Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Zoe  T. Cook; Nicole  L. Brockway; Tamily A. Weissman

doi:10.3791/60593

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Developmental Biology

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Published: March 23, 2020

doi:

10.3791/60593

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Zoe T. Cook¹, Nicole L. Brockway¹, Tamily A. Weissman¹

¹Biology Department,Lewis & Clark College

Summary

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

Abstract

척추 동물 신경계의 발달은 복잡한 세포 행동 및 상호 작용의 정확한 조정을 요구합니다. 생체 내 이미징 기술에서 고해상도의 사용은 살아있는 유기체에서 이러한 과정에 명확한 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 세포와 그들의 자손을 나누는 것은 신경계가 형성될 때 실시간으로 따를 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다색 기술의 기술 발전은 조사 할 수있는 질문의 유형을 확장했다. 다중 색 Brainbow 접근법은 세포와 같은 것을 구별할 뿐만 아니라, 각각 하나의 전구 세포로부터 파생되는 관련 세포의 여러 가지 다른 클론을 색상 코드화하는 데 사용될 수 있습니다. 이를 통해 개발 중에 다양한 클론과 해당 동작의 멀티플렉스 계보 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다. 이것은 전통적인 프로모터 구동 색상을 사용하여 차별화하기 어려운 세포 들 간의 세포 상호 작용을 따르는 데 특히 유용합니다. 우리의 접근 방식은 동시에 여러 다른 클론 간의 계보 관계를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 생성된 대규모 데이터 세트는 유전적 또는 약리학적 조작에 걸쳐 정량적으로 비교할 수 있는 풍부한 정보를 제공합니다. 궁극적으로 생성 된 결과 신 경계 개발 방법에 대 한 체계적인 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다.

Introduction

발달의 초기 단계에서, 전문화한 선조 세포의 풀은 증식 지역에서 반복적으로 분할하여 딸 세포의 다양한 배열을 생성합니다. 이 발달 기간 도중 품어든 세포는 그 때 분화하고 초기 기관을 형성하기 위하여 여행할 것입니다. 신경계에서는 방사형 glia와 같은 선조가 심실 영역에서 미성숙한 뉴런을 발생시다. 뉴런이 심실에서 멀어지고 성숙함에 따라 확장 조직은 결국 뇌의 매우 복잡한 구조를 형성합니다¹^1,^2,^3,³^4,⁴^5,^,⁵^6. 선조의 분열과 뉴런의 분화 및 이동 사이의 조정은 뇌의 최종 크기, 모양 및 따라서 기능을 결정하며, 행동^7,^,^8,^,^9,^,^10에직접적인 영향을 미칩니다. 이러한 프로세스에 대 한 엄격한 제어는 명확 하 게 정상적인 두뇌 개발에 대 한 중요 한 동안, 이러한 역학을 조절 하는 글로벌 메커니즘은 잘 이해 되지 않습니다. 여기에서 우리는 세포 해결책에 있는 신경계 발달을 공부하는 공구를 기술합니다, 연구원이 Brainbow를 가진 개발 제브라피시 두뇌에 있는 생체 내 선조 세포 및 신경세포를 구상하고 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 통해 그들의 행동을 추적하는 것을^{허용합니다 11.} 접근은 또한 발전 태아의 그밖 부분을 구상하기 위하여 적응될 수 있습니다.

제브라피쉬 뇌의 세포를 관찰하고 구별하기 위해, 우리는 Brainbow 세포 라벨링 기술^11을적용했습니다. Brainbow는 세포의 인구를 표시하기 위하여 3개의 명백한 형광성 단백질 (FPs)의 무작위로 결정된, 조합식 식을 이용합니다. Brainbow 발현에 대한 기본 발현은 적색 FP dTomato인 반면, 효소 Cre 재조합효소에 의한 재조합은 mCerulean(청색 형광 단백질, CFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)^12,^,^13의발현을 초래한다. 세포에서 발현되는 각 FP의 결합된 양은 독특한 색조를 제공하여 인접한 세포와 명확한 시각적 구별을 허용합니다. 추가적으로, 선조 세포가 분할할 때, 각 딸 세포는 그것의 어머니 세포에서 색깔을 승계할 것입니다, 색깔 로 구분된 클론을 생성하고 연구원이 세포 계보를 추적하는 것을^{허용합니다 11,}^,^14. 원래 마우스^12에서뉴런 회로를 분석하는 데 사용되었지만, Brainbow는 이후 제브라피시^15를포함한 다양한 모델 유기체로 표현되어 왔다.

