방법 논문

작은 물고기, 큰 질문 : 멕시코 테트라 연구를위한 현대 기술 모음

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⸱

DOI:

10.3791/60592

⸱

2020년 2월 24일

 , 
1Genetics Department, Blavatnik Institute, Harvard Medical School

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Stahl, B. A. et al. 멕시코 동굴 물고기의 유전자 기능 조작. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (146) (2019).

Peuß, R. et al. Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (147) (2019).

Worsham, M. et al. 멕시코 동굴 물고기의 행동 추적 및 신경 마스트 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (147) (2019).

Jaggard, J.B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E.R., Keene, A.C. 멕시코 동굴 물고기의 수면 및 운동 활동 자동 측정. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (145) (2019).

Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J.B. Astyanax 배아를 위한 Wholemount In Situ Hybridization. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (145) (2019).

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. 유충 후 표현형 및 전체 산 면역 조직 화학의 분석을 위해 멕시코 Tetra Astyanax mexicanus 올리기. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (142) (2018).

사설

동물 다양성의 기원에 대한 오랜 관심에도 불구하고 우리는 형태, 생리학 및 행동의 진화의 기초가 되는 유전적 변화에 대한 이해가 제한적입니다. 멕시코 테트라인 Astyanax mexicanus는 형질이 어떻게 진화하는지에 대한 우리의 이해를 높이는 강력한 모델로 등장했습니다. 이 종의 물고기는 멕시코와 텍사스 남부 전역의 강에 풍부한 눈이 있는 강에 사는 형태(표면 물고기)와 멕시코 북동부의 시에라 델 아브라 지역 내 영원히 어두운 석회암 동굴에서 번성하는 눈이 없는 동굴 사는 형태(동굴 물고기)의 두 가지 형태형으로 존재합니다1. 적어도 두 번의 독립적인 표면 어류 침입에서 유래한 29개의 알려진 동굴 개체군이 있습니다 2,3. 동굴과 강 형태는 간섭 상태로 남아 있으며 실험실에서 쉽게 번식할 수 있으므로 연구자들은 동굴의 독특한 선택 압력에 반응하여 진화하는 형질을 유전적으로 매핑할 수 있습니다. 예를 들어, 빛의 부재는 눈 4,5,6,7,8,9, 색소 10,11,12,13,14 및 수면 15,16,17,18,19의 퇴행으로 이어졌습니다. 영양 제한은 과식20, 체중 증가21 및 지방 저장22를 선택했습니다. 어둠 속에서 항해하는 것은 환경을 감지하는 능력의 증가를 촉진했습니다 23,24,25,26,27,28. 점점 더 많은 연구자들이 진화의 유전적 기초를 탐구하기 위해 이 물고기를 활용하고 있습니다. 동굴 물고기에서 적응하는 일부 특성은 인간에게 해롭기 때문에 동굴 물고기는 생물 의학 연구에도 매력적이 되었습니다 21,29,30,31. 재현성을 촉진하고 새로운 연구자를 위한 플랫폼을 제공하는 것을 목표로 이 JoVE 방법 컬렉션은 사육, 형질 측정 및 유전자 활성 검사를 위한 기술을 제공합니다.

출발점으로 Peuß et al. 도 32 는 1) 번식하기 어려울 수 있는 동굴/표면 잡종, 2) 미세 주입을 위한 단일 세포 단계 배아, 및 3) 배아 표현형 분석을 위한 단계 일치 샘플을 얻는 방법을 제공하므로 여러 용도로 사용됩니다. A. mexicanus 는 일반적으로 밤에 산란합니다. Peuß 외. 명암 주기를 변경하고 정상 근무 시간 동안 배우자 수집을 위해 준비된 물고기를 얻는 시스템을 설명합니다. 배우자 수집에 대한 시각적 시연은 이 단계에 신중한 기술이 필요하기 때문에 특히 유용합니다. 그들의 기사는 배아 발생 중 유전자 발현 패턴의 비교를 포함하여 여러 다운스트림 응용 분야에 필수적입니다.

뤽 외. 33 은 A. mexicanus 배아에서 유전자 발현을 시각화하기 위해 최적화된 강력한 in situ 혼성화 프로토콜을 제공합니다. 체크리스트(보충 파일로 제공됨)를 사용하여 이 여러 날에 걸친 절차를 단순화하고 문제 해결을 위한 지침을 공유합니다. 이 방법을 보완하는 Riddle et al. 34 는 전체 마운트 면역조직화학을 사용하여 부화한 물고기에서 유전자 발현 및 단백질 국소화를 조사하는 방법을 보여줍니다. 부화와 먹이 시작 후 형태형을 의미 있게 비교하려면 성장 조건을 조절할 필요가 있습니다. 그들은 자연 산란을 통해 성충을 번식시키고 다른 식품 공급원에 비해 영양 함량과 비용 면에서 상당한 이점이 있는 윤충 식단에서 고정된 밀도로 유충을 키우는 방법을 보여줍니다. 그들의 면역염색 프로토콜은 부화 후 12일까지 뇌, 장 및 췌장의 항원을 성공적으로 인식하여 장기 발달 및 기능의 후기 단계를 조사할 수 있습니다. 중요한 것은 A. mexicanus에서 성공적으로 사용된 항체 목록을 제공한다는 것입니다. Luc et al. 그리고 Riddle et al. 유전자 조작의 효과를 분석하는 데 유용합니다.

