 현미경 의 밑에 녹색이고, puromycin으로 잘 처리된 통제에 세포가 4단계로 진행하기 전에 모두 죽은다는 것을 확인하십시오.

4. 이중 루시퍼라아제 리포터의 형질전환용 시종 세포

참고: 각 새로운 세포주에 대한 최적의 시드 밀도를 결정하기 위해 테스트 형질감염이 이루어져야 합니다.

1. 트립시니화 단계 3.9에서 각 웰을 전송하고 다음과 같이 새로운 24-웰 플레이트에 해당 위치에서 우물로 대략 1 x 10⁵ 셀을 전송합니다.
   참고: 이 프로토콜은 수백 개의 shRNA가 있는 라이브러리의 스크리닝을 위해 설계되었기 때문에 감염된 세포의 모든 우물을 계산하는 것은 불가능합니다. 따라서, 아래 단계는 대략 동등한 도금 밀도를 보장하기 위해 각 우물의 셀 수를 추정하는 데 사용되었다.
   1. 3.9단계에서 3-4그룹으로 웰을 그룹화하여 그룹의 모든 웰이 유사한 세포 밀도를 갖도록 한다.
   2. 트립시니화 1 각 그룹에서 잘 1 트립신-EDTA의 200 μL (1 x PBS 보충 0.5 mM EDTA 와 0.1% 트립신) 5 분 동안 37 °C. 그런 다음 완전한 성장 매체를 함유하는 400 μL의 푸로마이신을 첨가하여 트립신-EDTA를 중화시켰다.
   3. 각 대표자 수를 잘 계산하여 전체 성장 매체를 사용하여 각 대표자로부터 세포 현탁액을 2 x 10⁵ 셀/mL로 잘 희석한다.
   4. 종자 0.5 mL (1 x 10⁵ 세포) 단계 4.1.3에서 새로운 24 웰 플레이트상에 해당 위치로 각 웰을 배양하고 37 °C에서 5 %_CO2로 24 시간 동안 이 새로운 24 웰 플레이트를 배양합니다.
   5. 단계 4.1.1에서 각 그룹에 대해, 4.1.3 단계에서 결정된 총 셀 번호를 사용하여 결과 셀 서스펜션이 1 x 10⁶ 셀/mL이 되도록 각 웰에 추가할 트립신-EDTA의 부피를 계산합니다.
   6. 각 웰에 트립신-EDTA의 적절한 부피를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      참고 : 더 큰 화면의 경우 세포의 생존가능성을 보장하기 위해 24 웰 플레이트가 한 번에 아닌 그룹으로 트립시니화되고 보충되는 것이 좋습니다.
   7. 상기 배양 동안, 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 24웰 플레이트상에 상응하는 웰에 400 μL의 퓨로마이신 함유 완전 성장 매체를 첨가한다.
   8. 4.1.7단계에서 제조된 새로운 24웰 플레이트상에서 각각의 웰으로부터 100 μL의 셀 현탁액(약 1 x 10⁵ 셀)을 이송한다.
   9. 단계 4.1.6에서 4.1.8을 반복하여 단계 4.1.1에서 그룹화 된 우물의 모든 플레이트에 대해 한 번에 한 접시를 반복합니다.
2. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 24시간 동안 배양합니다.

5. 이중 루시퍼라제 기자의 변형

1. 4.2단계에서 각각 잘 트랜스펙트 하는 이중 루시퍼라아제 리포터는 다음과 같이 구성한다.
   참고: 레닐라 루시퍼라제 벡터를 제어하는 반딧불 루시퍼라아제 리포터 벡터의 총 DNA 량 및 최적 비율은 이 분석기를 시작하기 전에 결정되어야 한다. 여기서, 20개의 반딧불이 루시퍼라제 리포터와 1개의 부품 대조군 레닐라 루시퍼라아제를 포함하는 DNA 혼합물의 400ng을 사용하였다.
   1. 각 시약의 지시된 부피를 혼합하여 형질전환 혼합물(튜브 A)과 리포터 희석 혼합물(TubeTable 1B)을 확인하여 총 형질감염 수(플러스 몇 가지 추가)를 곱하였다.
      참고: 이 프로토콜은 트랜스펙션 시약 2에 최적화되어 있습니다(재료 표참조). 다른 형질감염 시약을 사용하는 경우, 이 단계 이전에 형질감염이 최적화되어야 한다.
   2. 형질감염 혼합물(튜브 A)을 리포터 희석 혼합물(튜브 B)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 형질감염 혼합물을 생성한다.
   3. 상기 배양 동안, 4.2단계에서 인산완충염수(PBS)의 0.25 mL로 각 24웰을 헹구고, 각각의 웰에 447 μL의 완전한 성장 매체를 첨가한다.
   4. 15분 배양 후, 다중 채널 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 53 μl의 형질전환 혼합물을 분배한다.
2. 37°C에서 세포를 5%_CO2로 24시간 동안 배양합니다.

