병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

요약

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

초록

프로테오메 내의 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 글로벌 프로필에 대한 평가는 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 관심이 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사슬에 통합된 유비퀴틴의 트립틱 소화 후 남은 디 글리신(-GG) 수정을 활용합니다. 이러한 토폴로지 특성 펩티드를 정량화함으로써 각 유비퀴틴 사슬 토폴로지의 상대적 풍부를 결정할 수 있다. 병렬 반응 모니터링 실험에 의해 이러한 펩티드를 정량화하는 데 필요한 단계는 유비퀴틴 사슬의 안정화를 고려하여 보고된다. 무거운 컨트롤, 세포 리시스 및 소화의 준비는 적절한 질량 분광계 설정 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 설명됩니다. 유비퀴틴 토폴로지에 대한 혼란을 가진 예제 데이터 세트가 제공되며 프로토콜의 최적화가 결과에 미치는 영향에 대한 예제가 함께 제공됩니다. 설명된 단계를 수행함으로써 사용자는 생물학적 맥락에서 유비퀴틴 토폴로지 환경에 대한 글로벌 평가를 수행할 수 있습니다.

서론

단백질 기능 과 안정성의 가까운 조절은 가장 중요 한 중요 한, 그들은 생물학의 phenotypic 제어의 주요 드라이버로. 단백질의 기능은 두 가지 구성 요소로 구성됩니다: 본질적인 폴리펩티드 서열 및 번역 후 변형(PTM). 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화^1을포함한 다양한 화학적 PTM이 확인되었다. 1975년, Goldstein^{외. 2는} 작은 단백질을 확인하고 유비쿼터스 특성으로 인해 유비퀴틴이라고 명명했습니다. 유비퀴틴은 단백질 분해^3에서중요한 것으로 나타났다. 그러나, 그 이후로 신호 분자로서의 유비퀴틴의 기능이 단백질 안정성조절을 훨씬 뛰어넘는 것으로 확립되었다. 유비퀴틴 시그널링은 단백질 안정화, 자가식, 세포 주기 제어 및 단백질 인신 매매^4와같은 광범위한 다른 생물학적 기능에 관여한다.

다른 PtM은 일반적으로 이진 (즉, 단백질은 변형되거나 수정되지 않은 상태로 방치됨)이지만, 유비퀴틴은 단량제 또는 폴리머 체인으로 단백질을 수정할 수 있으며, 부착된 유비퀴틴 자체가 유비퀴티드화된다. 또한, 이러한 폴리비비퀴티닝 체인은 8개의 연계

프로토콜

1. 무거운 펩타이드 표준의 준비

1. 공급 업체및 구입 한 무거운 펩 티드의 품질에 따라, 무거운 펩 티드 희석 될 필요가 있을 것 이다. 이 프로토콜은 표 1에서보고된 펩티드 서열을 사용했으며, C-말단 아미노산은 리신(13 C₆¹⁵N_2-lysine)또는 아르기닌(13 C₆¹⁵N_{4-아르기닌)으로}변형되었다.
   1. 무거운 펩티드를 혼합하여 50% 아세토닐릴(ACN)으로 혼합하여 10μM에서 각 펩타이드와 펩타이드 믹스를 만듭니다.
   2. 펩티드 믹스의 알리쿼트를 만들고 -80°C에 보관하십시오.

2. 샘플 준비

1. 샘플 리시스
   참고: 유비퀴틴 체인의 안정성은 시료 준비 중에 고려해야 합니다. 생물학적 샘플과 버퍼를 4°C에서 냉각시키고 가능한 한 빨리 유비퀴틴 안정화 버퍼에 샘플을 추가합니다.
   1. 1M NH₄HCO_{3(중탄산암암염)} 용액을 물에 준비하고 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정....

결과

PRM에 의한 유비퀴틴 사슬 분석의 사용을 입증하기 위해 마우스 흑색종 세포주 B16, 및 2개의 일반적인 인간 세포주 A549(아데노카르시노믹 폐포기 기저 상피세포) 및 HeLa(자궁 경부암세포)를 3개의 세포주를 선택하였다. 이러한 배양은 수확 하기 전에 4 시간 동안 0, 10, 또는 100 mM MG-132로 처리되기 전에 적절한 매체에서 중간 기하 단계로 성장했다. MG-132는^{프로테좀(14)에}의한 유비퀴틴-컨쥬게이트 단백질의 분해를 방지하는 프로테좀 억제제이다. 이러한 점을 감안할 때, 유비퀴틴 연쇄 분석을 입증하는 적절한 테스트 조건입니다. K48 체인의 증가는 그림 3에서볼 수 있다. 프로테모솜 억제제 치료는 K48^{사슬(15)의}증가를 유도했다.

소개에 설명된 바와 같이, SRM 또는 MRM과 달리, PRM은 전구체 이온을 선택한.......

토론

프로테오메 내의 유비퀴틴 상태의 분석은 다양한 생물학적 질문에 대한 중요성을 증가시고 있다. 샘플의 유비쿼터티션 상태에 대한 설명은 단백질의 프로파일뿐만 아니라 이러한 유비쿼터티화의 토폴로지에도 초점을 맞추어야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 표적 MS에 의한 이 토폴로지의 평가는, 생물학 조사의 넓은 범위에 있는 역할이 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜이 전역 토폴로지 프로필을 제공한다는 것을 이해해야 합니다. 상향식 프로테오믹스 접근법을 사용하면 유비퀴틴 펩타이드를 포함하여 유비퀴티나이드된 펩타이드의 판정을 가능하게 한다. 유비퀴틴 펩티드의 유비퀴티옹의 관찰은 사슬 토폴로지의 결정을 허용하지만, 유비퀴틴의 표적에 대한 링크는 손실된다. 따라서, 주어진 단백질에 대한 특정 사슬 토폴로지는 결정할 수 없지만 글로벌 토폴로지 프로파일이 도출된다. 이 방법을 더 많은 표적 결과를 제공하기 위해 농축 전략과 결합될 수도 있습니다. 이러한 농축은 체인 안정성과 체인 포스트 농축의 풍요.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴(ACN)	Merck	100029
Ammonium bicarbonate(ABC)	Fluka	9830
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA)	Sigma	22790
Eppendorf LoBind	Eppendorf	22431081
Formic acid (FA)	Thermo Fisher Scientific	85178
헤비 펩타이	JPT 펩타이드 기술
HPLC	Dionex	Ulitimate 3000
LC 컬럼	Thermo Fisher Scientific	160321
Lys C	Wako	125-05061
질량 분석기	Thermo Fisher Scientific	Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide(NEM)	ACROS Organics	156100050
양성 대조 사슬 K48	Boston Biochem	UC-240
양성 대조 사슬 K63	Boston Biochem	UC-340-100
양성 대조 사슬 M1	Boston Biochem	UC-710B-025
수산화나트륨 (NaOH)	Sigma	S5881
소네트	Branson 소닉	SFX 150
써모믹서	Eppendorf	Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigam	T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific	77720
Trypsin	Promega	V1511A
Urea	Sigma	51456
Waters μ 용리 C18 플레이트	Waters	186002318

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