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방법 논문

SNS 코발트(II) 간알코올탈수소효소의 집게 모델 복합체 의 제조

6.6K 조회수

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DOI:

10.3791/60668

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2020년 3월 19일

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

이 논문에서

요약

간 알코올 탈수소효소의 SNS 핀서 코발트(II) 모델 복합체의 제조가 여기에 제시된다. 복합체는 CoCl2·6H2O로 리간드 전구체를 반응시킴으로써 제조될 수 있고, 디에틸 에테르가 코발트 복합체를 함유하는 아세토니트릴 용액으로 천천히 확산되도록 함으로써 재결정화될 수 있다.

초록

화학 모델 복합체는 효소의 활성 부위를 나타내기 위해 제조된다. 이 프로토콜에서 삼각측량 집게 리간드 전구체(각각 2개의 유황 및 1개의 질소 공여자 원자 기능(SNS)를 소유하고 비스-이미다졸 또는 비스트리아졸 화합물을 기반으로)의 패밀리는 CoCl2·6H2O와 함께 금속화되어 삼지창 면체 코발트(II) 복합체를 감당할 수 있다. 코발트(II) 모델 복합체의 간 알코올 탈수소효소의 제제는 허구이다. 리간드 전구체를 함유하는 아세토니트릴 용액에 CoCl2·6H2O를 첨가할 때 빠른 색상 변화에 기초하여, 복합체는 빠르게 형성된다. 금속 복합체의 형성은 용액이 하룻밤 동안 역류할 수 있도록 허용한 후에 완료된다. 이러한 코발트(II) 복합체는 간 알코올 탈수소효소(LADH)에서 아연 활성 부위의 모델역할을 한다. 복합체는 단결정 X선 회절, 전기 분무 질량 분광법, 자외선 이시광선 분광법 및 원소 분석을 사용하는 것이 특징입니다. 정확하게 복잡한의 구조를 결정하기 위해, 그 단결정 구조를 결정해야합니다. X 선 회절에 적합한 복합체의 단결정은 디에틸 에테르의 느린 증기 확산을 통해 코발트 (II) 복합체를 포함하는 아세토나이트트릴 용액으로 성장합니다. 고품질 결정의 경우, 재결정화는 일반적으로 1주일 이상 또는 그 이상에 걸쳐 이루어집니다. 이 방법은 다른 모델 조정 단지의 준비에 적용 될 수 있으며 학부 교육 실험실에서 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 사람들이 자신의 연구에 유익한 단결정을 얻기 위해이 재결정 방법을 찾을 수 있다고 믿어진다.

서론

제시된 방법의 목적은 금속로효소의 촉매 활성을 더 이해하기 위해 LADH의 소분자 유사체를 제조하는 것이다. LADH는 보조 인자 결합 도메인 및 아연(II) 금속 함유 촉매 도메인1을포함하는 디메릭 효소이다. LADH는, 공동 인자 NADH의 존재, 케톤 및 알데히드각각의 알코올 유도체2를감소시킬 수 있다. NAD+의존재에서, LADH는 케톤과 알데히드2에알코올의 산화의 역 촉매를 수행 할 수 있습니다. LADH의 활성 부위의 결정 구조는 그것의 아연 (II) 금속 센터가 히스티딘 측사슬과 2 개의 유황 원자에 의해 제공되고 두 개의 시스테인 리간드3에의해 제공되는 하나의 질소 원자에 결합되어 있음을 보여줍니다. 추가 연구는 아연 금속 센터가 비질 물 분자로 결찰되어 금속 센터 주위에 의사 - 적층 기하학의 결과로4.

우리는 이전에 보고및 활용 SNS 핀터 리간드 전구체뿐만 아니라 삼각리그 리간드 전구체를 포함하는 Zn (II) 복합체를 형성하기 위해 ZnCl2와 리간드 전구체를 금속화5,,6,,7. 이러한 리간드 전구체는 도 1에도시되어 있다. 이러한 아연(II) 복합체는 전자 가난한 알데히드의 공양량 감소를 위한 활성을 나타내었으며, 따라서 LADH를 위한 모델 복합체이다. 이어서, 일련의 구리(I) 및 구리(II) 복합체의 합성 및 특성화는 SNS 리간드 전구체를 함유하고 있는8,,9,,10으로보고되었다.