우리의 기술은 살아있는 제브라피시에서 시간이 지남에 따라 여러 가지 색상 으로 구분 된 클론을 직접 이미지화하기 위해 이전의 다색 라벨링 및 이미징 방법을 기반으로합니다. 배아로서의 광학적 투명성으로 인해 제브라피쉬는 이미징 실험^,^16에적합하며, 이전 연구에서는 제브라피쉬의 Brainbow를 활용하여 신경계^{11, 15,}^,¹⁵^,^17,^,^18,^19,^,^20,^,^21,^22,^,^,^23,^,^24,^,^25,^, ²⁶^,²⁷. 살아있는 유기체로 직접 이미지화 할 수있는 능력과 빠른 자궁 발달로 얼룩말은 척추 동물 발달의 귀중한 모델로 만듭니다. 포유류 뇌와 는 달리, 제브라피쉬 뒷뇌의 전체 증식 영역은 내인성 환경에 지장을 주지 않고 이미징을 위해 쉽게 사용할 수 있다^6. 이것은 시험관 내 또는 고정된 조직 준비보다는 살아있는 유기체에서 실험이 실행될 수 있습니다. 고정 된 이미징 실험과는 달리 생체 내 연구는 세로 설계를 허용하여 패턴을 분석 할 수있는 몇 시간의 데이터를 생성하므로 상대적으로 드문 사건을 관찰 할 가능성이 높아집니다. 관심 있는 사건의 속도와 길이에 따라, 연구원은 짧은 (1-2 시간) 또는 긴 (~16 시간) 시간 경과 화상 진찰 실험을 능력을 발휘하도록 선택할 수 있습니다. 제브라피쉬 열충격프로모터(70)(hsp70, hsp)를 이용하여, 무지개발현은^28,^,^29를시간적으로 조절할 수 있다. 부가적으로, 이러한 프로모터에 의해 유도된 모자이크 발현은 많은^{클론(11)에}라벨링 및 추적에 적합하다.

살아있는 두뇌 내의 다중 클론을 시각적으로 확인하는 기능은 이 방법의 이점입니다. 신경계의 발달 내에서 클론의 역할을 조사한 중요한 이전 연구는 단일 전구 세포및 그 자손에게 단일 FP 또는 기타 쉽게 시각화된 단백질을 사용하여 라벨을 붙이기 위해 레트로바이러스 벡터를 활용하였다. 이러한 라벨링은 연구원이 생체 외 또는 생체 내^2,^,^{30, 31}^,^,³²³¹^,^,³³,³⁴^,³⁵^,³⁶^,^37,^,^38에서시간이 지남에 따라 단일 복제를 관찰 할 수 있게합니다. 하나의 클론 내에서 세포의 동작을 추적하는 방법과는 달리, Brainbow의 뚜렷한 색상은 연구원이 클론 중 역학을 관찰 할 수 있습니다. 추가적으로, 뇌 내의 많은 클론에 레이블을 Brainbow를 사용하여, 복제 동작에 대한 추가 데이터는 단일 클론^11에레이블을 지정하는 기술에 비해 수집된다. 중요한 것은, 여기에 기술된 접근법은 상이한 유전적 또는 약리학적 조작을 겪은 물고기 들 사이의 발달 비교를 생성하기 위해 확장될 수 있다^18. 전반적으로, 이러한 장점은 척추 동물 신경계의 개발을 탐구하는 연구자, 특히 클론의 역할에 관심이있는 연구자들에게 이상적인 Brainbow 표현 얼룩말의 생체 내 공초점 이미징에서 시간 경과를 만듭니다.

