핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.
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이 논문에서
요약
초록
Meiosis는 성적인 재생산을 위한 haploid gametes를 만드는 데 필요한 중요한 셀룰러 프로세스입니다. 모형 유기체는 적당한 염색체 분리를 지키는 페어링, 시냅스 및 재조합 사건을 포함하여 meiotic prophase 도중 일어나는 염색체 사건을 이해하는 중요한 역할을 했습니다. 마우스가 이 프로세스의 근본적인 분자 기계장치를 이해하기 위한 중요한 모형이 되는 동안, 이 시스템의 모든 meiotic 사건은 인간 적인 사람 막이오시스와 유사하지 않습니다. 우리는 최근에 인간 정자 발생의 모형으로 zebrafish의 흥미진진한 잠재력을 설명했습니다. 여기에서 우리는 염색체 퍼짐 준비에 있는 meiotic 염색체 그리고 관련있는 단백질을 구상하는 우리의 방법을, 상세히 기술합니다. 이러한 제제는 염색체 구조의 고분해능 분석을 허용하는 장점이 있다. 첫째, 우리는 성인 얼룩말에서 고환을 해부하는 절차를 설명하고, 그 다음에 세포 해리, 용해 및 염색체의 확산을 설명합니다. 다음으로, 우리는 마이오성 색소 단백질의 국소화, 면역 형광 검출 및 핵산 서열, 사이투 혼성화 (FISH)의 형광에 의해 국소화를 검출하는 절차를 설명합니다. 이러한 기술은 제브라피시 시스템에서 메오틱 크로마틴 아키텍처의 세포학적 분석을 위한 유용한 도구 세트를 포함한다. zebrafish 지역 사회에 있는 연구원은 이 기술을 빨리 마스터하고 생식 기능의 그들의 표준 분석에 통합할 수 있어야 합니다.
서론
성적인 재생산은 두 개의 haploid gametes의 조합을 통해 진행, 각각 체세포세포의 염색체 보완의 절반을 들고. Meiosis는 DNA 복제의 1 개의 라운드 및 염색체 분리의 2개의 연속적인 라운드를 통해 haploid gametes를 생성하는 전문화한 세포 분열입니다. prophase I에서 상동 염색체 (homologs)는 페어링, 재조합 및 시냅시스를 거쳐야하며, 후자는 횡 필라멘트에 의해 브리지 된 두 개의 상동 축을 포함하는 시냅톤 복합체의 형성을 특징으로하는 Sycp1(그림 1A,B). 이러한 프로세스를 제대로 실행하지 못하면 인간1의유산의 주요 원인인 이수성 게임의 생산으로 이어질 수 있습니다. 페어링, 재조합 및 시냅시스 사이의 조정에 대한 우리의 지식은 효모, C. 예쁜꼬마선충,마우스 및 초파리와같은 광범위한 유기체에 대한 연구에 의해 촉진되었습니다2. 상동 염색체 쌍과 분리의 일반적인 과정은 잘 보존되는 동안, 재결합 및 시냅증에 대한 의존성과 이러한 이벤트의 순서는 다양합니다.
상동 재조합을 개시하는 Meiotic 이중 가닥 휴식 (DSB) 형성은 렙토텐 동안 꽃다발....
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프로토콜
제브라피시와 관련된 모든 방법은 UC 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 윤리적 기준을 사용하여 수행되었습니다.
1. 염색체 확산 절차
참고: 다음 프로토콜은 슬라이드당 수백 개의 확산 된 meiotic 핵과 함께 4-6 슬라이드를 만들도록 설계되었습니다. 사용되는 고환의 수는 물고기의 크기에 따라 달라집니다. ~60일 후 수정 후(dpf) 및 15마리의 동물을 ~6개월 후 수정 후(mpf)에서 20마리의 동물을 사용할 것으로 예상됩니다. 큰 제브라피시(예를 들어, 12 mpf)의 경우 10마리의 동물로 충분해야 한다. 일부 meiotic 돌연변이체 (예를 들어, spo11-/-)의고환은 다소 작을 것이라는 점에 유의하십시오3. 이 프로토콜에서는 하나의 고환 풀이 단일 샘플로 간주됩니다. 4개 이하의 샘플을 병렬로 준비하는 것이 좋습니다.
