Method Article

라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

DOI:

10.3791/60686

⸱

February 21st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 라벨이 없는 임피던스 측정을 사용하여 단일 마이크로 전극에서 성장한 단일 세포 층으로부터 작용제 유발 GPCR 활성화에 대한 전체 용량 응답 관계를 실시간으로 기록하는 것을 보여줍니다. 새로운 도징 방식은 시간 해결 의 손실없이 처리량을 크게 증가시킵니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

라벨프리 임피던스 계 세포 계 세포 배양 실험에서 리간드 유도 GPCR 활성화를 비침습적으로 연구하는 데 점점 더 사용되고 있다. 이 접근 방식은 수십 밀리초까지 디바이스 에 의존하는 시간 해상도로 실시간 셀 모니터링을 제공하며 고도로 자동화되어 있습니다. 그러나, 샘플 수치가 높아지면(예를 들어, 다양한 리간드에 대한 투여량-응답 연구), 일회용 전극 어레이에 대한 비용뿐만 아니라 순차적 웰바이웰 레코딩에 대한 가용 시간 분해능이 제한될 수 있다. 따라서, 우리는 여기에서 라벨없는 GPCR 분석의 출력을 현저하게 증가시킬 가능성이 있는 직렬 작용제 추가 프로토콜을 제시합니다. 직렬 작용제 추가 프로토콜을 사용하여 GPCR 주작동근은 샘플의 임피던스(agonist 모드)를 지속적으로 모니터링하면서 단일 세포 층에 농도를 증가시키면서 순차적으로 추가됩니다. 이 직렬 접근법을 통해, 이제 단 하나의 단일 세포 층에서 GPCR 작용제에 대한 전체 투여량 응답 곡선을 확립할 수 있다. 직렬 작용제 첨가 프로토콜은 상이한 GPCR 커플링 유형, Gq Gi/0 또는 Gs에 적용 가능하며, 연구 하에 수용체의 재조합 및 내인성 발현 수준과 호환된다. GPCR 길항제에 의한 수용체 차단은 또한 평가할 수 있다(길항제 모드).

Introduction

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본 보고서는 라벨프리 임피던스 측정에 의해 부착적으로 성장한 세포에서 리간드 유도 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 활성화의 정량화를 위해 개발된 직렬 첨가 프로토콜에 대한 상세한 설명을 제시한다. G 단백질 결합 수용체(GPCRs)는 다수의 생리적 기능 및 인간 질환에 관여한다1. 이 것 및 세포 표면에 그들의 좋은 접근성 때문에, GPCRs는 가장 중요 한 약물 목표 중 하나입니다. 이 평가는 GPCR을 표적으로 하는 ~700의 승인된 약의 추정수에 반영됩니다, 모든 판매된 약에 ~ 35% 점유율에 해당2.

새로운 약물의 개발은 두 가지 중앙 프로세스로 구성됩니다 : (i) 생물학적 표적 분자의 식별 및 기능적 특성화, (ii) 새로운 납 물질의 발견 및 관리 가능한 약물로의 개발. 두 프로세스 에서, 효율적인 방법은 정량적으로 약물 표적 상호 작용 및 후속 생물학적 다운스트림 반응을 평가하는 데 필요합니다. 전 임상 약물 개발 과정의 다른 단계는 약물과 표적 간의 생체 분자 상호 작용 연구, 배양 세포에 대한 기능적 연구, 절제된 장기 물질 또는 전체 동물에 대한 실험에 이르기까지 다양한 분석 방법을 사용합니다. 둘 다, 생리적 중요성과 생물학적 복잡성....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 전극 어레이의 셀 시딩

참고: 전극 레이아웃 선택은 연구 중인 셀수의 민감도와 수 간의 절충입니다. 전극이 작을수록 측정값이 더 민감하지만 연구 중인 셀 수가 작아지다. 기준 선 조건 하에서 시간이 지남에 따라 강한 임피던스 변동을 보이는 셀의 경우 더 크거나 디지털화된 전극이 바람직합니다.

  1. 37°C 수조에서 표준 셀 패싱 및 파종에 필요한 모든 용액을 미리 데우면 됩니다. 인간 U-373 MG 세포를 가진 분석의 경우: 칼슘과 마그네슘이 없는 인산완충식염수(PBS), 0.05% (w/v) 트립신, 세포 배양 배지(이글의 최소 필수 배지(EMEM)는 5% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 2 mML-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되었습니다.
  2. 종래의 세포 배양 플라스크 또는 접시의 바닥에 자란 스톡 배양의 세포층을 PBS로 2회 헹구는다.
  3. PBS를 제거하고 트립신 용액 (25 cm2에대한 1 mL)을 추가하고 세포가 37 °C에서 5 분 동안 배양하게하십시오 (U-373 MG 세포에 적용됨).
  4. 현미경 검사법에 의해 성장 기판의 바닥에서 세포의 완전한 분리에 대한 제어.
  5. 세포현탁액에 트립신 1mL당....