Protocol

동물 과목과 관련된 절차는 루이스 & 클라크 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 얼룩말 어피 배아의 미세 주입

야생형, 성인용 제브라피쉬를 성분리형 짝짓기탱크에 설치하여 오후에^{미세주사39,}^,^40을수행한다.
미세 주사의 아침에 DNA 용액을 준비하십시오. 희석 hsp:Zebrabow¹¹ 플라스미드 DNA는 0.1 mM KCl에서 ~ 10 ng/μL의 농도로, 2.5% 페놀 레드 및 3.75U 크레 재조합 효소와 함께.
수정^39,^,^41의45 분 이내에 1 세포 얼룩말 배아에 DNA 용액의 미세 주입을 수행합니다. 이 용액의 약 4.2 nL를 각 배아에 주입하십시오, 플라스미드 DNA의 ~ 42 pg에 해당.
참고: 미세주사 단계는 Tg(유비:Zebrabow)¹⁵ 및 Tg(neurod:Zebrabow)^18과같이 형질전환, 무지개 발현 제브라피시 라인이 대신 짝짓기되는 경우 생략될 수 있다. 미세 주사를 수행하는 것은 연구원이 복사 수와 라벨 링 밀도를 적정 할 수 있기 때문에 유리할 수 있습니다. 더욱이, 특정 유전자 생성물들을 태그하거나 조작하는 제2 DNA 구성물은 원하는 경우 Brainbow와 함께 주사될 수 있다(예를 들어, Brainbow^18을보완하는 원붉은 형광 단백질).
24시간 동안 28°C 인큐베이터에서 E3 배지^39의 페트리 접시에 주입된 배아를 유지한다.

2. 무지개 표현을 유도하는 열 충격

참고: 플라스미드 DNA가 주입되거나 이식유전자가 hsp70 프로모터를 이용하여 발현을 유도하지 않는 경우, 열 충격 단계는 건너뛸 수 있으며, 건강한 배아는 즉시 24시간 후 수정(hpf)에서 페닐티우레아(PTU)로 옮겨져야 한다.

24 hpf에서, 주입된 배아군으로부터 죽은 배아와 변형된 배아를 컬라. 그런 다음 건강한 배아를 최대 20 개의 배아 / 튜브로 50 mL 튜브로 옮김을 옮김하십시오.
E3의 10 mL로 튜브를 채웁니다. 각 튜브 위에 뚜껑을 씌우지만 단단히 닫지 마십시오.
50 mL 튜브를 포함하는 튜브 랙을 37°C 수조에 똑바로 놓습니다. 욕조의 수위가 튜브의 E3 수준보다 높은지 확인하고 80 ~ 90 분 동안 둡니다.
수조에서 배아와 튜브 랙을 제거하고 28°C 인큐베이터로 수직으로 되돌아갑니다. E3가 식고 배아가 온도에 점차적으로 다시 적응할 수 있도록 최대 1시간 동안 허용하십시오. 이어서, 배아의 색소침착을 방지하기 위해 인큐베이터에서 따뜻하게 한 E3에서 0.2 mM PTU의 페트리 접시로 배아를 옮깁니다.
주의 사항: PTU는 주의 해서 취급 하 고 적절 하 게 폐기 해야 하는 독성 화학 물질. 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.

3. 무지개 발현을 위한 배아 선별

열 쇼크 후 2 ~4 시간에서, CFP 또는 YFP의 발현을위한 표준 형광 해부 현미경의 밑에 배아를 검사, 이는 성공적인 Brainbow 재조합을 나타냅니다 (dTomato의 기본 발현에서).
참고: 여러 형광 필터 옵션을 사용할 수 있는 경우, CFP에 대 한 스크리닝 잘 재결합 된 물고기를 식별 하는 가장 효율적인 방법입니다. CFP 및 YFP 필터를 사용할 수 없는 경우, YFP는 스펙트럼 프로필의 중첩으로 인해 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 하에서 희미하게 시각화될 수 있습니다.
전체에 강력한 FP 발현을 가진 배아를 선택하고 PTU를 사용하여 별도의 접시로 옮깁니다. 1일 후 수정 후(dpf; 28 hpf 이상) 또는 PTU에서 배아를 2 또는 3 dpf에서 이미지로 유지한다.

