Method Article

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

DOI:

10.3791/60593

⸱

March 23rd, 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

Abstract

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척추 동물 신경계의 발달은 복잡한 세포 행동 및 상호 작용의 정확한 조정을 요구합니다. 생체 내 이미징 기술에서 고해상도의 사용은 살아있는 유기체에서 이러한 과정에 명확한 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 세포와 그들의 자손을 나누는 것은 신경계가 형성될 때 실시간으로 따를 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다색 기술의 기술 발전은 조사 할 수있는 질문의 유형을 확장했다. 다중 색 Brainbow 접근법은 세포와 같은 것을 구별할 뿐만 아니라, 각각 하나의 전구 세포로부터 파생되는 관련 세포의 여러 가지 다른 클론을 색상 코드화하는 데 사용될 수 있습니다. 이를 통해 개발 중에 다양한 클론과 해당 동작의 멀티플렉스 계보 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다. 이것은 전통적인 프로모터 구동 색상을 사용하여 차별화하기 어려운 세포 들 간의 세포 상호 작용을 따르는 데 특히 유용합니다. 우리의 접근 방식은 동시에 여러 다른 클론 간의 계보 관계를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 생성된 대규모 데이터 세트는 유전적 또는 약리학적 조작에 걸쳐 정량적으로 비교할 수 있는 풍부한 정보를 제공합니다. 궁극적으로 생성 된 결과 신 경계 개발 방법에 대 한 체계적인 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다.

Introduction

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발달의 초기 단계에서, 전문화한 선조 세포의 풀은 증식 지역에서 반복적으로 분할하여 딸 세포의 다양한 배열을 생성합니다. 이 발달 기간 도중 품어든 세포는 그 때 분화하고 초기 기관을 형성하기 위하여 여행할 것입니다. 신경계에서는 방사형 glia와 같은 선조가 심실 영역에서 미성숙한 뉴런을 발생시다. 뉴런이 심실에서 멀어지고 성숙함에 따라 확장 조직은 결국 뇌의 매우 복잡한 구조를 형성합니다11,2,3,34,45,,56. 선조의 분열과 뉴런의 분화 및 이동 사이의 조정은 뇌의 최종 크기, 모양 및 따라서 기능을 결정하며, 행동7,,8,,9,,10에직접적인 영향을 미칩니다. 이러한 프로세스에 대 한 엄격한 제어는 명확....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 과목과 관련된 절차는 루이스 & 클라크 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 얼룩말 어피 배아의 미세 주입

  1. 야생형, 성인용 제브라피쉬를 성분리형 짝짓기탱크에 설치하여 오후에미세주사39,,40을수행한다.
  2. 미세 주사의 아침에 DNA 용액을 준비하십시오. 희석 hsp:Zebrabow11 플라스미드 DNA는 0.1 mM KCl에서 ~ 10 ng/μL의 농도로, 2.5% 페놀 레드 및 3.75U 크레 재조합 효소와 함께.
  3. 수정39,,41의45 분 이내에 1 세포 얼룩말 배아에 DNA 용액의 미세 주입을 수행합니다. 이 용액의 약 4.2 nL를 각 배아에 주입하십시오, 플라스미드 DNA의 ~ 42 pg에 해당.
    참고: 미세주사 단계는 Tg(유비:Zebrabow)15 및 Tg(neurod....

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Results

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이 섹션은 여기서 설명된 생체 내 다색 타임랩스 이미징 접근법을 사용하여 얻을 수 있는 결과의 예를 예시한다. 우리는 개발 제브라피쉬 뒷뇌의 증식성 심실 영역에서 세포의 Brainbow 색코딩클론이 14 (도 1)임을보여준다.