6. 이중 루시퍼라아제 활성의 정량화

1. 하기 아래에 설명된 바와 같이 플레이트 리더 및 이중 루시퍼라제 리포터 분석 키트를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
   참고: 이 프로토콜은 표시된 리포터 분석 키트(재료 표참조)에 최적화되어 있으며 제조업체의 권장 프로토콜을 따릅니다.
   1. 모든 웰에 대해 충분한 1x 수동 용해 버퍼를 준비하고 5x 수동 용해 버퍼(키트에 제공)를 탈이온수로 1-5로 희석하여 몇 가지 추가(웰당 75 μL필요)를 준비합니다. 또한 시약 A 및 시약 B 버퍼를 해동합니다(키트에 제공, 각 웰에 대해 각각 100 μL이 필요하다).
   2. 5.2 단계에서 24 웰 플레이트의 각 웰로부터 미디어를 흡인합니다.
   3. 각 웰에 75 μL의 1x 수동 용해 버퍼를 추가하고 가끔 흔들면서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
   4. 해동된 시약 B 완충액으로 50x 시약 B 기질(키트에 제공)을 1:50으로 희석하여 시약 B를 준비한다.
   5. 블랭킹을 위해 4개의 웰에 1x 수동 용해 버퍼 30 μL을 추가합니다(보충 표 2참조).
   6. 6.1.3단계에서 30 μL의 용해액을 96웰 의 평평한 바닥 백색 분석 판의 중복 우물로 옮김.
   7. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 μL의 시약 A를 추가하고 플레이트 리더가있는 반딧불 루시 퍼라제 신호를 읽습니다.
   8. 다중 채널 파이펫을 사용하여 6.1.4 단계에서 50 μL의 시약 B를 각 우물에 추가하고 플레이트 리더가 있는 Renilla 루시퍼라제 신호를 판독합니다.
2. 원시 데이터를 다음과 같이 처리합니다(자세한 설명은 보충 표 2참조).
   1. 낮은 값이 바이러스 구조가 독성 또는 너무 적은 형질 감염 세포가 분석되었다는 것을 나타내기 때문에 매우 낮은 Renilla luciferase 신호와 샘플을 제외합니다.
      참고: 토론에서 설명한 대로, 상당히 "낮은" 레닐라 루시퍼라아제 신호는 비정상적인 결과를 초래할 수 있습니다. 여기서, 레닐라 루시퍼라아제 신호가 평균 이하의 1표준 편차 이상인 웰을 배제하였다(보충표 2참조). 이는 이들^{세포(14)에서}이 리포터 시스템을 사용하여 수행된 이전 연구에 기초하였으나, 다른 세포주에서 다를 수 있다.
   2. 반딧불/레닐라 비율을 얻기 위해 동일한 웰의 원시 레닐라 루시퍼라아제 값으로 각각의 원시 반딧불 루시퍼라아제 값을 정규화한다.
   3. 모든 복제 제어 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 평균하고 배 변화를 얻기 위해 그 숫자로 다른 모든 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 분할합니다.
   4. 컨트롤 샘플을 할당하고반딧불/레닐라 비율 값을 1로 설정합니다.
   5. 표준 편차로 중복 우물과 플롯의 반딧불 /레닐라 비율을 평균화합니다.
      참고: 표준 편차는 통계 분석에 사용되지 않고 복제본이 크게 다른 웰을 식별하는 수단으로 사용됩니다.