4. 생체 내 이미징을 위한 배아 장착

실험 당일 에 이미징 챔버 및 배아 조작 도구를 준비하십시오.
1. 60mm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 링을 조심스럽게 과대 로 하여 이미징 챔버를 준비합니다.
2. 선택적으로, 맞춤형 배아 조작기를 준비하여 장착하는 동안 접시 내의 배아와 오리엔트 배아를 이동시다. 나일론 낚싯줄의 작은 길이 (~1/2 in, ~ 6 lb)를 나무 면봉 스틱 끝에 접착하여 조작기를 구성하여 길이가 ~4로 자른다.
필요한 경우(즉, 2 dpf 또는 그 이전의 이미징) 배아를 박리 현미경으로 주사기를 사용하여 데코리오네이트하는 배아를 장착하기 전에.
얼룩말 물고기 배아를 마취.
1. E3로 60mm 페트리 접시를 반쯤 채우고 4 mg/mL MS-222 트리카인-S 5-6 방울을 ~0.2 mM의 최종 농도에 추가합니다. 소용돌이로 섞어보세요.
  주의 사항: 트리카인은 주의하여 취급하고 적당히 폐기되어야 합니다.
2. PTU에서 트리카인 용액으로 배아를 옮겨 가능한 한 적은 PTU가 전달되도록 합니다. 물고기 반사는 1-2 분 후에 중단되어야 하는 동안, 시간 경과 화상 진찰 실험을 위한 철저한 마취를 지키기 위하여 트리카인에 있는 태아를 최대 10 분 동안 둡니다.
3. 배아가 제대로 마취되어 있는지 확인하십시오. 배아 조작기와 함께 배아 꼬리를 부드럽게 만져 서 깜짝 놀랄만한 반사를 평가합니다. 반사 운동이 관찰되면, 가능한 한 배아에서 멀리 접시에 트리카인 한 방울을 추가하고 혼합 소용돌이. 해부 범위 하에서 배아 심박수를 관찰하십시오. 비정상적으로 느린 경우, 트리카인 농도를 줄이기 위해 접시에 E3 방울을 추가하십시오.
아가로즈에 마취 된 배아를 마운트합니다.
1. 이미징 챔버 내의 플라스틱 링 중앙으로 물고기를 옮기고 미세 기울어진 이송 파이펫을 사용하여 가능한 한 과도한 E3를 제거합니다.
2. 깨끗한 전사 파이펫을 사용하여 42 °C에 보관된 E3의 1.0% 저용융 아가로스(LMA)로 생선을 덮고 플라스틱 링 전체를 아가로즈의 얇은 층으로 채웁니다. 이송 피펫을 사용하여 배아를 파이펫 팁으로 부드럽게 당기고 기포를 도입하지 않고 아가로오스로 다시 당깁니다.
3. 아가로스가 굳어지기 전에 배아 조작기를 사용하여 물고기를 적절하게 배향하십시오. 수직 현미경으로 화상 진찰하는 경우에, 가능한 한 아가로스의 상부 표면에 가깝게 태아를 놓습니다. 배아를 이미징 챔버의 바닥에 평행하게 꼬리를 똑바로 놓습니다.
  참고: 뒤뇌 화상 진찰을 위해, 태아는 등대 또는 시상 보기에서 위치될 수 있습니다. 아가로즈가 여전히 액체인 동안 배아의 머리가 가라앉지 않도록주의해야합니다. 그밖 방향은 화상 진찰을 위한 그밖 발전 조직을 표적으로 하기 위하여 적당의 적정할지도 모릅니다. 반전된 현미경의 경우, 장착은 다르게 수행되며, 일반적으로 유리 바닥페트리 접시의 바닥에 물고기를 배치합니다.
아가로즈가 굳어질 때까지 기다린 다음 이미징 챔버를 E3로 채웁니다. 이미징 과정에서 증발을 고려하기 위해 가능한 한 많은 E3을 추가하십시오.