이 방법 모음에서 Stahl et al. 35 는 모르폴리노 미세 주사, CRISPR-Cas9 매개 돌연변이 유발 및 Tol2 매개 형질전환을 포함하여 A. mexicanus 에서 유전자 기능을 조작하는 여러 방법을 설명합니다. 주입된 배아의 피코 주입 및 스크리닝을 시연하는 것 외에도 모르폴리노, 가이드 RNA 및 이식유전자 설계에 유용한 지침을 제공합니다. 그들은 이러한 각 기술을 검증하는 결과를 공유합니다. 예를 들어, 스플라이스 차단 모르폴리노를 사용하여 히포크레틴/오렉신(HCRT)을 표적으로 삼으면 동굴 물고기의 운동 활동이 감소하고 수면이 증가합니다. CRISPR/Cas9를 사용하여 표면 어류에서 oca2(동굴 물고기 백색증의 원인 유전자좌)를 편집하면 알비노 표면 물고기가 생성됩니다. Tol2 형질전환을 사용하여 범-뉴런 제브라피쉬 프로모터에 의해 구동되는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 삽입하면 멕시코 테트라에서 거의 유비쿼터스 뉴런 발현을 달성할 수 있습니다. 그들은 제브라피쉬에서 개발된 많은 유전 도구가 유사한 게놈 때문에 동굴 물고기로 직접 전달될 수 있다고 지적합니다. 그들의 기사는 A. mexicanus 에서 기능 연구를 수행하는 연구자들에게 필수적인 자료이며 행동을 포함한 표현형 측정에 초점을 맞춘 추가 기사를 보완합니다.

동굴 물고기는 수면을 극적으로 줄이고 일주기 리듬을 변화시켰습니다 36,37,38. 이것은 척추동물의 수면 변화에 대한 유전학과 환경의 기여도를 조사할 수 있는 흥미로운 기회를 제공합니다. 재가드 외. 39는 다양한 생애 단계와 다양한 상황에서 수면을 기록하는 데 사용할 수 있는 저렴한 재료로 시스템을 구축하는 방법을 보여줍니다. 또한 이 설정에서 물고기 추적을 자동화하고 수면 및 이동에 대한 정량적 측정값을 얻는 방법을 설명합니다. 그들의 기술은 전통적인 유전자 매핑 연구뿐만 아니라 고처리량 약물 및 유전자 스크리닝에도 적용할 수 있습니다.

수면 감소 외에도 동굴 물고기는 먹이 각도 및 진동 인력 변경을 포함하여 먹이 찾기와 관련된 운동 활동의 차이를 진화시켰습니다 16,30,40. 이러한 활동이 어떻게 진화했는지 이해하는 데 핵심적인 것은 이를 발달 변화와 연결하는 것입니다. 워샴 외. 41 행동을 기록하고 이를 뉴로비스트의 변화와 연관시키는 방법을 제시합니다. 물의 흐름에 반응하는 외부 기계 감각 구조. 먼저 진동 인력과 수면을 기록하는 챔버를 만드는 방법을 보여주고 무료 소프트웨어와 사용자 정의 가능한 스크립트를 사용하여 행동을 정량화하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 다음으로, 그들은 형광 미토콘드리아 염색을 사용하여 살아있는 성체 물고기의 뉴로마스트를 시각화하는 방법과 다시 무료 소프트웨어를 사용하여 반자동 방식으로 뉴로마스트의 수를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 진동 인력과 뉴로마스트 수는 상관관계가 있습니다23; 그들의 방법은 이 관계를 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. Jaggard와 Worsham의 방법은 추가 행동을 발견하는 데 사용할 수 있으며 다른 어종에도 적용할 수 있습니다. 이러한 방법은 행동 진화의 유전적 기초를 발견하는 데 필수적인 정량적이고 일관된 결과를 생성합니다.

유전자 기능을 측정하고 조작하는 현대 기술은 진화론적 연구를 비교 연구에서 기계론적 연구로 밀어붙였습니다. 이 방법 모음의 기사를 종합하면 A. mexicanus의 유전자 기능을 조사하기 위한 가이드북 역할을 합니다. 연구자들은 표면과 동굴 형태 사이의 형태, 생리학 및 행동의 흥미로운 차이를 발견했지만, 아직 자세히 탐구되지 않았으며 더 많은 것을 발견해야 할 특성이 많이 있습니다. 더 많은 작업이 수행됨에 따라 이 작은 물고기는 진화에 대한 우리의 이해에 계속해서 큰 영향을 미칠 것입니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NH089934, DK108495)의 자금 지원을 인정합니다. F. Leal과 A. Powers는 편집을 인정합니다.

참고문헌

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