Results

우리의 YAP/TAZ-TEAD 리포터 구조(pGL3-5xMCAT(SV)-49^{2,,14,,15)는}반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 구동하는 정준적 TEAD 결합 요소(MCAT)^15의 5회 반복을 가진 최소한의 SV-49 프로모터를 함유하고 있다(도1). 그것은 PRL-TK 대조군 벡터(Promega)와 함께 세포내로 병용되어, 이는 구성적으로 활성HSV TK 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라제를 발현한다(도1). YAP/TAZ-TEAD 리포터 구문이 테스트 중인 세포주에서 예상대로 작동하도록 하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 먼저 PRL-TK 및...

Discussion

본 연구에서, 우리는 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하고 테스트하는 데 사용할 수있는 이중 luciferase 기반 전사 기자 분석과 함께 배열 된 바이러스 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝에 대한 접근법을 보여줍니다. 모든 스크린에 앞서 각 세포주별로 리포터 시스템을 특성화하고 최적화하는 것이 중요합니다. 실험은 리포터가 조사중인 전사 인자의 변경 된 활동에 반응하고 활성의 변화 규모를 제어 벡터에 비해 테스트해야하는지 확인하기 위해 수행해야합니다. 리포터 구문과 함께 PRL-TK 구문의 공동 형질감염은 리포터와 함께 형질전환된 세포의 수와 리포터 구문의 카피 수를 제어하는 데 도움이 되기 때문에 중요하며, 둘 다 루시퍼라제 신호의 크기를 변경할 수 있다. 최적화 실험은 또한 전사 계수가 결과 해석을 복잡하게 할 수 있으므로 구성적인 Renilla 구문 또는 최소 프로모터 구제의 활동에 영향을 미치지 않도록 해야 합니다. 라이브러리에 포함할 컨트롤도 신중하게 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 수백 개의 shRN...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml 96-웰 딥 웰 폴리프로필렌 플레이트	USA Scientific	1896-2000	세균성 미니 프렙
트립신 - 2.50%	Gibco	15090-046	트립신-EDTA
96 웰 플랫 바닥 흰색 어세이 플레이트	Corning	3922	이중 루시페라제 분석용
암피실린 - 100 mg/ml	시그마-알드리치	45-10835242001-EA	세균성 미니 프렙용
Bacto 트립톤 - 분말	시그마 Aldrich	95039	LB 국물의 분대
LAR II 시약 (시약 A), 정지 & Glo 기질(시약 B 기질) 및 Stop & Glo 완충액 (시약 B 완충액) - Kit	Promega	E1960	이중 루시페라제 분석용
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드 제외) - 9.6 g/L	Himedia	TS1006	PBS EDTA용
- 0.5 M	VWR	97061-406	트립신-EDTA
에탄올의 구성 요소 - 100%	Pharmco-AAPER	111000200	세균성 미니 준비
태아용 소 혈청 - 100%	VWR	97068-085	완전 성장 매체의 구성
요소 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌) - 8 mg/ml	시그마-알드리치	45-H9268	바이러스 감염용
HyClone DMEM/고포도당 - 4 mM L-글루타민; 4500 mg/L 포도당; 피루브산 나트륨	GE Healthcare 생명 과학	SH30243.01	완전 성장 매체의 구성 요소
I3-P/i3 다중 모드 마이크로플레이트/EA	분자 장치		이중 루시페라제 분석용
L-글루타민 - 200 mM	Gibco	25030-081	완전 성장 배지
구성 요소 Lipofectamine 3000 (Transfection 시약 2) - 100%	Life technologies	L3000008	Transfections용
분자 생물학 물 - 100%	VWR	02-0201-0500	바이러스 포장용 shRNA 벡터 희석용
NaCl - 분말	BDH	BDH9286	LB 국물의 구성 요소
NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계	Thermo scientific		벡터 DNA 농도 측정
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%	Gibco	31985-062	Transfections용
페니실린 스트렙토마이신 - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µ g/ml (스트렙토마이신)	Gibco	15140-122	완전 성장 배지의 구성
요소 PureLink 퀵 플라스미드 Miniprep Kit - Kit	Thermo Fisher Scientific	K210010	박테리아 미니 프렙용
Puromycin - 2.5 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-P7255	감염 후 항생제 선택용
TC20 자동 세포 계수기	Bio-Rad		세포 계수용
X-tremeGENE 9 DNA 형질주입 시약 (형질주입 시약 1) - 100%	Roche	6365787001	바이러스 포장용
효모 추출물 - 분말	VWR	J850	LB 국물
P3000 (형질주입 시약 3)의 구성 요소 - 100%	생명 기술	L3000008	형질주입용