- 확산 절차를 시작하기 전에 다음 해결 방법 확인
참고: 향후 확산 실험에 사용하도록 지정된 수량으로 다음 솔루션을 준비하는 것이 편리합니다.- 증류수 100 mL에 3.42 g의 자당을 용해시켜 0....
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결과
우리는 제브라피쉬 정자 세포 확산 제제를 준비하고 시각화하는 방법을 설명했습니다. 올바르게 수행하면, 우리의 절차는 잘 확산, 비 겹치는 핵을 산출한다. 이러한 핵을 회복하려면, 트립신에서 충분한 시간 동안 고환을 치료하고 적절한 수의 DNase I 처리를 개시 물질(즉, 고환)의 적절한 양을 가지는 것이 중요하다. 이러한 스프레드는 프로페이즈 I. 도 1 동안 메오틱 진행을 연구하기 위해 텔로미어 및 meiotic 단백질에 대해 염색될 수 있습니다.
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토론
여기에서 우리는 제브라피시 고환에서 분리된 정자 세포에서 핵 표면에 있는 텔로미어 및 염색체 관련 단백질의 위치를 탐구하는 방법을 기술합니다. 우리는 이 방법이 고환의 크기에 조정을 가진 그밖 teleost 종에 있는 정액 세포의 분석을 위해 적용될 것이라는 점을 기대합니다.
소수의 항체만이 제브라피쉬 메오틱 단백질로 제기되었지만, 우리는 인간(h) 또는 마우스(m) 단백질로 기르는 다음 항체를 사용하여 성공을 거두었습니다. 우리 실험실은 시냅톤 복합체 (SC)에 대한 신뢰할 수있는 마커역할을한 닭의 제브라피쉬 Sycp1 단백질 (zfSycp1)에 대한 항체를 제기했지만,이 단백질은 염색체가 완전히 시냅스 될 때 초기 zygotene에서 늦은 파키틴까지만 존재합니다. 토끼 항-hSYCP3 항체는 렙토틴으로부터 후기 파키텐에서 SC의 용해까지 메오틱 염색체 축을 검출하는 데 매우 신뢰할 수있다(도 1B,C).
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 제브라피쉬 meiocytes에서 염색체를 확산하고 염색하는 방법을 최적화하는 데 도움 원고와 응우옌에 대한 의견에 대한 트렌트 뉴먼과 마스다 샤리피 에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 GM079115에 의해 지원되었다 S.M.B에 수여.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 랙 | 여러 상용 브랜드 사용 | ||
| 16% 포름알데히드, 메탄올 무함유 | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | 여러 상용 브랜드 사용 가능 | ||
| 24 x 50 mm 유리 커버슬립 | 코닝 | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm 유리 커버 슬립 | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| 오토 클레이브 백 | 여러 상업 브랜드 사용 가능 | 플라스틱 커버 슬립을 만드는 데 사용됩니다. | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | 멸균 증류수에 100mg/ml 원액을 준비합니다. |
| 세포 여과기, 100 & 마이크로; m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
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| Clostridium< / em> histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | 여러 상업용 브랜드 사용 가능 | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
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| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | 고환을 해부하려면 두 가지가 필요합니다. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | 1:1000에 사용 |
| 염소 anti-chicken IgY (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | 1:1000에 사용 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands 염소 |
| anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| 헤파린 나트륨 염 | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| 습도 챔버 | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| 혼성화 오븐 | VWR International | 230401V (모델 5420) | |
| 인큐베이터 셰이커 | 뉴브런즈윅 과학 | 모델 클래식 C25 | |
| KCl | 피셔 Scientific | P217-500 | |
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| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
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| DAPI가 포함된 ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운트런 | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
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| 소듐 시트레이트 | Fisher Scientific | S279-500 | |
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| 슈퍼컷 가위, 30도; 각도, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | 어떤 작은 가위도 사용할 수 있습니다. |
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| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | 멸균 증류수에 희석하여 20% 작동 용액을 만듭니다. 실온에서 보관하십시오. 트리톤 X-100은 물에 희석될 때 침전물을 형성합니다. 침전물은 하룻밤 사이에 용해됩니다. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| 달걀 흰자위의 트립신 억제제 | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | 멸균 증류수에 희석하여 20% 작동 용액을 만듭니다. 실온에서 보관하십시오. |
| Vannas 스프링 가위 - 4mm(마이크로 가위) | Fine Science Tools | 15018-10 |
참고문헌
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
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재인쇄 및 허가