5. 제브라피쉬 힌드브레인 개발의 시간 경과 공초점 이미징

화상 진찰을 위한 준비에 있는 공초점 현미경에 화상 진찰 실을 놓습니다.
1. 공초점 현미경에 물고기와 E3를 가진 화상 진찰실을 놓습니다.
2. 20배 수몰입 목표(1.0 NA)와 같이 높은 수치 조리개와 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택합니다.
3. 관심 있는 셀 유형의 적절한 조밀하고 밝은 라벨이 있는 영역을 찾습니다.
  참고: 현미경에 온도 제어 단계/장치는 또한 긴 화상 진찰 세션 도중 온도 및 습도를 통제하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이것은 증발을 감소시킬 수 있습니다.
Brainbow 이미징을 위한 수집 매개변수를 설정합니다.
1. 각 FP 채널을 순차적으로 이미지화합니다. 상용 소프트웨어(예: Zen 소프트웨어)를 사용하는 경우 세 개의 “트랙”을 준비하여 수행됩니다. 아르곤 레이저를 사용하여 458 nm에서 CFP를, YFP는 514 nm에서 흥분시킵니다. DPSS 561 nm 레이저를 사용하여 토마토를 자극하십시오. CFP의 경우 463-509 nm, YFP의 경우 519-555 nm, dTomato의 경우 566-691 nm 사이의 배출량을 수집합니다.
2. 화면 표시의 경우 CFP를 파란색으로, YFP를 노란색으로, dTomato를 빨간색으로 코딩합니다.
  참고: 이러한 설정은 공초점 현미경에서 사용할 수 있는 레이저 라인 및 기타 기능에 따라 달라집니다. 이미징 속도를 높이기 위해 CFP 및 dTomato 채널을 현저한 블리드스루 없이 동시에 이미지화할 수 있습니다. 원홍색 FP와 같은 별도의 FP도 이미지화되는 경우 YFP와 순차적으로 또는 동시에 이미지화할 수 있습니다.
3. 최소 1024 x 1024의 해상도와 평균 2회 평균으로 16비트 이미지를 촬영하도록 일반 이미징 매개 변수를 설정합니다. 관심 영역 및 셀 유형에 따라 줌을 조정합니다(즉, 20배 객관적인 뒷뇌 이미징의 경우 줌 범위가 1.0-2.5). 시간이 지남에 따라 물고기의 성장을 허용하기 위해 시야를 최대화합니다.
4. 한 번에 하나의 트랙을 보고(그리고 광표백을 방지하기 위해 다른 레이저를 끄고), 각 FP의 수집 설정을 개별적으로 최적화합니다(예: 레이저 파워, 핀홀 크기, 광증선튜브 게인 등).
5. 이미지에 대한 Z 스택 범위를 선택합니다.
  참고: 긴 이미징 세션(>2 h)의 경우, 물고기가 이미징 과정 내내 계속 성장할 것이라는 점을 고려하여 XY 필드와 Z 스택 범위 모두 여분의 공간을 가지고 이를 고려해야 합니다. 뒷뇌를 이미징하는 경우, 이미징 기간 동안 조직이 장밋빛으로 이동하는 필드에 공간을 포함합니다. Z 차원의 성장을 위해 공간도 포함되어야 합니다. 물고기가 시상 또는 등쪽 보기에 위치하는지 여부에 관계없이 관심 영역 위의 약 10-20 μm 의 이미지에 포함합니다.
타임랩스 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다.
1. 시간 간격을 선택합니다. 간격 길이 사이 범위 10-30 개발 뒷뇌에서 유사 분열과 apoptotic 이벤트를 추적 하는 분. 간격 길이는 관심 있는 이벤트의 속도와 단일 Z 스택을 캡처하는 데 걸리는 총 시간에 따라 달라집니다.
2. 이미징 세션의 길이를 선택합니다. 시간 경과 화상 진찰 세션은 일반적으로 밤새 생기고 적어도 16 시간 지속될 수 있습니다.
실험을 실행합니다.
참고 : 물고기는 이미징 직후 안락사하거나 주사기를 사용하여 아가로스에서 조심스럽게 해부하고 회복을 위해 E3로 돌아갈 수 있습니다. 복구 된 물고기는 나중에 다시 이미지 할 수 있지만, 세포 위치와 깊이는 전반적인 성장으로 인해이 기간 동안 이동합니다.

