말초 혈액 한 방울에서 파생 된 T 세포에 바인딩된 PD-1 차단 항체 모니터링

요약

우리는 암 환자에게서 말초 혈액의 단지 한 방울을 요구하는 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석분석서를 개발했습니다.

초록

PD-1-차단 항체를 포함한 면역 체크포인트 억제제는 다양한 유형의 암에서 치료 결과를 크게 개선했습니다. 이 면역 요법의 약리학적 인 효능은 오래 지속되며 지속적인 혈중 농도로 인해 주사 중단을 넘어서도 연장됩니다. 여기서 우리는 PD-1-차단 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 T 세포 결합 상태를 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석기를 개발했다. 포도당 검사같이, 이 분석실험은 말초 혈액의 단지 1 방울을 요구합니다. T 세포에 결합하는 항체를 시각화하는 것은 항체 혈중 농도를 측정하는 것보다 더 신뢰할 수 있습니다. 추가적으로, 필요한 경우에, 우리는 잠재적으로 PD-1-차단 항체에 묶인 T 세포에 많은 특유한 면역 관련 마커를 분석할 수 있습니다. 따라서, 이것은 암 환자에서 PD-1-차단 항체의 약리효과를 분석하기 위한 간단하고 최소침습적인 전략이다.

서론

PD-1-차단 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)^1,2,3,4를포함하는 다양한 유형의 암치료를 위한 표준 선택이 되고 있다. 그(것)들은 전통적인 세포 독성 화학요법에 반응하지 않은 암 환자의 부분 집합에 있는 현저한 치료 효력을 보여줍니다. 그러나, PD-1-차단 항체를 포함하는 면역 체크포인트 억제제(ICIs)는, 면역 관련 부작용(irAEs)이라고 불리는 특이적 스펙트럼의 독특하고 뚜렷한 스펙트럼을 유발할 수^{있다 5.} irAEs는 거의 모든 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 그들은 가장 일반적으로 위장관에서 관찰, 내분비 땀샘, 피부, 간, 그들은 소양증을 일으킬 수 있습니다, 발진, 구역질, 설사, 및 갑상선 질환^6,7. 일반적으로 대부분의 iAEs는 ICI가 발생한 후 1~2개월 이내에 나타납니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그(것)들은 처리의 시작 후에 1 년 이상 또는 처리^중단

프로토콜

샘플링은 일상적인 임상 절차 동안 수행되었다. 모든 인간 샘플은 헬싱키 선언에 따라, 일본 오사카 대학(15383 및 752)의 윤리검토위원회의 승인을 받아 피험자가 제공한 동의를 얻은 후 얻어졌습니다.

1. 전혈 샘플 준비 및 염색

1. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 포함하는 혈액 수집 튜브로 전체 혈액 샘플을 수집합니다.
   참고: 혈액 수집은 일반 바늘 이나 혈액 랜싯을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
2. 전혈 샘플 20 μL을 5 mL 바닥 폴리스티렌 유동 세포 분석 튜브로 옮김.
   참고 : 튜브에 대한 세포의 비 특이적 결합을 줄이기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 2 % 태아 소 혈청 (FBS)의 1 mL을 튜브에 첨가하고 샘플에 적용하기 전에 10 s 동안 소용돌이를 제거합니다.
3. PBS에 2% FBS의 20 μL을 추가합니다.
4. 10 μL의 인간 전용 FcR 차단 시약을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
5. 적혈구 리시스 완충액 500 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
6. PBS에 2% FBS 의 4 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 400 x g....

결과

게이팅 전략 및 유세포분석분석(도1)은NSCLC 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 수득된 T 세포에 결합하는 PD-1-차단 항체를 검출할 수 있다. PD-1-차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않으며, PD-1-검출 항체(EH12.1)에 의해 PD-1 발현이 확인될 수있다(그림 2A). 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4(니볼루맙, 펨브롤리주맙)는 항IgG4 항체(HP6025)에 의해 T 세포에서 검출될 수 있는 반면, PD-1 검출 항체 EH12.1은 치료적 PD-1 항체가 EH12.1 결합을 방해하기 때문에 T 세포상에서 어떤 PD-1도 인식하지 못한다. 이것은 우리가 간접적으로 PD-1-검출 항체의 결합의 부족에 근거를 둔 PD-1-차단 항체의 치료 결합을 측정하고 있다는 것을 의미합니다. 대표적인 데이터는 PD-1-차단 항체의.......

토론

이 기사에서는, 우리는 우리가 원래 nivolumab 검출을 위해 개발한 말초 혈액의 한 방울에서 파생된 T 세포에 결합된 PD-1-차단 항체를 검출하기 위하여 유세포계를 이용한 방법을 보고합니다^10. 이 기술은 매우 간단하고 수행하기 쉽지만 정확한 결과를 얻으려면 두 가지 중요한 사항을 주목해야합니다. 하나는 PD-1 분자를 검출하기 위해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 경쟁하는 적절한 항체를 사용해야 한다는 것입니다. 이 문제는 이전 연구^11에서평가되었다. 다른 하나는 표면 염색 전에 RBC 라시스를 철저히 수행해야한다는 것입니다. IgG4 양성 클러스터의 게이트를 결정하기 위해 각 분석에 대해 이소형 제어가 확립되는 한, 주파수는 영향을 받지 않습니다. 그러나, 이 프로토콜을 사용하면 RBC 라시스가 불충분할 때 림프구 게이트에서 T 세포 수와 각 표면 마커의 강도의 감소가 있을 수 있다. 또한, RBC 용해 단계는 표면 염색 전에 수행되어야 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10X RBC 용해 완충액 (다종)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II 유세포분석기	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a 항체	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate 완충 식염수	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR 차단 시약, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
마우스 IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
마우스 monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ 아이소타입 컨트롤	BD	557646