방법 논문

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

DOI:

10.3791/60612

⸱

2020년 3월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

초록

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해부학적으로 인접한 단일 세포에서 심오한 전사 이질성은 강력한 조직 기능이 세포 표현형 다양성에 의해 달성될 수 있음을 시사한다. 생물학적 시스템의 네트워크 역학을 조사하는 단세포 실험은 생물학적으로 의미 있는 해상도에서 다양한 조건에 대한 세포 및 조직 반응을 입증합니다. 본 명세서에서, 우리는 해부학적으로 특정 한 위치에서 단 하나 세포를 집합하고 정확하게 그들의 유전자 발현 단면도의 부분 집합을 측정하기 위한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 레이저 포획 미세 해부 (LCM)와 미세 유체 역 전사 정량 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 결합합니다. 우리는 또한 이 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼을 사용하여 장 내용물의 미생물 풍부를 측정합니다.

서론

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단일 세포의 유전자 발현 프로파일을 측정하는 것은 조직 내에서 광범위한 표현형 이질성을 입증하였다. 이 복잡성은 조직 기능을 통제하는 생물학 네트워크의 우리의 이해를 복잡하게 했습니다. 우리 그룹과 다른 사람들은 많은 조직과 조건에서이 현상을탐구했다1, 2,3,4,5,6. 이러한 실험은 유전자 발현 네트워크의 조절이 이러한 이질성의 근간을 이룬다는 것을 시사할 뿐만 아니라, 단일 세포 분해능이 조직 수준의 분해능이 인식되지 못하는 조직 기능의 복잡성을 드러낸다. 실제로, 세포의 단지 작은 소수민족은 특정 조건 또는 도전에 반응할 수 있습니다, 그러나 전반적인 생리학에 그 세포의 충격은 실질적일지도 모릅니다. 또한 다중 세포 유형 및 조직에서 고차원 데이터 세트에 다변량 방법을 적용하는 시스템 생물학 접근법은 시스템 전반의 치료 효과를 해명할 수 있습니다.

우리는 이러한 데이터 세트를 얻기 위해....

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프로토콜

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이 연구는 토마스 제퍼슨 대학과 드렉셀 대학 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 권고에 따라 수행되었다. 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학과 의학 IACUC의 드렉셀 대학에 의해 승인되었다.

1. 동물 모델

  1. 2 개의 75 mg 느린 릴리스 모르핀 황산 염 펠 릿 또는 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐에 피하 하 게 두 개의 위약 펠 릿을 삽입 합니다.
    1. 경미한 멸균 수술에 가운과 장갑을 적절히 사용하십시오. 필요한 경우 쥐 도르섬을 클리퍼로 면도합니다.
    2. 동물의 눈에 수의사 연고를 바르고 있습니다. 약 20 s의 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취시다. 마취는 의식 상실로 확인됩니다.
    3. 비드 멸균 무딘 가위로 쥐 도르섬에 중간 절개를하고 비드 살균 프로브로 신체 벽에서 진피를 분리하십시오. 비드 멸균 집게로 진피 아래에 펠릿을 삽입합니다. 절개를 멸균 바늘로 닫아 봉합합니다.
      참고 : 전체 절차는 쥐 당 약 5 분이 소요됩니다. 신선한 멸균 장갑은 각 쥐에 사용됩니다.
    4. 수술 후 회복을 위해 쥐를 격리 케이지에 넣습니다. 심장 박동과 규칙적인 호흡 리듬을 확인하십시오. 의식이 회복 될 때까지 쥐를 관찰하십시오. 수술 후 통증을 평가하십시오....

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결과

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단일 세포의 선택은 시각적으로 그리고 분자적으로 모두 검증되었다. 시각적으로, 세포 형태는 세포 수집 전에 볼 수 있었다. 수집된 세포는 QC 스테이션및 세포핵 얼룩(DAPI)에서 단일 세포 선택 마커 형광과 중첩된 후 볼 수 있었다. 그림 2A는 CeA를 포함하는 척랫래전뇌를 가진 슬라이드의 대표적인 이미지를 나타낸다. 후속이미지(도 2B-D)는전사분석을 위한 단일 세포 및 이들의 제거를 조직으로부터의 선택과 보여준다. 분자적으로, 세포 유형 별 마커는 그 세포 유형에서 증가된 발현을 입증하였다(도1C). 뉴런, 마이크로글리아, 성상세포를 살펴보고 NeuN, Maf및 Gfap의

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토론

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단세포 생물학은 세포 표현형의 이질성과 조직 기능의 견고성을 입증했습니다. 이 사실 인정은 거시와 마이크로 규모 둘 다에 생물학 시스템의 조직에 통찰력을 제공했습니다. 여기서, 우리는 비교적 저렴한 비용으로 해부학적 특이성 및 전사 정확도를 제공하는 단일 세포 전사체 측정을 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 qPCR이라는 두 가지 방법의 조합을설명한다(도 1). 우리 그룹은 시스템 생물학 접근법을 취하고 종종 동일한 동물의 여러 조직을 측정합니다. 우리는 생물학 시스템이 전사 수준에서 각종 도전에 어떻게 반응하는지 결정하는 데 유연하고 유익한 이 방법을 찾아내십시오. 추가적으로, 우리는 기준선 조건에 있는 셀 방식 표현형의 해부학 매핑에서 이 방법을 이용합니다.

우리는 CeA가 오피오이드 의존성과 철수에 어떻게 반응하는지 탐구하는 최근 간행물의 데이터 및 수정 된 수치를 제공합니다4. .......

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공개 사항

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저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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여기에 제시된 작품은 JS와 RV에 수여 NIH HLB U01 HL133360을 통해 투자되었다, JS와 EVB에 수여 NIDA R21 DA036372, T32 AA-007463 SJO의 지원을 위해 얀 후크에 수여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20X DNA 결합 염료Fluidigm100-7609NA
2x GE 분석 로딩 시약Fluidigm85000802-RNA
48.48 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFCFluidigmBMK-M-48.48NA
96.96 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFCFluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-CD11β 항체Genway BiotechCCEC48Microglia Stain,
Anti-NeuN 항체, 클론: A60EMD, MilliporeMAB377신경 세포, 염색,
ArcturusXT, 레이저 캡처 미세해부 시스템ArcturusNA
Biomark, HD, Fluidigm,NART-qPCR 플랫폼
소 혈청, 항원, Sigma-AldrichB4287
CapSure 매크로 LCM 캡ThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect 원스텝 qRT-PCR 키트ThermoFisher Scientific11753500용해 완충액 용액 구성 요소
DAPIThermoFisher Scientific62248핵 염색
DNA 현탁액 완충액TEKnovaT0221
엑소뉴클레아제 INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure 샘플 추출 장치ThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드ThermoFisher Scientific22-037-246일반 유리 슬라이드
GeneAmp 얇은 벽 반응관ThermoFisher ScientificN8010611
GFAP 단클론 항체ThermoFisher ScientificA-21294성상세포 염색
염소 안티-마우스 IgG (H+L), Superclonal™ 재조합 2차 항체, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry 항체
IFC 컨트롤러FluidigmNA
NA RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher 과학11754250VILO 및 SuperScript
T4 유전자 32 단백질.M0300S
NA TaqMan 프리앰프 마스터 믹스ThermoFisher Scientific4391128NA
TE 버퍼TEKnovaT0225NA
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....

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재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

RT PCR

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