6. 타임랩스 파일 관리

이미지 파일을 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
1. Zen 소프트웨어를 사용하는 경우 이미지 수집이 완료되면 파일을 .czi 형식으로 저장합니다. 피지⁴² 및/또는 기타 소프트웨어와 호환되는 형식으로 원시 데이터를 저장해야 합니다.
2. BioFormats 가져오기를 사용하여 피지 소프트웨어로 가져옵니다.
  참고: 시간 경과 파일은 크고 분석을 위해 열려는 데 상당한 시간과 메모리가 필요할 수 있습니다. 따라서, 그들이 저장하고 열수있는 방법에 전략적도움이된다. 눈으로 관심 있는 이벤트를 검색하기 위해 더 쉽게 열 수 있는 낮은 품질의 버전을 저장하는 것이 유용할 수 있습니다.
피지를 사용하는 경우 시간 경과 파일의 더 작고 관리하기 쉬운 하위 집합을 만듭니다. 이미지| 클릭을 클릭하여 시간별(예: 첫 번째 시점에서 전체 Z 스택 보기) 또는 깊이(예: 각 시점에서 처음 50개의 Z-섹션을 보는 것)별로 하위 집합을 생성합니다. 스택| 도구| 서브 스택을 확인합니다.

7. 무지개 이미지의 정량적 클로날 색상 분석

피지에서 관심 있는 셀에 대 한 평균 빨강, 녹색 및 파랑 (RGB) 강도 값을 측정 합니다.
참고: 이 지침은 피지의 이미지 분석에만 해당됩니다. 그러나 연구원은 대체 소프트웨어 프로그램에서 평균 RGB 강도 값을 얻는 것을 선호할 수 있습니다.
1. 이미지 가장자리 주위에 검은 색 공간이 없도록 파일이 올바르게 자른지 확인합니다. 블랙 스페이스는 분석에 필요한 최소 강도 측정값을 인위적으로 낮춥습니다. 파일을 잘라야 하는 경우 사각형 선택 단추를 선택하고 모든 검은색 공간을 제외한 시야 주변에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이미지를클릭 | 자르기.
2. 측정 도구가 평균, 최소 값 및 최대 회색 값 측정을 수행하도록 설정합니다. 분석 |클릭 측정값을 설정합니다. 최소 및 최대 회색 값및 평균 회색 값에 대한 확인란이 모두 선택되어 있는지 확인합니다.
3. 피지에서 원시 데이터 파일 또는 하위 Z 스택을 보고 클론 색상 분석에 대 한 관심 있는 셀을 찾을 수 있습니다. 뒷뇌에서, 가설 클론은 시각적으로 자신의 공유 색조뿐만 아니라 방사형 방향에 의해 식별 될 수있다. 다른 색상의 인접 셀과 밀접한 접촉이 있어 해결하기 어려운 셀을 선택하지 마십시오. 색조를 정량화하는 것이 어려울 수 있습니다.
4. Z 스크롤 막대를사용하여 관심 셀의 중심 Z 평면을 찾습니다. 타원형 선택 버튼을 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 타원형 선택 단추를선택합니다. 다른 선택 도구는 다른 셀 유형에 적합합니다. 세포체의 중앙 ~2/3 주위에 타원형 ROI를 그립니다.
5. C-스크롤 막대를사용하여 빨간색(dTomato) 채널을 선택합니다. 분석| 선택하여 이 채널의 평균 강도 측정 측정. 녹색(YFP) 및 파란색(CFP) 채널에 대해 동일한 ROI 및 초점 평면으로 반복하고 모든 평균 강도 값을 저장합니다.
6. 이미지의 아무 곳이나 클릭하여 관심 있는 셀의 타원형 ROI를 제거합니다.
7. 정규화를 위해 배경 수준을 측정하려면 C-스크롤 막대를 사용하고 빨간색(dTomato) 채널을 선택합니다. 분석| 을 선택하여 이 채널의 전체 필드에 대한 최소 강도 측정을 수행합니다. 측정. 녹색(YFP) 및 파란색(CFP) 채널에 대해 동일한 초점 평면으로 반복하고 모든 최소 강도 값을 저장합니다.
관심 셀에 대한 상대 RGB 채널 가중치를 계산합니다.
참고 : 이러한 강도 값에서 상대 RGB 채널 가중치의 계산은 마이크로 소프트 엑셀 또는 R^43과같은 다양한 소프트웨어 프로그램에서 수행 할 수 있습니다.
1. 해당 채널 및 초점 평면의 전체 필드에서 최소 강도를 빼서 각 채널에 대한 셀 ROI의 평균 강도 측정을 정규화합니다.
2. 각 채널의 정규화된 평균 RGB 강도 값을 합산하여 셀의 총 정규화된 RGB 강도를 찾습니다.
3. 해당 채널의 정규화된 평균 강도 값을 정규화된 RGB 강도로 나누어 각 채널의 상대 채널 중량을 계산합니다.
R^43,^,^44에대한 삼차 패키지를 사용하여 상대 RGB 채널 가중치를 삼차 플롯으로 표시합니다. 삼차 플롯은 3D RGB 공간에서 유사한 색상의 군집을 시각화하는 데 유용합니다.
셀 색상 간의 차이를 정량화하기 위해 색상 분산 계수를 계산합니다.
1. 다음 방정식을 사용하여 3D RGB 공간의 두 색상 사이의 유클리드 거리를 계산합니다.
  