전형적으로, Brainbow 표지된 세포가 특정 방사형 섬유를 따라 배열되었을 때, 그들은 상대적인 RGB 채널 가중치로 정량화될 수 있는 동일한색상(도 1D)을공유했다(도1E). 이것은 이 방사형 단이 분할 세포의 클론이고 그들의 유사한 색깔이 제브라피시, 마우스 및 병아리14,,15에있는 이전 연구 결과에서 관찰된 것과 같이 클로나 관련되는 것으로 .......

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Discussion

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이 프로토콜은 발달하는 제브라피쉬 뒷뇌에서 전구 세포 및 뉴런의 클론을 시각화하고 이를 뇌무지개 및 타임랩스 공초점 현미경 검사법11을사용하여 생체 내에서 따르는 방법을 설명한다. 생체외 또는 생체외 연구에 비해 이 프로토콜의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 자연 적인 milieu에서 척추 동물 뇌의 증식 영역을 직접 관찰 하는 기능. 이 기술은 retroviral 벡터를 사용하여 단일 복제본에 레이블을 붙인 이전 연구를 기반으로 합니다. 대조적으로, hsp:Zebrabow의 사용은 동시에 많은 클론을 컬러 코드를 구성, 멀티 플렉스 계보 추적및 클론 중 역학에 초점을 허용11. 이 프로토콜은 다른 시스템 또는 세포 유형의 개발에 초점을 맞추기 위해 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 무지개 구조는 제브라피시 배아에서 발현될 수 있다. hsp:Zebrabow에서 제브라피쉬 hsphsp70 프로모터를 사용하면 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y. A. Pan, J. Livet 및 Z. Tobias에게 기술적, 지적 공헌에 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (상 1553764)와 M.J. 머독 자선 신탁에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 전사 피펫(파인 팁)Globe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690배아 색소 침착을 방지하기 위해 E3에서 0.2mM로 희석
50mL 원추형 튜브Corning352070열 충격 배아용
6lb 나일론 낚싯줄SecureLineNMT250배아 매니퓰레이터 제작용
7.5mL 이송 피펫Globe Scientific, Inc.135010
CaCl2</sub>SigmaC3881E3
면봉Puritan867-WC 접착제 없음배아 조작기 제작용
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
디지털 건식 수조Genemate490016-61642°C에서 LMA를 저장하는 데 사용됩니다. C
Epifluorescence dissection scope
유리 모세관World Precision InstrumentsTW100F-4
인큐베이터Forma Scientific3158배아를 28 °C로 유지하기 위해; C
사출 플레이트 금형Adaptive Science ToolsTU-1
Isotemp 수조Fisher Scientific2320열 충격 배아
KClAMRESCO0395E3 및 주입 용 DNA 용액
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경ZeissLSM710
LE 아가 로스GenemateE3120만들기 위해 아가로스 주입 플레이트
저용융 아가로스(LMA)AMRESCOJ234
결합 탱크Aquaneering, Inc.
메틸렌 블루시그마M9140E3
MgSO4Sigma9397E3
Micromanipulator용 World Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 트리카인-S웨스턴 케미컬, Inc.역삼투압(RO) 물에서 4mg/mL로 만든 스톡, 배아를 마취하기 위해 E3에 최종 농도 0.2mM까지 적가
NaClJ.T. Baker4058-01E3
페트리 접시용(90mm, 60mm)Genesee Scientific32-107G배아 수용 및 이미징 챔버 생성용(60mm)
페놀 레드SigmaP0290
소프트 스티치 링 마커클로버 니들크래프트, Inc.354페트리 접시로 이미징 챔버를 만들기 위해
슈퍼 글루 (울트라 젤 컨트롤)록타이트1363589배아 조작기 주
사기 바늘위해 Beckton DickinsonBD329412배아 제거 용
ZHCT100화 만들기

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R.

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Brainbow ImagingTime lapse ConfocalZebrafish Nervous SystemNeural Progenitor CellsClonal Lineage AnalysisMulticolor FluorescenceIn Vivo ImagingCell Division TrackingApoptosis DetectionInterkinetic Nuclear Migration

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