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Results

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다양한 주작동근 용액을 준비하기 위한 전형적인 계획은 표 1-4에서히스타민과 함께 8웰 전극 어레이를 이용한 실험에 대해 도시된다. 표 1 및 표 2는 추가 모드 1(cf., 도 1)을사용하여 실험에 대한 부피 및 농도를 제시하고, 표 3 및 표 4는 추가 모드 2(참조, 도 1)에따른 실험에 대한 부피 및 농도를 제시한다. 데이터는 방정식 1을 사용하여 계산되었습니다.

대표적인 실험은 히스타민을 아고니제로서 사용하여 직경 250 μm의 작동 전극을 가진 8웰 전극 어레이에서 자란 히스타민 1 수용체를 내생적으로 발현하는 U-373 MG 세포의 동시층에 대해

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Discussion

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이 프로토콜은 동일한 수용체에 대한 특정 길항제의 부재 또는 존재 시 작용제-유도 GPCR 활성화의 투여량-반응 관계를 결정하기 위한 무임피던스 측정 방법을 기술한다. 이 방법의 개념 증명은 최근 간행물12에발표되었다. 우리의 지식에 그것은 시험관에서 단일 세포 층을 사용 하 여 주 작동 근 중재 GPCR 활성화의 전체 복용량 응답 곡선의 설립을 설명 하는 첫 번째 연구. 접근은 필연적으로 표지 없는 세포 감시 접근의 사용을 요구하고 종점 실험에 적용되지 않을 것입니다.

이 프로토콜은 U-373 MG 세포의 예에서 입증되었으며, 이는 내생적으로 인간 히스타민 1 수용체(hHR1)를 발현하는데, 이는 세포의 임피던스가 지속적으로 기록되는 동안 그의 내인성 아고니스트 히스타민의 일련의 증가 농도로 자극된다. 길항제 연구에 대한 프로토콜의 적용가능성을 입증하기 위해, 실험은 hH1R에 대한 경쟁적 길항제인 디펜히드라민의 일정한 농도가 있는 상.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 세포 배양 및 실험 용액의 준비에 도움을 주셔서 바바라 고릭크와 나드자 힌터리터에게 감사드립니다. 저자는 감사하게도 연구 훈련 그룹에 의해 재정 지원을 인정 1910 "선택적 GPCR 리간드의 의약 화학" 보조금 번호에 따라 독일 연구 재단에 의해 자금 (DFG) 222125149. JAS는 특히 바이에른 남녀 평등 프로그램에 의해 부여된 장학금에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bü rker 계수실Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Germany)640210
세포 배양 플라스크 25 cm2Greiner bio-one (Frickenhausen, 독일)690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)\
Diphenhydramine hydrochlorideSigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)D3630
Eagle's Minimum Essential Medium, with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)D5671
임피던스 기기(ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc.(미국 뉴욕 트로이\
8웰 전극 어레이(8W1E PET)Applied BioPhysics Inc.(미국 뉴욕 트로이)\0.049mm2 작동 전극 및 ~50mm2 상대 전극(금)
96웰 전극 어레이(96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc.(트로이, 뉴욕, 미국)\0.256 mm2 총 전극 면적의 두 전극이 있는 PET 베이스
태아 송아지 혈청(FCS)바이오크롬(독일 베를린)S0615
히스타민 이염산염Carl Roth(독일 칼스루에)4017.1
층류 후드(Herasafe, KS 12)Thermo Scientific(독일 다름슈타트)51022515클래스 II 안전 캐비닛
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (다름슈타트, 독일)21083-027
L-글루타민Sigma Aldrich (Taufkirchen, 독일)G7513
마이크로피펫 대형 (100 - 1000 µ L)Brandt (Wertheim, Germany)704780
마이크로피펫 대형 (20 - 200 &마이크로; L)Brandt (Wertheim, Germany)704778
현미경 (위상차, Nikon Diaphot)Nikon (Dü 독일, 셀도르프)
페니실린/스트렙토마이신시그마 알드리치(독일, 타우프키르헨)P0781
인산염 완충 식염수(PBS)시그마 알드리치(독일, 타우프키르헨)D8537
피펫, 혈청학적Greiner bio-one(독일, 프리켄하우젠)607 180
피펫터(accu-jet pro)브란트(독일, 베르트하임)26300
TrypsinSigma Aldrich (Taufkirchen, 독일)1mM EDTA
튜브, 15 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, 독일)188 271
튜브, 50 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, 독일)210 261
U-373 MG 세포ATCC (Rockville, MD, USA)ATCC HTB-17
수조 (TW21)Julabo (Seelbach, 독일)\
)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

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