  여기서 R, G 및 B는 7.2에서 계산된 상대 RGB 채널 가중치입니다.
2. 이해하기 쉽도록 색상 간 가능한 최대 거리인 √2로 나누어 색상 거리를 정규화하여 0과 1 사이의 색상 분산 계수를 얻으려면 0과 1 사이에 색상 분산 계수를 얻었으며, 여기서 0은 정확히 동일한 색상을 나타내고 1은 완전히 다른 색상을 나타냅니다(예: 순수한 빨간색과 순수한 파란색).

Representative Results

Discussion

이 프로토콜은 발달하는 제브라피쉬 뒷뇌에서 전구 세포 및 뉴런의 클론을 시각화하고 이를 뇌무지개 및 타임랩스 공초점 현미경 검사법^11을사용하여 생체 내에서 따르는 방법을 설명한다. 생체외 또는 생체외 연구에 비해 이 프로토콜의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 자연 적인 milieu에서 척추 동물 뇌의 증식 영역을 직접 관찰 하는 기능. 이 기술은 retroviral 벡터를 사용하여 단일 복제본에 레이블을 붙인 이전 연구를 기반으로 합니다. 대조적으로, hsp:Zebrabow의 사용은 동시에 많은 클론을 컬러 코드를 구성, 멀티 플렉스 계보 추적및 클론 중 역학에 초점을 허용^11. 이 프로토콜은 다른 시스템 또는 세포 유형의 개발에 초점을 맞추기 위해 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 무지개 구조는 제브라피시 배아에서 발현될 수 있다. hsp:Zebrabow에서 제브라피쉬 hsphsp70 프로모터를 사용하면 신경 전구체 및^{뉴런(11)을}포함한 열 쇼크 에 따른 다양한 세포 유형의 모자이크 라벨링을 초래하고, 연구자들에게 유전자^{발현(29)을}시간적 제어를 제공한다. 열 충격 프로모터의 사용은 지속적으로 색상 코드 클론을 라벨, 다른 프로모터는 명확하게 이러한 방식으로 세포 계보를 묘사하지 않을 수 있지만. 클론 정체성이 관심 요인이 아닌 경우, 다른 프로모터를 활용한 구성은 특정 세포 유형에 라벨을 붙이는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, neuroD 프로모터는 미성숙한^뉴런(18,^,^49)에라벨을 붙이도록 사용될 수 있다. 또한, 미세 주사를 수행하는 대신, 연구원은 Tg (유비 : Zebrabow)^{15 및} Tg (신경 : 얼룩말)^18과같은 라인을 포함하여 형질 전환 된 무지개 얼룩말피시를 활용하도록 선택할 수 있습니다. 이 경우, Tg(hsp:Cre^a134)와)같은 Cre 재조합아제(15)를 발현하는 라인으로 교차하여, 유사한 방식으로 수집 및 유지되는 주입되지 않은 배아를 생성한다.¹⁵ 이 프로토콜은 1-3 dpf 사이의 물고기를 이미지화하도록 설계되었지만, 발달 신경 발생의 주요^{기간(50)과}일치하기 위해, 제브라피쉬는 관심의 발달 단계에 따라 더 이상 유지될 수 있다. 그러나, 24 hpf 이전에 Brainbow 발현을 유도하는 열 쇼크는^{배아(51)에}더 해로울 수 있다. 관심있는 연령 및 조직에 따라, 다른 장착 전략은 표적 조직을 올바르게 지향하는 것이 적절할 것이다.