LADH는 아연(II) 효소이지만, LADH의 코발트(II) 유사체에 대한 더 많은 분광 정보를 얻기 위해 LADH의 코발트(II) 모델 복합체를 준비하는 데 관심이 있습니다. 코발트(II) 복합체는 착색된 반면 아연(II) 복합체는 흰색이 아닙니다. 코발트 (II) 복합체가 착색되기 때문에, 코발트 (II) 복합체에서 리간드 필드의 강도에 대한 정보도 수집 할 수있는 복합체의 자외선 가시 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 가우시안 계산과 실험적으로 얻은 자외선 가시 스펙트럼의 정보를 사용하여 리간드 필드의 강도에 대한 정보를 추론할 수 있습니다. 코발트(II)는 아연(II)을 대체할 수 있는 좋은 데, 이는 두 이온 모두 이온 산도가 유사하고 루이스 산도가11,,12이기때문에.

제시된 방법은 LADH5,,6의자연적인 촉매 거동을 모방하려고 시도하는 모델 복합체를 합성하고 특성화하는 것을 포함한다. 우리는 이전에 ZnCl2와 리간드 전구체 의 가족을 금속화하여 LADH4에서아연 활성 부위의 구조와 반응성을 모델링한 LADH의 아연(II) 모델 복합체를 형성했습니다. 여러 실험을 통해, 이러한 핀처 리간드는 서로 다른 환경 조건하에서 견고하다는 것이 입증되었으며 부착된 R-그룹의 다양한 컬렉션으로 안정적으로 유지되었습니다. 5,,6

삼지창 리간드는 삼지연관현안의 강한 킬레이트 효과로 인해 금속화에 더 성공하는 것으로 밝혀졌기 때문에 모노덴테이트 리간드에 비해 바람직하다. 이러한 관찰은 모노덴테이트리간드(13)에비해 삼지창 집게 리간드 형성의 보다 선호되는 엔트로피에 기인한다. 더욱이, 삼각피압기 리간드(tridentatate pincer ligands)는 금속 복합체의 이각을 방지할 가능성이 높으며, 이는 이분화가복합체(14)의촉매 활성을 느리게 할 가능성이 있기 때문에 선호된다. 따라서, 삼지창 집게 리간드를 사용하여 촉매 활성 및 강력한 복합체의 제조에서 유기 금속 화학에서 성공한 것으로 입증되었습니다. SNS 핀서 복합체는 일반적으로 제2 및 제3 열 전이금속(15)을함유하고 있기 때문에 다른 핀체 시스템보다 덜 연구되었다.

금속 효소에 대한 이 연구는 생물학의 다른 영역에 적용 될 수있는 효소 활성의 이해를 더 도울 수 있습니다. 대안적인 방법(LADH의 전체 단백질을 합성)에 비해 모델 복합체를 합성하는 이 방법은 여러 가지 이유로 유리하다. 첫 번째 장점은 모델 복합체가 분자 량이 적고 천연 효소의 활성 부위의 촉매 활성 및 환경 조건을 정확하게 표현 할 수 있다는 것입니다. 둘째, 모델 컴플렉스는 안정적이고 공감할 수 있는 데이터로 작업하고 생성하기가 더 간단합니다.

이 원고는 LADH의 두 코발트(II) 집게 모델 복합체의 합성 제제 및 특성화를 설명합니다. 두 복합체 모두 유황, 질소 및 유황 공여자 원자를 포함하는 집게 리간드를 특징으로합니다. 제1복합체(4)는이미다졸 전구체를 기초로 하고, 제2(5)는 트리아졸 전구체를 기초한다.5 복합체는 수소 공공체가 있는 전자 가난한 알데히드의 공조량량량 감소에 대한 반응성을 보여준다. 이러한 반응성 결과는 후속 원고에 보고될 것이다.

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프로토콜

1. 클로로-(n3-S,S,N)-[2,6-비스(N-이소프로필-N'-메틸렌에미다졸-2-티오네)피리딘]코발트(II)테트라클로로코발테이트 [4]

  1. 복잡한 4를준비하려면 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)의 0.121 g (3.12 x 10-4 mol)을 추가하십시오.피리딘 (C19H25N5S2)100 mL 의 아세토니트릴 6 ~ 15 mL. 다음으로, 이 용액에 0.0851 g (3.58 x 10-4 mol)의 코발트 염화물 (II) 헥사 하이드레이트 (CoCl2·6H2O)를 추가하십시오. 반응 용액은 코발트(II) 염화물 헥사하이드레이트가 첨가된 직후 밝은 노란색에서 에메랄드 그린으로 변해야 합니다.
  2. 플라스크에 볶음 바를 추가합니다. 역류및 완전한 반응을 보장하기 위해 20 시간 동안 반응을 저어. 감소된 압력하에서 로토바를 사용하여 용매를 제거합니다.

