여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
클러스터된 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 기술은 게놈에 있는 정확하고 표적으로 한 수정을 소개하는 널리 퍼진 실험실 공구가 되었습니다. 그것의 엄청난 인기와 급속한 확산은 그것의 전임자에 비해 그것의 쉬운 사용 및 정확성에 기인한다. 그러나 시스템의 구성 활성화는 제한된 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 논문에서는 Cas9 단백질의 조건부 안정화에 기초하여 CRISPR/Cas9 활성을 측두식할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 라파마이신 결합 단백질 FKBP12의 엔지니어링 된 돌연변이를 Cas9 (DD-Cas9)에 융합하면 FKBP12 합성 리간드 (Shield-1)의 존재에 의해 안정화 될 수있는 Cas9의 급속한 분해를 가능하게합니다. 다른 유도 가능한 방법과 는 달리, 이 시스템은 두 번째 유전자의 조건부 조절 없이 다른 관심사 유전자와 DD-Cas9를 공동 발현하기 위해 바이 시트론 시스템을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있다. 이 방법은 Cas9 뉴클레아아아제에 의해 표적화된 항선의 병렬, 독립적인 조작뿐만 아니라 추적 가능한 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 방법의 플랫폼은 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화 및 시험관 내 및 생체 내 환경에서 유전자의 기능적 상호 작용의 심문을 위해 사용될 수 있다.
서론
CRISPR-Cas9는"정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 관련 단백질 9"을의미하는 CRISPR-Cas9는 세균 적응 면역1,2에대한 연구의 일환으로 처음 발견되었다. 오늘날 CRISPR/Cas9는 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 위한 가장 인정받는 도구가 되었으며 시스템의 상이한 반복은 전사 및 후성 유전학 변조3을허용하도록 개발되었다. 이 기술은 DNA 4의 거의 모든 순서의 매우 정밀한 유전 조작을 가능하게합니다.
CRISPR 유전자 편집의 필수 성분은 사용자 지정 가능한 가이드 RNA 서열 및 Cas9 nuclease5이다. RNA 가이드는 DNA내의 표적-보완 서열에 결합하여 Cas9 뉴클레아아아제에게 게놈3,4의특정 지점에서 이중 가닥 브레이크를 수행하도록 지시한다. 그 결과 골짜기 부위는 비동종 최종 결합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR)에 의해 수리되며,....
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프로토콜
1. DD-Cas9 벡터
- Addgene (필러 서열 및 금성 (EDCPV), 플라스미드 90085와 DD-Cas9 벡터를 가져옵니다.
참고: 이것은 EFS 프로모터가 DD-Cas9 전사를 운전하는 동안 단일 가이드 RNA (sgRNA) 전사를 구동하는 U6 프로모터와 렌티바이러스 DD-Cas9 플라스미드입니다. DYKDDDDK 서열(flag-tag)은 Cas9의 C 단말에 존재하며, DD-Cas9및 변형형 형광 단백질 비너스(mVenus)를 분리하는 2A 자가 절단 펩티드(P2A)가 그 뒤를 잇고 있다.
2. 소형 가이드 RNA(sgRNA) 설계
- 특정 게놈 영역을 대상으로 여러 알고리즘 중 하나를 사용하여 DD-Cas9 벡터로 복제될 작은 가이드 RNA(sgRNA)를 설계한다.
참고: 오프 타겟 효과를 줄이려면 웹 사이트인 http://crispr.mit.edu 사용하여 가장 높은 점수를 받은 sgRNA 서열을 선택합니다. - sgRNA 서열당 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하고 주문하여 완전한 sgRNA를 만듭니다.
참고: 플라스미드는 BsmBI 효소에 의해 소화되기 때문에, SgRNA 서열에 BsmBI 소화 오버행을 추가하여 전방 및 역 올리고뉴클레오티드를 설계한....
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결과
Cas9의 조건부 발현을 가능하게 하기 위해, DD-Cas9 융합단백질(도 1A)19의발현을 구동하기 위해 U6 구동 프로모터로 구성된 이중 렌티바이러스 벡터 구조를 개발하였다. 시스템의 견고성과 효율성을 보여주는 패러다임으로서 폐 암종 A549 세포주와 렌티바이러스 구조를 변형시켰습니다. 리간드 쉴드-1의 존재 또는 부재에서 Cas9의 수준은 항플래그 특이적 항체를 이용하여 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 서양 블롯 분석에 의해 측정되었다. 우리는 감염되지 않은 세포와 모의 감염 세포 (차량)를 대조군으로 사용했습니다. 세포는 7d에 대해 10에서 1000 nM에 이르는 쉴드-1의 농도로 처리되었다. 도시된 바와 같이, Shield-1을 통한 치료는 강력한 투여량 의존방식으로 DD-Cas9의 발현을 조절할 수있었다(도 1B.......
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토론
CRISPR/Cas9 기술은 게놈2를기능적으로 심문하는 기능에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 유전자의 불활성화는 종종 세포 치사성, 기능적 적자 및 발달 결함을 초래하여 유전자 기능을 연구하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 제한한다7. 또한, Cas9의 구성 발현은 독성 및 오프 타겟 효과6의생성을 초래할 수 있다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 기술6을일시적으로 제어하기 위해 다양한 접근법이 개발되었다. 이들 시스템은 Cas9 및/또는 sgRNA 또는 Cas9 전사 후 및 번역 후활성화(21,22,23)의전사 제어를 기반으로 한다. 이러한 시스템의 대안으로 Cas9의 조건부 불안정화를 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 전작에 대한 우리의 실험실과 과학자 세리프 Senturk의 이전 구성원에게 감사드립니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고 다닐로 세고비아 감사합니다. 이 연구는 가능하 고 미국 전역 수영과 국립 암 연구소 암 대상 발견 및 개발 센터 프로그램에 의해 지원.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest 버퍼 | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 결찰 버퍼 | NEB | M0202S | |
| 비색 BCA 키트 | Pierce | 23225 | |
| DMEM, 고포도당, 글루타Max | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] 마우스 mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| 게놈 DNA 추출 키트 | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| 올리고뉴클레오티드, | 시그마, 알드리치 | ||
| pMD2.G | 애드겐 | 12259 | |
| 폴리브레네 | 시그마, 알드리치 | , TR-1003-G | |
| psPAX2 | 애드진 | , 12260 | |
| QIAquick PCR & 겔 클린업 키트 | Qiagen | 28506 | |
| 2차 항체 | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3, 적격 박테리아 세포 | , Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR 돌연변이 검출 키트 | 형질전환유전체학/IDT, | ||
| T4, PNK | NEB | , M0201S, | |
| Taq DNA 중합효소 | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] 마우스 mAb | Millipore | CP06-100UG |
참고문헌
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats....
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