특히 프로토콜을 수정하는 경우 문제 해결이 필요할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 배아당 전달되는 DNA, 볼루스 크기 및 총 DNA의 농도는 Brainbow 발현이 희미하거나 희소하거나 배아가 건강하지 않은 경우 모두 조정될 수 있습니다. 또한, 원하는 발현이 이루어지지 않으면 열 충격 단계의 길이 및 타이밍이 변경될 수 있다. 이미징에 사용되는 수집 파라미터는 사용 가능한 레이저 라인및 필터뿐만 아니라 원하는 표현, 장착 및 분석 유형에 따라 달라집니다. 또한 시간 경과 매개 변수는 관심 이벤트의 속도와 단일 Z 스택을 획득하는 데 필요한 시간에 따라 조정되어야 합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 아가로즈에 물고기를 적절하게 장착하는 것입니다 : 물고기의 각도가 부적절하거나 물고기가 너무 많은 아가로로 덮여있는 경우 최적의 이미징이 불가능합니다. 이 기술을 최적화하는 데는 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다. 또한 공초점 현미경 자체에서 FP 발현을 보기 전에 장착이 적절한지 여부를 확인하기 어려울 수 있으므로 이미징 전에 여러 물고기를 장착하는 것이 유용한 경우가 많습니다. 추가중요한 단계는 이미지화할 특정 물고기의 선별 및 선택입니다. 미세 주사를 수행하는 경우, 밝기, 라벨 밀도, 및 무지개 복사 수는 모두 물고기에 따라 크게 다를 수 있습니다. 희미한 라벨, 지나치게 조밀한 라벨링 또는 적은 복사 번호로 인해 색상이 적은 물고기에서 촬영한 이미지는 분석하기가 더 어려울 수 있습니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 살아있는 제브라피시를 최대 16 시간^11까지지속적으로 이미지 화 할 수있었습니다. 이 시간의 길이는 화상 진찰 실에서 E3 증발, 화상 진찰의 평면에서 물고기의 성장, 물고기의 죽음 또는 운동, 또는 공초점 현미경 시간에 사용자 구속에 의해 제한될 수 있습니다. 증발은 현미경 단계에서 온도 제어 액세서리를 사용하여 감소 될 수있다. 이 방법을 사용하여 생성된 5D 데이터 집합은 상당한 하드 드라이브 공간(예: 하룻밤 시간 경과에 대해 최대 ~100GB)과 분석할 적절한 컴퓨팅 성능이 필요한 대용량 파일인 경향이 있습니다.

이 프로토콜은 개발 얼룩말 뇌에서 신경 선조와 딸 뉴런의 인구 내에서 색으로 구분 된 클론을 시각화하고 시간이 지남에 따라 자신의 역학을 추적하는 연구원을 안내합니다. 한 가지 가능한 확장은 개발^18에서특정 유전자의 역할을 평가하기 위해 원적 FP 태깅과 Brainbow 시간 경과 이미징의 조합입니다. 이런 식으로, 조작된 유전자를 표현하는 클론은 명백한 색깔에서 구상되고, 시간이 지남에 따라 추적되고, Brainbow 표지되고, 조작되지 않은 이웃 클론과 비교될 수 있습니다. 생체 내 다색 이미징은 신경계가 어떻게 형성되고 기능하는지에 대한 중요한 기계론적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

1.5 mL transfer pipette (fine tip)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes	Corning	352070	For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line	SecureLine	NMT250	For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl<sub>2</sub>	Sigma	C3881	For E3
Cotton swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	For making embryo manipulators
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Digital dry bath	Genemate	490016-616	Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp water bath	Fisher Scientific	2320	For heat shocking embryos
KCl	AMRESCO	0395	For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Mating tanks	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
Methylene blue	Sigma	M9140	For E3
MgSO<sub>4</sub>	Sigma	9397	For E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl	J.T. Baker	4058-01	For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red	Sigma	P0290
Soft stitch ring markers	Clover Needlecraft, Inc.	354	For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)	Loctite	1363589	For making embryo manipulators
Syringe needles	Beckton Dickinson	BD329412	For dechorionating embryos

References

Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

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Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).