2. 클로로-(n3-S,S,N)-[2,6-비스(N-이소프로필-N'-메틸렌에미다졸-2-티오네)피리딘]코발트(II)테트라클로로코발테이트[4]의 느린 증기 확산에 의한 재결정화

  1. 용질을 아세토니트릴(7.5mL)에 녹이고 용액을 걸레질한 다음 용액을 1개의 드람 바이알에 고르게 놓습니다. 1.5 mL의 아세토니트릴 용액으로 각 바이알을 채웁니다.
    1. 면소재를 추가하여 바이알을 덮어 증기 확산이 느려집니다. 면은 유리병 의 상단에 있는 개구부에 꼭 맞습니다.
    2. 바이알을 50 mL의 디에틸 에테르가 들어있는 240 mL 항아리에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 항아리를 닫습니다.
    3. 결정이 1 주일 동안 성장할 수 있도록하십시오.
      참고: 재결정화는 1일 이상 걸릴 수 있습니다.

3. 클로로-(n3-S,S,N)-[2,6-비스(N-이소프로필-N'-메틸레네트리아졸-2-티오네)피리딘]코발트(II)테트라클로로코발트테이트 [5]

  1. 복잡한 5를준비하려면 2,6-비스 (N-isopropyl-N'-methylenetriazole-2-thione)의 0.183 g (4.70 x 10-4 mol)을 추가하십시오.피리딘 (C17H23N7S2)100 mL 의 아세토니트릴 6 ~ 15 mL. 이 용액에, 코발트 염화물 헥사 하이드레이트 (CoCl2·6H2O)의 0.223 g (9.37 x 10-4 mol)을 추가하십시오. 반응 용액은 코발트 (II) 염화물 헥사 하이드레이트가 첨가 된 직후 밝은 노란색에서 로얄 블루로 색상을 변경해야합니다.
    1. 플라스크에 볶음 바를 추가합니다. 역류및 완전한 반응을 보장하기 위해 20 시간 동안 반응을 저어. 감소된 압력하에서 로토바를 사용하여 용매를 제거합니다.

4. 클로로-(n3-S,S,N)-[2,6-비스(N-이소프로필-N'-메틸레네트리아졸-2-티오네)피리딘]코발트(II)테트라클로로코발트테이트[5]의 느린 증기 확산에 의한 재결정화

  1. 용질을 아세토니트릴(9.0 mL)에 녹이고 용액을 걸레질한 다음 용액을 1개의 드람 바이알에 고르게 놓습니다. 1.5 mL의 아세토니트릴 용액으로 각 바이알을 채웁니다.
    1. 면소재를 추가하여 바이알을 덮어 증기 확산이 느려집니다. 면은 유리병 의 상단에 있는 개구부에 꼭 맞습니다.
    2. 바이알을 50 mL의 디에틸 에테르가 들어있는 항아리에 놓습니다. 뚜껑으로 바이알을 닫습니다.
    3. 결정이 1 주일 동안 성장할 수 있도록하십시오.
      참고: 재결정화는 1일 이상 걸릴 수 있습니다.

5. 엑스레이 결정학

  1. 나일론 루프에 4의 크리스탈을 장착합니다. 리가쿠 옥스포드 회절 회절 회절 디로토미터에 대한 데이터를 수집합니다. 여기서, X선 회절 데이터는 173(2) K. 직접 방법을 사용하여 Olex216 및 ShelXT17 구조 용액 프로그램을 사용하여 결정 구조를 해결한다. 최소한의 정사각형 최소화를 사용하여 ShelXL18 미세 조정 패키지로 구조를 구체화합니다.
  2. 나일론 루프에 5의 크리스탈을 장착합니다. 리가쿠 옥스포드 회절 회절 회절 계측기에서 X선 회절 데이터를 수집합니다. 여기서, X선 회절 데이터는 173(2) K. 직접 방법을 사용하여 Olex216 및 ShelXT17 구조 용액 프로그램을 사용하여 결정 구조를 해결한다. 최소한의 정사각형 최소화를 사용하여 ShelXL18 미세 조정 패키지로 구조를 구체화합니다.

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결과

합성
복합체 4 및 5의 합성은 코발트(II) 염화물 헥사하이드레이트와 함께 비스티온 리간드 전구체를 함유하는 아세토니트릴 용액을 반응시킴으로써 성공적으로 수행되었다(도2). 이 반응은 공기가있는 환류 온도에서 발생했습니다. 일반적으로, 복합체 4 및 5는 아세토니트릴, 디메틸 설폭사이드, 디클로로메탄 및 메탄올에 용해되는 것으로 관찰되었다. 복합 4는 녹색이고 복잡한 5는 파란색이었습니다. 단지 4와 5의 백분율 수율은 양적이었습니다.

엑스레이 결정학
복합체 4 및 5의<...

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토론

단지 4와 5의 준비는 허구입니다. 핵심 단계는 각각의 리간드 전구체를 포함하는 아세토니트릴 용액에 고체 CoCl2·6H2O를 추가하는 것이다. 이 용액은 CoCl2·6H2O를 첨가한 후 몇 초 만에 진한 녹색으로 변하여 복잡한 4를형성한다. 이 용액은 CoCl2·6H2O를첨가한 후 밝은 파란색으로 변하여 복잡한 5를형성한다. 완전한 반응을 보장하기 위해 용액은 하룻밤 동안 역류에 놓입니다.

복합체 4 및 5의단결정 성장하려면 복합체 4 또는 5를 포함하는 아세토니트릴 용액을 농축해야합니다. 복합체는 가능한 한 농축된 복합체...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

존 Miecznikowski는이 프로젝트에 대한 다음과 같은 재정 지원을 받았다: 코네티컷 NASA 우주 보조금 얼라이언스 (수상 번호 P-1168), 페어 필드 대학 과학 연구소, 예술과 과학 출판 기금, 페어 필드 대학 학부 여름 연구 수급, 그리고 국립 과학 재단 - 주요 연구 계측 프로그램 (그랜트 번호 CHE-1827854) 자금을 획득하는 자금 400 MHz의 NMR 분광계. 그는 또한 테렌스 우 (예일 대학) 전기 스프레이 질량 스펙트럼을 획득하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. Jerry Jasinski는 X 선 회절계를 구입하는 기금에 대한 국립 과학 재단 - 주요 연구 계측 프로그램 (그랜트 번호 CHE-1039027)을 인정합니다. 쉴라 보니타티부스, 에밀세 알만자, 라미 하르부흐, 사만다 지그몬트는 여름 연구 비를 제공하는 하디만 학자 프로그램을 인정한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mL 원형 바닥 플라스크화학 유리CG150691100mL 단일 목 원형 바닥 플라스크, 19/22 외부 조인트
AcetonitrileFisherHB9823-4HPLC 등급
냉각기LaudaL000638Alpha RA 8
Cobalt Chloride hexahydrateAcros OrganicsAC423571000Acros Organics
Diethyl EtherFisherE-138-1Diethyl Ether Anhydorus
눈금 실린더FisherS6345625 mL 눈금 실린더
핫 플레이트Fisher11-100-49SHIsotemp Basic Stirring Hotplate
jarsFisher05-719-481250 mL jars
Ligand----------Miecznikowski 교수에 의해 이전에 Synthezied
면봉Fisher22-456-80중간 면봉 1
드람 바이알Fisher03-339TFE 라이닝 캡이있는 1 드람 바이알
피펫 Fisher13-678-20B5.75 인치 피펫 피펫
전구Fisher03-448-21Fisher 브랜드 라텍스 전구
모래 목욕용 피펫 재결정 접시Fisher08-741 D325 mL 모래 목욕
역류 응축기Chem GlassCG-1218-A-22콘덴서 (19/22 내부 조인트
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann; Heidolph Collegiate 로터리 증발기, Heidolph WB 에코 배스, Heidolph 로터리 증발기
모래 목욕용 바다 모래Acros Organics,612355000모래목욕용 세척 바다 모래
교반 바Fisher07-910-23달걀 모양의 자기 교반 바
진공 그리스Fisher14-635-5D다우 코닝
로토밥Heidolph Collegiate36302830Heidolph Rotovac 밸브 제어
HB9823-4 Roto-vap 용 Acetonitrile Fisher 용 재결정 접시 , , , , 용 고진공 그리스 진공 펌프

참고문헌

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  21. Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
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